牦牛Y染色体PCR扩增产物的克隆和测序
牦牛DRA基因克隆测序及生物信息学分析
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用Chelex-100法大规模快速提取牦牛肌肉中基因组DNA
用Chelex-100法大规模快速提取牦牛肌肉中基因组DNA 周凡莉;黄林;金素钰;郑玉才【摘要】旨在建立快速、大规模提取牦牛(Bos grunniens)肌肉中基因组DNA的方法.试验样品为冰冻保存的九龙牦牛背最长肌(n=10).采用两种取样方法(镊子取样和枪头取样)采集冰冻的肌肉样品,用Chelex-100方法提取其中的基因组DNA,并进行PCR扩增.结果显示,镊子取样和枪头取样提取的基因组DNA,均可用于两个核基因和一个线粒体基因的PCR扩增,但枪头取样简便易行,提取的DNA用PCR 扩增细胞色素b,扩增35个循环数的PCR产物可直接测序.表明Chelex-100法可用于快速提取牦牛肌肉中基因组DNA,操作简单,成本低廉,适用于大规模提取组织中的DNA.【期刊名称】《西南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(044)004【总页数】5页(P347-351)【关键词】Chelex-100法;肌肉;基因组DNA;牦牛【作者】周凡莉;黄林;金素钰;郑玉才【作者单位】西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041【正文语种】中文【中图分类】Q52;S823动物基因组DNA提取方法包括十二烷基磺酸钠(SDS)法、酚-氯仿抽提法、碱裂解法、试剂盒提取法等[1].其中酚-氯仿抽提取法实验过程复杂、耗时，容易产生交叉污染，使用有害试剂；而试剂盒法操作过程较多，大规模使用成本较高；Chelex-100法近年来被广泛使用，适应于微量样品提取DNA[2-3].Chelex-100树脂可去除样品和缓冲液中的金属离子，防止DNA降解，操作简便，已用于血液、乳、蚊虫附肢、眼角膜、肝脏和肌肉、口腔黏膜细胞等生物材料提取基因组DNA[4-9].用Chelex-100法提取DNA的全部过程在同一个EP管中进行，污染机会少，检材损失小，适用于微量生物样品的DNA提取，虽然提取的DNA纯度不高，但作为PCR反应模板制备方法具有很大的优势[10].肌肉组织是常见的实验材料.本研究尝试建立用Chelex-100法快速提取牦牛肌肉中基因组DNA，以便为开展大规模的分子遗传学研究提供材料.1 材料与方法1.1 样品的采集与处理九龙牦牛背最长肌采自四川省甘孜州的九龙县.在冬季牦牛屠宰时，采集背最长肌，迅速冰冻后用冰瓶带回实验室，-80℃保存至分析.样品分析时已经在该条件下保存长达9年.本研究取10个背最长肌样品进行试验.1.2 肉中基因组DNA的提取参考Amills等提取乳样DNA的方法[11]提取肌肉中基因组DNA.主要步骤如下：1.5 mL的EP管中加入100 μL 的 5%Chelex-100和2 μL 的 20 mg/mL 新鲜蛋白酶K，加入肌肉组织，涡旋10 s；56℃金属浴孵育30 min；保温结束后于100℃沸水浴变性8 min，迅速置于冰上冷却3 min；涡旋10 s，8000 g离心1 min，上清液分装备用，-20℃保存.本研究中试验的肌肉保持冰冻状态，采取两种方法取样.方法一(镊子取样)：用干净的镊子，迅速取小米粒大小的肌肉；方法二(枪头取样)：采用倾斜修剪的200 μL枪头，迅速插取肌肉，该方法在枪头上并未见明显的肌肉组织.1.3 PCR引物的设计用PCR扩增核基因和线粒体基因.根据GenBank数据库中普通牛的Prdm 9(登录号：KJ020105)，利用Primer Premier 5.0软件设计Prdm 9基因的PCR引物.扩增牦牛Cytb和CSN2基因分别参考胡强等[12]和McLachlan[13]研究中的引物.3个基因的引物序列和预期扩增长度等信息见表1.引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成.表1 PCR引物信息Table 1 The information of PCR primers基因引物序列(5′-3′) 退火温度/℃ 扩增长度/bp Prdm9 F：CCAGCACAAGCCAGAAACCGAATC R：TGTCTTAGTTGCAGCATGTGGGAGC 66 893 Cytb F：TACCATGAGGACAAATATCATTCTG R：CCTCCTAGTTTGTTAGGGATTGATCG 55 472 CSN2 F：CCTTCTTTCCAGGATGAACTCCAGG R：GAGTAAGAGGAGGGATGTTTTGTGGGAGGCTCT 66 2981.4 PCR扩增与检测Prdm9、Cytb和CSN2基因的PCR扩增反应体系(25.5 μL)：金牌Mix(Green)22 μL，DNA 模板1.5 μL，上、下游引物各1 μL.PCR扩增条件：98℃预变性3 min；98 ℃变性30 s；退火(温度见表1)30 s；72 ℃延伸(3个基因依次为40 s、15 s、10 s)，共计35个循环；72℃延伸5 min.PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测.1.5 PCR产物的测序与分析为验证PCR产物可用于后续研究，将Cytb基因的PCR产物送上海生工生物公司进行正向测序，利用DNAman软件与普通牛(登录号：AY885283)和普通牦牛(登录号：KM280686)序列进行比对.2 结果2.1 镊子取样提取肉中基因组DNA的PCR扩增牦牛肌肉样品用镊子取样后提取基因组DNA，PCR扩增CSN2、Cytb和Prdm9基因，发现3个基因的PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上均显示出单一的清晰条带，分子量大小与预期片段大小吻合(图1).3个基因的扩增效果均存在样品个体差异，如牦牛Cytb基因扩增产物的电泳条带的亮度存在较明显的个体差异(图2).2.2 枪头取样提取肉中基因组DNA的PCR扩增牦牛肌肉样品用枪头取样后提取基因组DNA，PCR扩增Cytb基因，PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上均显示出单一的清晰条带，分子量大小与预期片段大小吻合.PCR循环数与扩增效果有关，大部分样品PCR扩增35个循环的产物可用于直接测序(图3).图1 九龙牦牛CSN2、Cytb和Prdm9基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳1-3：CSN2、Cytb和 Prdm9 基因；M：DNA Marker 2000.Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the PCR products of CSN2，Cytb and Prdm9 genes of Jiulong yak图2 九龙牦牛Cytb基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳1-7：Cytb基因；M：DNA Marker2000.Fig.2 Agarose gel electrophoresis of the PCR products of Cytb gene of Jiulong yak图3 九龙牦牛Cytb基因不同循环数的PCR产物琼脂糖凝胶电泳1-3：45 个循环；4-6：35 个循环；M：DNA Marker 2000.Fig.3 Agarose gel electrophoresisof the PCR products of Cytb gene in Jiulong yak with different cycles2.3 PCR扩增产物的直接测序对九龙牦牛Cytb基因的PCR产物进行正向测序，结果与数据库中的普通牦牛(登录号：KM280686)、普通牛(登录号：AY885283)序列进行比对，发现九龙牦牛与普通牛的序列存在差异，但与普通牦牛的序列高度一致(图4).说明用Chelex-100法提取的牦牛肌肉中基因组DNA，PCR扩增的产物可直接测序，并获得正确的序列.图4 九龙牦牛、普通牦牛和普通牛的Cytb基因序列信息比对Fig.4 Sequence alignments of Cytb gene of Jiulong yak，yak and cattle3 讨论近年来Chelex树脂越来越多地应用于提取动物基因组DNA，国内外均有不少报道[3，14].Algriw等研究表明，Chelex-100和试剂盒均适用于提取肝脏和肌肉基因组DNA，且Chelex-100方法提取的产量更高.Chelex-100法是一种廉价、快速、有效的提取DNA的技术[11]，本试验用该方法提取肌肉中的基因组DNA，整个过程只需要约30 min，而Cytb基因的PCR产物序列与普通牦牛、普通牛序列信息比对(图4)，证明了Chelex-100法提取的基因组DNA的完整性，说明该方法适用于快速提取肌肉组织的DNA，并且对后续实验无影响.提取肌肉等组织DNA时，一般先定量取样并匀浆，再进行后续提取实验[15].这种方式用于大规模提取DNA时，工作量大且费时长.大规模提取肌肉组织DNA时，用镊子取样工作量大，增加交叉污染的可能.本研究采用的枪头取样简单易行，无交叉污染，适用于大规模取样，并且是在样品冰冻条件下进行.本研究比较了冰冻肌肉样品的两种取样方法，扩增2个核基因和1个线粒体基因，产物长度约300 bp～900 bp，均获得了正确的结果.不足之处在于两种取样方法均无法准确定量，尤其是枪头取样更难以控制取样量，这导致PCR产物的电泳条带亮度有个体差异. 对于没有准确称量的组织样品，Chelex-100法提取微量的DNA作为模板进行PCR扩增，需要适当调整循环数.本试验中枪头取样提取的DNA作为模板进行PCR扩增时，35个循环后一些样品扩增产物浓度不是特别高，可能不能用于直接测序，需要适当增加循环数，这与Amills等从乳中提取DNA进行PCR的研究结果一致[11].本研究表明，可用修剪后的一次性枪头对冰冻肌肉进行取样，采用Chelex-100法快速、大规模提取牦牛肌肉中的基因组DNA，用于PCR扩增和后续的研究.参考文献【相关文献】[1]周丽，李飞，魏刚.动物DNA提取方法概述[J].畜牧与兽医，2008，40(3)：66-68.[2]常瑞刚，刘丽霞.八眉猪基因组DNA提取方法比较[J].浙江农业科学，2017，58(4)：711-711.[3]徐可成，董跃丽，杨子祥，等.Chelex-100法提取甘薯小象甲DNA及云南地区甘薯小象甲的分子鉴定[J].植物保护，2017，43(3)：154-159.[4]WINGBERG G.A rapid method for preparing DNA from blood，suited for PCR screening of transgenes in mice[J].PCR Methods and Applications，1991，1(1)：72-74.[5]PINGCUO S，GAO J，JIANG ZR，et al.Duplication polymorphisms in exon 4 of κ-casein gene in three yak breeds/populations[J].Genetics and Molecular Research，2015，14(3)：10242-10248.[6]闫振天，司风玲，鲜鹏杰，等.基于Chelex-100和蛋白酶K的蚊虫足样本DNA提取技术[J].重庆师范大学学报(自然科学版)，2017，34(5)：26-31.[7]IOVIENO A，MILLER D，LONNEN J，et al.Extraction of Acanthamoeba DNA by use of Chelex resin[J].Journal of Clinical Microbiology，2011，49(1)：476.[8]ALGRIW H 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[15]陈珉，张恩迪.獐不同组织材料DNA提取的有效方法[J].四川动物，2006，25(3)：481-484.。
牦牛源致病性大肠埃希菌PCR检测方法的建立
司）、DYCP31DN型电泳仪（北京市六一仪器厂）、 JPT-1架盘药物天平（福州天平仪器厂）、MG25 +型 基因扩增仪（杭州朗基科学仪器有限公司）、YXQSG46-280手提式轧电两用高压蒸汽灭菌器（丹东市 日用 五金 厂）、Mini spin小 型 离 心 机（德 国 Eppendorf公司）、QUANTUM ST4型凝胶成像分 析系统（法国Vi\er公司）% Tag DNA聚合酶（生 产编号：DR001A）、琼脂糖（生产编号:D601）购自宝 生物工程（大连）有限公司，DL2000 DNA Marker, 细菌基因组DNA提取试剂盒（DP302-02）购自天根 生化科技（北京）有限公司，琼脂粉、TAE电泳液、漠 化乙锭（EB）贮存液、PCR试剂（Tap-plus酶）、 dNTP、PCR buffer等购于上海生工生物工程有限 公司，所有引物均由上海生工生物工程有限公司 合成% 1.1.9 实验动物
1材料与方法
1.1材料 1.1.1 培养基
伊红美蓝琼脂、普通肉汤、普通营养琼脂、生化 反应培养基均购于生工生物工程（上海）股份有限 公司％ 1. 1. 2 菌株
致病性大肠埃希菌标准株（83915）、产气杆菌、 克雷伯菌、变形杆菌、普通大肠埃希菌（分离株）、鼠 伤寒沙门菌SL1344株，均由青海大学农牧学院 提供％ 1. 1. 3 主要器材及试剂
实验动物为医用豚鼠，来源于济南金丰实验动 物有限公司，许可证号：SCXK（鲁）20140006% 1.2方法 1.2.1 样U采集
选择青海省天峻县腹泻犊耗牛，用灭菌盐水浸 湿的无菌棉签蘸取直肠内粪样，共取100份粪便样 品，分别放入灭菌小试管内，标记备用％ 1.2.2 细菌分离培养
将采集粪样放入营养肉汤中进行增菌培养 18〜29 h后，充分振荡，用接种环蘸取悬浮液1〜 2环接种到伊红美蓝琼脂平板培养基上，在37 =温 箱中培养18〜29 h% 1.2.3 致病性实验
美仁牦牛MYL9基因克隆、生物信息学分析及组织表达研究
中国畜牧兽医 2024,51(4):1410-1419C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c i n e 美仁牦牛M Y L 9基因克隆㊁生物信息学分析及组织表达研究马 荣1,2,喇永福2,包鹏甲2,郭 宪2,路建卫3,扎 老3,赵 雪4,梁春年1,2,成述儒1(1.甘肃农业大学,兰州730070;2.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,甘肃省牦牛繁育工程重点实验室,农业农村部青藏高原畜禽遗传资源育种重点实验室,兰州730050;3.合作市佐盖多玛乡畜牧站,合作747000;4.合作市农畜产品质量安全检测检验中心,合作747000)摘 要:ʌ目的ɔ克隆美仁牦牛肌球蛋白轻链9(m y o s i n l i g h t c h a i n 9,MY L 9)基因C D S 区并对其进行生物信息学分析,检测M Y L 9基因的组织表达特征,为探究该基因功能提供一定理论依据㊂ʌ方法ɔ以美仁牦牛肌肉组织c D N A为模板,利用P C R 扩增并克隆美仁牦牛C D S 区序列,与其他物种进行相似性比对及系统进化树构建;通过在线软件对MY L 9蛋白进行生物信息学分析,利用实时荧光定量P C R 检测M Y L 9基因在美仁牦牛心脏㊁肝脏㊁脾脏㊁肺脏㊁肾脏㊁肌肉㊁脂肪和睾丸组织中表达情况㊂ʌ结果ɔ美仁牦牛M Y L 9基因C D S 区长516b p ,共编码171个氨基酸㊂系统进化树结果显示,美仁牦牛与野牦牛㊁普通牛亲缘关系最近,与高山倭蛙亲缘关系最远㊂MY L 9蛋白分子式为C 858H 1324N 234O 274S 12,原子数为2702,理论等电点为4.85,不稳定系数和总平均亲水性分别为37.22和―0.772,属于稳定亲水性蛋白㊂MY L 9蛋白无信号肽和跨膜螺旋结构,属于非分泌性蛋白;主要定位于线粒体㊁细胞核㊁细胞质中,具有17个特异性磷酸化位点㊂MY L 9蛋白二级结构主要由α-螺旋㊁无规则卷曲㊁β-折叠和延伸链构成,三级结构预测结果与二级结构一致㊂实时荧光定量P C R 结果显示,M Y L 9基因在美仁牦牛心脏㊁肝脏㊁脾脏㊁肺脏㊁肾脏㊁肌肉㊁脂肪和睾丸组织中均表达,且肝脏和肌肉组织中表达量显著高于其他组织(P <0.05)㊂ʌ结论ɔ本研究成功克隆美仁牦牛M Y L9基因C D S 区,探究了M Y L 9基因的生物学功能及组织表达特征,研究结果为进一步探究牦牛M Y L 9基因功能特征提供了参考㊂关键词:美仁牦牛;M Y L 9基因;克隆;生物信息学;组织表达中图分类号:S 823.8+5文献标识码:AD o i :10.16431/j.c n k i .1671-7236.2024.04.009 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2023-10-07基金项目:合作市牦牛种质提升与提质增效项目;现代肉牛牦牛产业技术体系(C A R S -37);甘肃省基础研究创新群体项目(20J R 5R A 580);甘肃省科技重大专项(21Z D 10N A 001,G Z G G -2021-1);中国农业科学院创新工程(25-L I H P S -01)联系方式:马荣,E -m a i l :m a r o n g 202017@q q .c o m ㊂通信作者梁春年,E -m a i l :c h u n n i a n 2006@163.c o m ;成述儒,E -m a i l :c h e n gs r @g s a u .e d u .c n C l o n i n g ,B i o i n f o r m a t i c sA n a l y s i s a n dT i s s u eE x pr e s s i o no f M Y L 9G e n e i n M e i r e nY a k MA R o n g 1,2,L A Y o n g f u 2,B A OP e n g ji a 2,G U O X i a n 2,L UJ i a n w e i 3,Z H A L a o 3,Z H A O X u e 4,L I A N GC h u n n i a n 1,2,C H E N GS h u r u1(1.G a n s uA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,L a n z h o u 730070,C h i n a ;2.K e y L a b o r a t o r y o f An i m a l G e n e t i c s a n dB r e e d i n g o nT i b e t a nP l a t e a u ,M i n i s t r y o f A g r i c u l t u r e a n dR u r a lA f fa i r s ,K e y L ab o r a t o r y o f Y a kB r e e d i n g E n g i n e e r i n g o f G a n s uP r o v i nc e ,L a n z h o u I n s t i t u t e o f H u s b a nd r y a n dP h a r m a ce u t i c a lS c i e n c e s of C h i n e s eA c a d e m y o f Ag r i c u l t u r a lS c i e n c e s ,L a n zh o u 730050,C hi n a ;3.A n i m a lH u s b a n d r y S t a t i o no f Z o g a i d o m aT o w n s h i p ,H e z u o 747000,C h i n a ;4.Q u a l i t y a n dS a f e t y I n s p e c t i o nC e n t e r o f A gr i c u l t u r a l a n d L i v e s t o c kP r o d u c t s i n H e z u o ,H e z u o 747000,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔT h eo b j e c t i v eo f t h i se x p e r i m e n tw a s t oc l o n et h eC D Sr e g i o no fm yo s i n4期马荣等:美仁牦牛M Y L9基因克隆㊁生物信息学分析及组织表达研究l i g h t c h a i n9(MY L9)g e n e i n M e i r e n y a ka n d p e r f o r m b i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i s,a n dd e t e c t t h e t i s s u e e x p r e s s i o n c h a r a c t e r i s t i c s o f M Y L9g e n e,s oa s t o p r o v i d ea t h e o r e t i c a l b a s i s f o r e x p l o r i n g t h e f u n c t i o no f t h i s g e n e.ʌM e t h o dɔU s i n g t h ec D N A o fM e i r e n y a k m u s c l e t i s s u ea s t e m p l a t e, P C R w a s u s e d t o a m p l i f y a n d c l o n e t h eC D S r e g i o n s e q u e n c e o fM e i r e n y a k,s i m i l a r i t y c o m p a r i s o n w i t ho t h e r s p e c i e sa n d p h y l o g e n e t i c t r e ec o n s t r u c t i o nw e r ec a r r i e do u t.B i o i n f o r m a t i ca n a l y s i so f MY L9p r o t e i nw a s p e r f o r m e db y o n l i n es o f t w a r e.T h ee x p r e s s i o no f M Y L9g e n e i nh e a r t,l i v e r, s p l e e n,l u n g,k i d n e y,m u s c l e,f a t a n dt e s t i so fM e i l e n y a k w a sd e t e c t e db y R e a l-t i m e q u a n t i t a t i v e P C R.ʌR e s u l tɔT h eC D Sr e g i o no f M Y L9g e n e i n M e i r e n y a k w a s516b p,e n c o d i n g171a m i n o a c i d s.P h y l o g e n e t i c t r e e r e s u l t s s h o w e d t h a tM e i r e n y a kh a d t h e c l o s e s t g e n e t i c r e l a t i o n s h i p w i t h B o sm u t u s a n d B o s t a u r u s,a n dt h ef a r t h e s t g e n e t i cr e l a t i o n s h i p w i t h N a n o r a n a p a r k e r i.T h e m o l e c u l a r f o r m u l ao f t h e p r o t e i ne n c o d e db y t h e g e n ew a sC858H1324N234O274S12,t h en u m b e ro f a t o m sw a s2702,t h e t h e o r e t i c a l i s o e l e c t r i c p o i n tw a s4.85,a n d t h e i n s t a b i l i t y c o e f f i c i e n t a n d t h e t o t a l a v e r a g eh y d r o p h i l i c i t y w e r e37.22a n d―0.772,r e s p e c t i v e l y,w h i c h b e l o n g e dt os t a b l e h y d r o p h i l i c p r o t e i n.MY L9p r o t e i n w a s a n o n-s e c r e t e d p r o t e i n w i t h o u t s i g n a l p e p t i d e a n d t r a n s m e m b r a n eh e l i xs t r u c t u r e.I tw a sm a i n l y l o c a l i z e d i n m i t o c h o n d r i a,n u c l e u sa n dc y t o p l a s m, a n dh a d17s p e c i f i c p h o s p h o r y l a t i o n s i t e s.T h e s e c o n d a r y s t r u c t u r eo fMY L9p r o t e i nw a sm a i n l y c o m p o s e do fa l p h ah e l i x,r a n d o m c o i l,b e t at u r na n de x t e n d e dc h a i n,a n dt h e p r e d i c t e dt e r t i a r y s t r u c t u r ew a s c o n s i s t e n tw i t h t h e s e c o n d a r y s t r u c t u r e.R e a l-t i m e q u a n t i t a t i v eP C Rr e s u l t s s h o w e d t h a t M Y L9g e n ew a s e x p r e s s e d i nh e a r t,l i v e r,s p l e e n,l u n g,k i d n e y,m u s c l e,f a t a n d t e s t i s,a n d t h e e x p r e s s i o n l e v e l i n l i v e r a n dm u s c l ew a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t i n o t h e r t i s s u e s(P<0.05).ʌC o n c l u s i o nɔT h eC D Sr e g i o no f M Y L9g e n ei n M e i r e n y a k w a ss u c c e s s f u l l y c l o n e d,a n dt h e b i o l o g i c a l f u n c t i o na n d t i s s u e e x p r e s s i o n c h a r a c t e r i s t i c s o f M Y L9g e n ew e r e e x p l o r e d.T h e r e s u l t s p r o v i d e d a r e f e r e n c e f o r f u r t h e r r e s e a r c ho n t h e f u n c t i o n a l c h a r a c t e r i s t i c s o f M Y L9g e n e i n y a k. K e y w o r d s:M e i r e n y a k;M Y L9g e n e;c l o n i n g;b i o i n f o r m a t i c s;t i s s u e e x p r e s s i o n牦牛是一种主要分布在高山高原地区特有的优质畜种,具有耐粗和耐劳㊁抗逆性㊁抗病性和适应力强等特点[1]㊂它是高原地区人民主要的生产资料,牦牛肉具有低脂肪㊁低热量㊁氨基酸种类丰富且蛋白含量高的特点[2];牦牛乳中的蛋白质㊁脂肪酸㊁糖类㊁矿物质㊁干物质等营养成分含量普遍较高,被称为 天然浓缩乳 [3];其毛皮㊁粪便也在当地得到了充分的利用㊂美仁牦牛是生活在甘南地区的一种优良地方遗传资源[4],其肉质鲜美且产肉性能优于其他普通牦牛品种,故而在整个甘南以及周边地区享誉盛名[5]㊂肌球蛋白复合物在肌肉细胞中主要负责肌肉收缩,而且参与其他细胞的结构㊁运动㊁黏附以及细胞分裂等生理过程[6]㊂肌球蛋白重链主要参与其结构的核心,而肌球蛋白轻链则必须缠绕在重链上从而调节其稳定性和功能性的完善[7]㊂肌球蛋白轻链9 (m y o s i n l i g h t c h a i n9,MY L9)是肌球蛋白结构中调节其活性的轻链,作为一种肌动蛋白的分子马达,可催化A T P水解以促进肌动蛋白定向运动[8-9]㊂研究证明,MY L9蛋白受到轻链激酶和轻链磷酸酶双重调控从而发挥功能,通过局部磷酸化激活肌球蛋白的活性,完成肌丝运动组装,且此过程还伴随着细胞迁移的尾部收缩[10]㊂在有关人M Y L9基因的研究中发现,该基因第4外显子缺失导致胃肠道平滑肌收缩力不足,同时阻碍肌动蛋白和肌球蛋白的结合,表现出胃肠道和泌尿道平滑肌运动障碍等临床症状[11]㊂M Y L9基因还参与细胞增殖反应,MY L9蛋白是心肌素的相关转录因子(M R T F-A)的靶标位点,通过相关信号通路参与调节平滑肌细胞的增殖和形态变化[12]㊂MY L9蛋白与肌球蛋白重链9 (MY H9)等相关蛋白结合,加快形成放线菌素环,从而调控细胞分裂[13]㊂此外,在骨骼肌的生长发育过程中,M Y L9基因发挥的作用也是不可缺失的[14]㊂研究发现,小鼠胚胎M Y L9基因缺失,胚胎中的钙黏素随之减少导致胚胎死亡,说明该基因在正常小鼠胚胎细胞形成是必需的[15];M Y L9基因表达量变化会导致小鼠血管收缩性㊁血压稳定性及血管通透性发生改变[16-17]㊂目前有关M Y L9基因在牦牛上1141中国畜牧兽医51卷的研究报道较少㊂因此,本研究拟克隆美仁牦牛M Y L9基因C D S区,利用生物信息学在线软件分析预测其结构特征,并检测M Y L9基因在美仁牦牛不同组织中的表达差异,以期为今后深入研究M Y L9基因的功能提供一定的理论依据㊂1材料与方法1.1样品采集试验随机选取3头30月龄体格健壮的美仁牦牛(由甘肃省甘南藏族自治州合作市佐盖多玛乡提供),屠宰后迅速采集心脏㊁肝脏㊁脾脏㊁肺脏㊁肾脏㊁肌肉㊁脂肪和睾丸组织,于―80ħ保存备用㊂1.2主要试剂及仪器T r i z o l试剂㊁反转录试剂盒㊁实时荧光定量试剂盒㊁p M D19-T载体和大肠杆菌D H5α感受态细胞均购自宝生物工程(大连)有限公司;2ˑT a q P C R M i x (+D y e)㊁2ˑS Y B R G r e e nP r o T a q H sP r e m i x均购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司;D N A凝胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司㊂电泳仪D Y Y-6C购自北京六一生物科技有限公司;超微量分光光度计N a n o D r o p2000㊁P C R仪(P r oF l e x T M P C R)均购自西安基因有限公司;凝胶成像系统(T a n o n2500)购自上海天能科技有限公司㊂1.3引物设计与合成根据N C B I数据库中野牦牛M Y L9基因m R N A序列(G e n B a n k登录号:X M_005896018.2),确定其C D S区序列,利用P r i m e rP r e m i e r6.0软件和N C B I在线工具分别设计P C R扩增引物和实时荧光定量P C R引物,引物信息见表1㊂引物均由西安擎科生物技术有限公司合成㊂表1引物信息T a b l e1P r i m e r i n f o r m a t i o n基因G e n e s引物序列P r i m e r s e q u e n c e s(5'ң3')片段大小F r a g m e n t s i z e/b p退火温度A n n e a l i n g t e m p e r a t u r e/ħ用途A p p l i c a t i o n M Y L9F:C A G C C A A G A T G T C C A G T A52052C D S区扩增R:C C T A G T C A T C C T T G T C C T TM Y L9F:G G C C T C A A T G G G T T T C A T C C15753实时荧光定量P C R R:T T T G A G G A T G C G G G T G A A C TG A P DH F:A A T G A A A G G G C C A T C A C C A T C20453实时荧光定量P C RR:G T G G T T C A C G C C C A T C A C A1.4总R N A提取及c D N A合成取出适量―80ħ冻存的各组织样品,放入盛有液氮的研钵中进行研磨,在研磨过程中,少量多次添加液氮,确保研钵中有液氮存在,将研磨完成的样品装入1.5m L离心管中㊂使用T r i z o l法[9]提取总R N A,利用紫外光分光光度计检测样品浓度和纯度,计算D260n m/D280n m值(1.8~2.0),检验提取的R N A质量㊂以2μg R N A为模板,按照反转录试剂盒说明书将其反转录合成c D N A,―20ħ保存备用㊂1.5美仁牦牛M Y L9基因C D S区克隆以美仁牦牛肌肉组织c D N A为模板,利用P C R 扩增M Y L9基因C D S区㊂P C R反应体系25μL: c D N A2μL,2ˑT a q P C R M i x(+D y e)12.5μL,上㊁下游引物(10μm o L/L)各1μL,d d H2O8.5μL㊂P C R反应条件:94ħ预变性30s;98ħ变性10s, 52ħ退火30s,72ħ延伸1m i n,共35个循环; 72ħ延伸2m i n㊂P C R扩增产物使用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定㊂利用D N A回收试剂盒将目的片段纯化回收,并连接p M D19-T载体,连接产物转化大肠杆菌D H5α感受态细胞,涂布于含氨苄青霉素的L B固体培养基上,置于37ħ恒温培养箱12h㊂挑选阳性菌液提取质粒,并将其送西安擎科生物技术有限公司进行测序㊂1.6相似性比对及系统进化树构建使用D N A S t a r软件将美仁牦牛M Y L9基因序列推导成氨基酸序列,并从G e n B a n k中下载野牦牛(登录号:M X Q86771.1)㊁普通牛(登录号:N P_ 001068702.1)㊁马来穿山甲(登录号: K A I5940518.1)㊁非洲象(登录号:X P_003411740.1)㊁红冠鸨(登录号:N X E15072.1)㊁白尾海雕(登录号: K F P99200.1)㊁食蟹猴(登录号:X P_045250396.1)㊁小鼠(登录号:B A E35452.1)㊁恒河鳄(登录号:X P_ 019368611.1)及高山倭蛙(登录号:X P_018413187.1)的M Y L9基因氨基酸序列㊂利用M e g A l i g n和M e g a 11.0软件进行相似性对比和系统进化树构建㊂21414期马荣等:美仁牦牛M Y L9基因克隆㊁生物信息学分析及组织表达研究1.7生物信息学分析利用O R FF i n d e r在线工具对美仁牦牛M Y L9基因序列进行开放阅读框分析,通过N C B IB L A S T 在线软件对美仁牦牛与野牦牛㊁普通牛的M Y L9基因C D S序列进行对比㊂利用P r o t P a r a m㊁P r o t S c a l e㊁S i g n a l P4.1在线软件对美仁牦牛MY L9蛋白分别进行理化性质㊁亲/疏水性㊁信号肽分析;通过N e t P h o s3.1㊁T MHMM㊁P S O R TⅡ㊁S O P MA㊁S W I S S-MO D E L㊁S T R I N G10.5在线软件进行磷酸化位点㊁跨膜结构㊁亚细胞定位㊁二级结构㊁三级结构㊁蛋白互作网络预测㊂具体生物信息学分析在线工具见表2㊂表2生物信息学在线工具T a b l e2O n l i n e t o o l s f o r b i o i n f o r m a t i c s软件名称S o f t w a r en a m e网址W e b s i t e 功能预测F u n c t i o n p r e d i c t i o nO R FF i n d e r h t t p s:ʊw w w.n c b i.n l m.n i h.g o v/g o r f/g o r f.h t m l开放阅读框B L A S T h t t p s:ʊb l a s t.n c b i.n l m.n i h.g o v/碱基序列对比P r o t P a r a m h t t p s:ʊw e b.e x p a s y.o r g/p r o t p a r a m理化性质P r o t S c a l e h t t p s:ʊw e b.e x p a s y.o r g/p r o t s c a l e亲/疏水性S i g n a l P4.1h t t p:ʊw w w.d e t a i b i o.c o m/t o o l s/s i g n a l-p e p t i d e.h t m l信号肽N e t P h o s3.1h t t p:ʊw w w.c b s.d t u.d k/s e r v i c e s/N e t P h o s/磷酸化位点TMHMM h t t p s:ʊs e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/s e r v i c e s/TMHMM-2.0/跨膜结构P S O R TⅡh t t p s:ʊw w w.g e n s c r i p t.c o m/p s o r t.h t m l亚细胞定位S O P MA h t t p s:ʊn p s a-p r a b i.i b c p.f r/c g i-b i n/n p s a_a u t o m a t.p l?p a g e=n p s a%20_s o p m a.h t m l二级结构S W I S S-MO D E L h t t p s:ʊs w i s s m o d e l.e x p a s y.o r g三级结构S T R I N G10.5h t t p s:ʊw w w.s t r i n g-d b.o r g/蛋白互作网络1.8实时荧光定量P C R检测美仁牦牛M Y L9基因组织表达特征使用实时荧光定量P C R方法检测M Y L9基因在牦牛各组织(心脏㊁肝脏㊁脾脏㊁肺脏㊁肾脏㊁肌肉㊁脂肪和睾丸组织)中的表达情况㊂P C R反应体系20μL:c D N A1μL,2ˑS Y B R G r e e nP r o T a q H s P r e m i x10μL,上㊁下游引物(10μm o L/L)各0.4μL,d d H2O8.2μL㊂P C R反应条件:95ħ预变性30s;95ħ变性5s,53ħ退火30s,65ħ延伸5s,共45个循环;95ħ延伸5s㊂试验设置3个重复,以G A P DH为内参基因,运用2―ΔΔC t法[10]计算目的基因的相对表达量㊂1.9数据统计分析试验数据使用G r a p h P a dP r i m9.5软件作图,并进行单因素方差分析和T u r k e y法多重比较,结果以平均值ʃ标准误表示,P<0.05表示差异显著㊂2结果2.1美仁牦牛M Y L9基因C D S区克隆P C R扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示,扩增条带单一,大小为520b p(图1),与预期片段一致㊂测序结果表明,克隆获得的美仁牦牛M Y L9基因C D S区序列为516b p,其中A T和C G 含量分别为42.69%和57.31%,可用于后续分析㊂图1美仁牦牛M Y L9基因P C R扩增电泳图F i g.1P C Ra m p l i f i c a t i o n e l e c t r o p h e r o g r a mo f M Y L9g e n e i n M e i r e n y a k2.2相似性比对及系统进化树构建相似性比对结果显示,美仁牦牛M Y L9基因氨基酸序列与野牦牛㊁普通牛㊁马来穿山甲㊁非洲象㊁红冠鸨㊁白尾海雕㊁食蟹猴㊁小鼠㊁恒河鳄㊁高山倭蛙相似性分别为98.8%㊁98.8%㊁98.2%㊁98.2%㊁97.7%㊁97.7%㊁97.1%㊁97.1%㊁96.5%㊁95.9%(图2)㊂系统进化树结果显示,美仁牦牛与野牦牛㊁普通牛亲缘关系最近,与高山倭蛙亲缘关系最远(图3)㊂3141中 国 畜 牧 兽 医51卷图2 不同物种M Y L 9基因氨基酸序列相似性比对F i g .2 S i m i l a r i t y a l i g n m e n t o f a m i n o a c i d s e q u e n c e o f M Y L 9g e n e a m o n g d i f f e r e n t s pe c i es 图3 不同物种间M Y L 9基因系统进化树F i g .3 P h y l o g e n e t i ct r e e o f M Y L 9g e n e a m o n g d i f f e r e n t s pe c i e s 2.3 生物信息学分析2.3.1 C D S 区序列分析 利用N C B I 在线软件O R FF i n d e r 进行开放阅读框分析,结果显示,美仁牦牛M Y L 9基因具有4个完整开放阅读框,其中C D S 区长516b p ,编码171个氨基酸(图4),与P C R 扩增结果相符㊂图4 美仁牦牛M Y L 9基因开放阅读框分析F i g .4 O p e n r e a d i n g f r a m e a n a l ys i s o f M Y L 9g e n e i nM e i r e n y a k 通过N C B I B L A S T 在线软件对美仁牦牛M Y L 9基因C D S 区与G e n B a n k 中野牦牛M Y L 9基因(登录号:X M _005896018.2)进行比对,结果显示野牦牛196~355b p 之间无碱基(图5A );与普通牛M Y L 9基因C D S 区序列(登录号:N M _001075234.1)进行对比分析,结果显示两者相似性达99.04%,其中部分碱基存在差异,分别为14G d e l ㊁224C>T ㊁239A>G ㊁287G>A ㊁296C >T (图5B )㊂图5 美仁牦牛与野牦牛(A )和普通牛(B )M Y L 9基因碱基序列比对分析F i g .5 C o m p a r a t i v e a n a l y s i s o f M Y L 9g e n e b a s e s e qu e n c e b e t w e e n M e i r e n y a k a n d B o s m u t u s (A )a n d B o s t a u r u s (B)41414期马 荣等:美仁牦牛M Y L 9基因克隆㊁生物信息学分析及组织表达研究2.3.2 理化性质和亲/疏水性分析 利用P r o t P a r a m 在线软件对美仁牦牛MY L 9蛋白进行理化性质分析,结果显示,MY L 9蛋白分子式为C 858H 1324N 234O 274S 12,分子质量为19.68608k u ㊂MY L 9蛋白由19种基本氨基酸组成(表3),其中谷氨酸(10.50%)㊁天冬氨酸(8.80%)比例较高,半胱氨酸(0.60%)比例最低㊂包含22个带正电荷的氨基酸残基(精氨酸+赖氨酸),33个带负电荷的氨基酸残基(天冬氨酸+谷氨酸)㊂蛋白理论等电点为4.85,不稳定指数为37.22,属稳定蛋白㊂利用P r o t S c a l e 在线软件预测美仁牦牛M Y L 9蛋白亲/疏水性,结果显示,该蛋白总平均亲水性为―0.772,属亲水性蛋白(图6)㊂表3 美仁牦牛M Y L 9蛋白氨基酸组成T a b l e 3 A m i n o a c i d c o m p o s i t i o no fM Y L 9p r o t e i n i n M e i r e n y a k 氨基酸A m i m o a c i d s 数量N u m b e r/个占比P r o po r t i o n /%氨基酸A m i m o a c i d s数量N u m b e r/个占比P r o po r t i o n /%丙氨酸A 1a (A )127.00亮氨酸L e u (L )95.30精氨酸A r g(R )95.30赖氨酸L y s (K )137.60天冬酰胺A s n (N )95.30甲硫氨酸M e t (M )116.40天冬氨酸A s p (D )158.80苯丙氨酸P h e (F )148.20谷氨酰胺G l n (Q )63.50脯氨酸P r o (P )63.50谷氨酸G 1u (E )1810.50丝氨酸S e r (S)74.10甘氨酸G 1y (G )116.40苏氨酸T h r (T )116.40组氨酸H i s (H )42.30酪氨酸T y r (Y )31.80异亮氨酸I 1e (I)84.70缬氨酸V a l (V )42.30半胱氨酸C ys (C )10.60图6 美仁牦牛M Y L 9蛋白亲/疏水性分析F i g .6 H y d r o p h i l i c i t y a n dh y d r o p h o b i c i t y a n a l y s i so f M Y L 9pr o t e i n i n M e i r e n y a k 2.3.3 信号肽㊁跨膜结构域及亚细胞定位预测 利用在线软件S i gn a l P4.1分析MY L 9蛋白信号肽,结果显示无信号肽(图7);利用T MHMM 在线工具预测蛋白跨膜结构发现,MY L 9蛋白无明显跨膜螺旋结构,跨膜螺旋氨基酸残基数量的期望值为0.01489,膜细胞质侧存在氨基酸总概率为0.56441(图8);利用P S O R TⅡ在线软件预测美仁牦牛MY L 9蛋白亚细胞定位,结果显示,该蛋白43.50%定位于线粒体,34.80%定位于细胞核,21.70%定位于细胞质㊂图7 美仁牦牛M Y L 9蛋白信号肽预测F i g .7 S i g n a l p e pt i d e p r e d i c t i o n o fM Y L 9p r o t e i n i nM e i r e n y a k 2.3.4 磷酸化位点预测 利用在线软件N e t P h o s 3.1预测蛋白磷酸化位点,结果显示,美仁牦牛MY L 9蛋白存在25个磷酸化位点,其中17个磷酸化位点具有特异性(7个丝氨酸(S )磷酸化位点,7个苏氨酸(T )磷酸化位点,3个酪氨酸(Y )磷酸化位点),8个磷酸化位点不具有特异性(图9)㊂2.3.5 二级结构和三级结构预测 利用在线软件S O P MA 对美仁牦牛MY L 9蛋白的二级结构进行预测,结果显示,该蛋白α-螺旋㊁无规则卷曲㊁β-折叠和延伸链的氨基酸数量分别为95㊁56㊁14和6个,占比分别为55.56%㊁32.75%㊁8.19%和3.51%(图10)㊂5141中 国 畜 牧 兽 医51卷利用S W I S S -M O D E L 在线软件预测蛋白三级结构,结果显示,全球模型质量估计(G M Q E )值为0.84,与模板的相似性为98.82%,三级结构预测结果与二级结构相符,均以α-螺旋和无规则卷曲为主(图11)㊂图8 美仁牦牛M Y L 9蛋白跨膜结构域预测F i g.8 T r a n s m e m b r a n ed o m a i n p r e d i c t i o no f M Y L 9p r o t e i n i n M e i r e n y ak图9 美仁牦牛M Y L 9蛋白磷酸化位点预测F i g .9 P h o s p h o r y l a t i o ns i t e p r e d i c t i o no f M Y L 9p r o t e i ni n M e i r e n y akh ,α-螺旋;t ,β-折叠;c ,无规则卷曲;e ,延伸链h ,A l p h ah e l i x ;t ,B e t a t u r n ;c ,R a n d o mc o i l ;e ,E x t e n d e d c h a i n 图10 美仁牦牛M Y L 9蛋白二级结构预测F i g .10 S e c o n d a r y s t r u c t u r e p r e d i c t i o no f M Y L 9p r o t e i ni n M e i r e n y ak图11 美仁牦牛M Y L 9蛋白三级结构预测F i g .11 T e r t i a r y s t r u c t u r e p r e d i c t i o no f M Y L 9p r o t e i ni n M e i r e n y a k2.3.6 蛋白互作网络分析 利用在线软件S T R I N G10.5预测蛋白互作网络,结果显示MY L 9蛋白与肌球蛋白轻链激酶(MY L K )㊁肌球蛋白轻链激酶3(MY L K 3)㊁MY L K 4㊁MY L 6㊁MY L 6B ㊁MY H 9㊁MY H 10㊁MY H 11㊁平滑肌α-肌动蛋白(A C T A 2)㊁蛋白磷酸酶P P 1(P P P 1C B )蛋白存在互作关系㊂互作网络共有11个节点和41条边,每个节点的平均度数为7.45,局部平均聚类系数为0.882(图12)㊂图12 美仁牦牛M Y L 9蛋白互作分析F i g .12 P r o t e i n i n t e r a c t i o nn e t w o r k a n a l y s i s o fM Y L 9p r o t e i n i n M e i r e n y a k2.4 美仁牦牛M Y L 9基因的组织表达特征分析实时荧光定量P C R 结果显示,M Y L 9基因在美仁牦牛心脏㊁肝脏㊁脾脏㊁肺脏㊁肾脏㊁肌肉㊁脂肪和睾丸组织中均有表达,其中肝脏和肌肉组织中表达量显著高于其他组织(P <0.05,图13)㊂61414期马 荣等:美仁牦牛M Y L 9基因克隆㊁生物信息学分析及组织表达研究肩标不同字母标注表示差异显著(P <0.05);肩标相同字母标注表示差异不显著(P >0.05)V a l u e s w i t h d i f f e r e n tl e t t e rs u p e r s c r i p t s m e a n s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e (P <0.05);W h i l e w i t h t h e s a m e l e t t e rs u p e r s c r i p t sm e a nn o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e (P >0.05)图13 美仁牦牛M Y L 9基因组织表达分析F i g .13 T i s s u e e x pr e s s i o no f M Y L 9g e n e i n M e i r e n y a k 3 讨 论MY L 9蛋白属于E F h -P E F 超家族一员,是一种具有保守结构域F R Q 1的免疫球蛋白[18]㊂本研究成功克隆美仁牦牛M Y L 9基因C D S 区序列,全长516b p ,编码171个氨基酸㊂相似性比对发现,美仁牦牛与野牦牛㊁普通牛㊁马来穿山甲等氨基酸序列相似性较高㊂系统进化树结果显示,美仁牦牛与野牦牛㊁普通牛亲缘关系最近,与高山倭蛙亲缘关系最远,表明美仁牦牛M Y L 9基因在进化过程中保守性强㊂MY L 9蛋白分子式为C 858H 1324N 234O 274S 12,编码的171个氨基酸中,谷氨酸含量最多,其中带正㊁负电荷的氨基酸残基数分别为22和33个,推测该蛋白可能带负电荷㊂通过在线软件分析发现,美仁牦牛MY L 9蛋白不存在信号肽和跨膜螺旋结构,为非分泌蛋白㊂与焦迪等[18]在陆川猪MY L 9蛋白上的研究结果一致㊂蛋白质修饰不仅影响蛋白活性及稳定性,且会对蛋白互作存在一定调节作用[19]㊂一般蛋白质修饰有磷酸化㊁甲基化㊁乙酰化等㊂本研究结果表明,美仁牦牛MY L 9蛋白存在特异性磷酸化位点共17个,其中有7个丝氨酸磷酸化位点㊁7个苏氨酸磷酸化位点㊁3个酪氨酸磷酸化位点㊂有研究证实MY L 9蛋白能在机体内发生α-氨甲基化(N α-m e t h y l )和α-氨乙酰化(N α-a c e t yl )修饰状态[20]㊂蛋白质三级结构模型符合二级结构预测,主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,间接证明该蛋白具有较强稳定性[21]㊂蛋白互作分析结果显示,牦牛MY L 9蛋白与MY L K ㊁MY L K 3㊁MY L K 4㊁MY L 6等蛋白可能存在互作关系㊂研究报道,在轻链激酶和轻链磷酸酶双重调控下MY L 9蛋白发挥一定功能[10],与预测互作蛋白结果相符合㊂研究证明,MY L 9蛋白通过MA L /S R F 复合物调节从而参与血小板生成和巨核细胞迁移的生理过程[22];在巨核细胞和血小板细胞中,MY L 9蛋白受R U N X 1转录因子的调控,而转录因子因突变产生的肌球蛋白磷酸化,会导致M Y L 9基因转录减少,血小板也随之减少,间接说明M Y L 9基因与先天性血小板减少症存在关系[23]㊂C D 69是一种白细胞活化标志物,细胞中血小板和MY L 9蛋白形成一个网状结构,在小鼠的发炎肺血管组织中大量检测到这种网状结构,表达C D 69的T 细胞连接到该网状结构,经过这个结构从而进入发炎组织进行免疫工作[24]㊂M Y L 9基因的表达与不同肿瘤中相关成纤维细胞㊁B 细胞㊁C D 8+T 细胞㊁C D 4+T 细胞㊁巨噬细胞㊁嗜中性粒细胞㊁树突状细胞的浸润及免疫标志物的表达显著相关,这间接证明MY L 9蛋白的功能机制涉及到免疫系统[25]㊂肝脏作为动物机体的主要器官,也具备淋巴组织的一些功能,同时也参与机体各类免疫应答[26]㊂有研究报道,肝脏组织中具有C D 8+T 细胞增殖的茧样 结构[27],这种 茧样 可以使T 细胞扩增50~100倍,从而放大其免疫功能[28]㊂本研究结果显示,M Y L 9基因在美仁牦牛各组织中均有表达,其中肝脏和肌肉组织中表达量显著高于其他各组织㊂推测M Y L 9基因在肝脏组织高表达可能也与此有关㊂MY L 9蛋白作为肌球蛋白复合物的轻链异构体,在牦牛肌肉组织中高表达也符合实际情况㊂研究发现,M Y L 9基因在肌肉组织中表达情况严重影响着机体细胞以及血管收缩性[16]㊂焦迪等[18]研究表明,猪背最长肌中的M Y L 9基因表达量与猪生长速度㊁肌肉生成速度成正比,推测牦牛M Y L 9基因在肌肉组织中的表达差异同样也可能会影响其生长速度㊂本研究初步探究了美仁牦牛M Y L 9基因序列结构和组织表达特征,为进一步研究牦牛M Y L 9基因相关工作提供一定理论依据和科学基础㊂4 结 论本研究成功克隆美仁牦牛M Y L 9基因C D S区,长度为516b p ,编码171个氨基酸,与野牦牛㊁普通牛亲缘关系最近,与高山倭蛙亲缘关系最远㊂美7141中国畜牧兽医51卷仁牦牛MY L9蛋白属于非分泌㊁稳定性亲水蛋白,主要定位于线粒体中㊂二级结构主要由α-螺旋㊁无规则卷曲㊁β-折叠和延伸链组成㊂M Y L9基因在肝脏和肌肉组织中表达水平显著高于其他组织㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1]朱国兴,张云玲.浅谈我国牦牛业生产现状及发展思路[J].中国畜牧杂志,2005,1:63-65.Z HU G X,Z HA N G Y L.P r o d u c t i o n s t a t u s a n dd e v e l o p m e n ti d e a s o f y a k i n d u s t r y i n C h i n a[J].C h i n e s e J o u r n a lo f A n i m a lS c i e n c e,2005,1:63-65.(i nC h i n e s e)[2]杨斌,陈峰,魏彦杰,等.牦牛肉加工与发展现状[J].肉类研究,2010,6:3-5.Y A N G B,C H E N F,W E I Y J,e t a l.T h e p r e s e n td e v e l o p m e n t a n d p r o c e s s i n g s i t u a t i o no f y a k[J].M e a tR e s e a r c h,2010,6:3-5.(i nC h i n e s e)[3]张蓝月,孙万成.牦牛乳制品研究进展[J].乳业科学与技术,2022,45(2):60-64.Z HA N GLY,S U N W C.P r o g r e s s i n t h e d e v e l o p m e n to f y a kd a i r yp r o d u c t s[J].J o u r n a l o f D a i r y S c i e n c ea n dT e c h n o l o g 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o m o t e ss t r o n gC D8+Tc e l l r e s p o n s e s[J].J o u r n a l o f I m m u n o l o g y,2014,193(4):1787-1798.[28] C R I S P E I N,P I E R C E R H.K i l l e r T c e l l s f i n dm e a n i n g f u le n c o u n t e r st h r o u g hi MA T E s[J].N a t u r eI m m u n o l o g y,2013,14(6):533-534.(责任编辑荣光辉)9141。
牦牛CAPN1基因的克隆与序列分析
ｃ Ｄ Ｎ Ａ ｓ 的克隆和测序， 并且已经获得了这种 ｃ ａ ｌ ｐ ａ ｉ ｎ蛋 白在组成和结构等方面的很多特性。 研究表明， ｃ ａ ｌ ｐ ａ ｉ ｎ对于肌原纤维的降解和肉在 μ 冷冻贮藏过程中的嫩化具有重要作用
［ ５ ～ ７ ］
，其大亚基
的编码基因 Ｃ Ａ Ｐ Ｎ １可作为影响肌肉嫩度的数量性状位
中图分类号 Ｑ ７ ８ ５ Ｃ ａ ｌ ｐ ａ ｉ ｎ 是一类特异性依钙激活的中性半胱氨酸内 肽酶， 其广泛地分布于绝大多数动物细胞中。其中 μ ｃ ａ ｌ ｐ ａ ｉ ｎ 是由微 摩 尔 钙 激 活 的 无 组 织 特 异 性 的 钙 蛋 白
１ ］ ２ ］ 酶。到目前为止， 科学家已经成功地在人类 ［ 、 鼠［ 、 ３ ］ ４ ］ 牛［ 、 猪［ 、 鸡和斑马鱼等物种上进行了 μ ｃ ａ ｌ ｐ ａ ｉ ｎ
部分后根据引物的先后顺序拼接得到 ２ ２ ６ ７ ｂ ｐ的片段， 经比对确为牦牛 Ｃ Ａ Ｐ Ｎ １基因序 列 （ Ｇ ｅ ｎ Ｂ ａ ｎ ｋ序 列 号： Ａ Ｆ ５ ６ ５ ８ １ ６ ） 其中 包 含 一 个 ２ １ ５ １ ｂ ｐ的 完 整 的 开 放 阅 读 ′ 和５ ′ 末端非编码区的部分序列（ ７ ７ ｂ ｐ和 框， 以及 ３ １ ６ ６ ｂ ｐ ） 。编码 区 序 列 与 已 知 的 Ｇ ｅ ｎ Ｂ ａ ｎ ｋ中 发 布 的 牛 Ａ Ｆ ２ ２ １ １ ２ ９ ） 的核苷酸同源性为 ９ ９ ． ３ ％， 共有 １ ４个核 （ 苷酸发生了突变。与猪、 人、 猕猴、 小鼠、 大鼠、 鸡、 鹌鹑 ９ ３ ． ９ ％ 、 ９ ０ ． ９ ％、 ９ １ ． ３ ％、 ８ ５ ． ５ ％、 的同 源 性 分 别 为： ８ ５ ． ５ ％、 ７ ２ ． ３ ％和 ７ １ ． ３ ％（ 表２ ） 。对核苷酸组成进行 分析表明 Ｇ＋ Ｃ的含量为 ６ ０ ． ０ ２ ％。
高中生物选修3专题3《胚胎工程》单元测试(一)
31.对进行胚胎移植的优点叙述错误的是( )A.充分发挥雌性优良个体的繁殖能力B.大大缩短了供体本身的繁殖周期C.经移植可得到多个后代D.胚胎移植可以提取药物2.下列能正确表示高等动物胚胎发育顺序的是( )A.受精卵→ 卵裂→囊胚→ 原肠胚→ 组织器官的分化B.卵→ 卵裂→ 原肠胚→组织器官分化C.受精卵→囊胚→ 原肠胚→幼体D.受精卵→ 桑椹胚→囊胚→ 原肠胚→组织器官的分化3.判断卵子是否受精的标志是( )A. 当卵黄膜和透明带的间隙可以观察到一个极体时B. 当卵黄膜和透明带的间隙可以观察到二个极体时C. 当卵黄膜和透明带的间隙可以观察到三个极体时D. 当卵黄膜和透明带的间隙中极体消失时4.胚胎干细胞的特点是( )A.在形态上，表现为体积大，细胞核大，核仁明显；在功能上具有发育的全能性B.在形态上，表现为体积小，细胞核大，核仁明显；在功能上具有发育的全能性C.在形态上，表现为体积小，细胞核小，核仁不明显；在功能上不具有发育的全能性D.在形态上，表现为体积大，细胞核小，核仁明显；在功能上具有发育的全能性5.下列不是精子、卵子发生的区别的是( )A.初级精母细胞、卵母细胞的形成时间B.M Ⅰ和MⅡ的时间连续性C.成熟生殖细胞是否经过变形D.成熟生殖细胞中染色体的数量6.下列有关动物胚胎移植的叙述中，错误的是( )A.受孕母畜体内的早期胚胎能够移植B.受体母畜必须处于与供体母畜同步发情的状态C.超数排卵技术要使用一定的激素D.试管婴儿的受精及胚胎发育过程在试管内完成7.杜泊羊具有生长快、肉质好等优点，科研工作者通过胚胎工程快速繁殖杜泊羊的流程如下图所示。
下列问题叙述不正确的是：( )A.获取杜泊羊的卵母细胞时，可对供体母羊注射促性腺激素，使其排出更多的卵子B.为保持精子与卵母细胞活性，采集到卵母细胞与精子后马上进行体外受精C.体外培养受精卵时，合成培养基中通常需提供CO2 以维持pH 值D.在胚胎移植前要对接受胚胎的当地普通绵羊进行同期发情处理8.下列关于胚胎移植的叙述不正确的是( )A.胚胎移植属于无性繁殖，大大缩短了供体本身的繁殖周期B.可以充分发挥雌性优良个体的繁殖能力C.供体的主要职能变为只产生具有优良遗传特性的胚胎D.胚胎移植时“冲卵”是指把胚胎从子宫冲洗出来9.模型是人们为了某种特定目的而对认识的对象所做的一种简化的概括性描述。
RT-PCR技术检测雄性牦牛生殖器官中TLRs基因表达水平-基因工程论文-生物学论文
RT-PCR技术检测雄性牦牛生殖器官中TLRs 基因表达水平-基因工程论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——哺乳动物雄性生殖系统各器官的炎症均可以引起机体生殖功能障碍，主要病理表现为抑制睾丸产生雄性激素、精子数目减少、活力降低、暂时性丧失生育能力及疼痛等[1].Toll样受体（Toll-like re-ceptors,TLRs）是存在于机体内的一类重要的模式识别受体（pattern recognition receptors,PRRs），通过识别多种病原相关分子模式（pathogen associatedmolecular patterns,PAMPs），例如脂多糖（lipopo-lysaccharide,LPS）、肽聚糖（peptidoglycan,PGN）、脂磷壁酸（lipoteichoic acid,LTA）等介导机体的天然免疫应答；该受体还能进一步通过信号传导启动获得性免疫应答，为天然免疫和获得性免疫之间架起了一座桥梁，从而促使机体免疫系统在抵抗病原体方面发挥重要作用。
目前发现，TLRs家族至少有13个成员，牛的组织中TLRs 包括TLR1~TLR10[2-5].TLRs主要表达于免疫系统的单核细胞系，同时也表达于其他组织的成纤维细胞、上皮细胞等。
最新研究证实，在人、大鼠、小鼠、猪和家兔等动物的生殖组织及细胞中均发现不同TLRs 的表达[6],推测TLRs在保护生殖系统免受病原体感染和降低炎症对生殖系统的损害方面发挥了重要作用。
牦牛（Bos grunniens）是青藏高原居民饲养的最重要的牲畜，也是藏族牧民重要的经济来源。
然而，高原型牦牛繁育率仅为27.76%~37.87%（平均为32.07%）[7],其原因除了营养的供应不均衡之外，是否与牦牛生殖系统抗感染能力相关，还需深入的研究。
为了解TLRs在牦牛生殖系统的表达情况并丰富牦牛生殖系统中先天性免疫功能基因的研究资料，本研究应用RT-PCR技术从牦牛脾组织中克隆TLR1~TLR10基因，并以雄性牦牛生殖器官为材料，通过RT-PCR技术检测雄性牦牛生殖器官（睾丸、附睾头、附睾体、附睾尾、输精管和）中TLR1~TLR10mRNA的表达水平。
牦牛gh基因多态性的pcrsscp分析
硕士学位论文
牦牛GH基因多态性的PCR-SSCP分析
姓名:***
申请学位级别:硕士
专业:动物生产系统与工程
指导教师:***
20090601
牦牛GH基因多态性的PCR-SSCP分析
4.会议论文刘峰.鲁双庆.李家乐.谢新民三种鳜生长激素基因差异的检测与分析2007
为探索鳜、大眼鳜、斑鳜生长性状差异与基因差异间联系,以三种鳜鱼野生群体为材料、采用PCR-SSCP分析及测序方法、对生长发育相关基因生长激素(GH)基因的差异进行了检测.在生长激素基因4个区域共检测到17个等位基因,其中13个等位基因为各群体特有等位基因.对各等位基因编码区的分析表明,斑鳜与鳜、大眼鳜间在第150位氨基酸位点存在差异,在该位点,斑鳜编码蛋氨酸(M),鳜.大眼鳜均编码亮氨酸(L).各区域等位基因共组合成9种GH基因型,三神鳜鱼间无共有基因型.GH基因Fst(遗传分化指数)值为0.8598,分化程度较高.遗传多样性分析显示,斑鳜GH基因遗传多样性高于鳜和大眼鳜.三种鳜鱼GH基因间,鳜与大眼鳜的相似度最高,鳜与斑鳜的相似度最低.实验结果为进一步利用GH基因差异进行鳜鱼育种奠定了基础.
6.期刊论文白晶晶.胡江.成述儒.王继卿.罗玉柱.BAI Jing-jing.HUJiang.CHENG Shu-ru.WANG Ji-qing.LUO Yu-
zhu牦牛GH基因多态性的PCR-SSCP分析-甘肃农业大学学报2010,45(1)
采用PCR-SSCP技术对天祝白牦牛和青海高原牦牛的生长激素基因(GH基因)5个外显子及部分内含子序列进行遗传变异分析,以探讨牦牛GH基因的遗传特性.结果表明:2个牦牛群体GH基因第1、第2和第4外显子无多态性,第3内含子1 694 bp处均发生T→C转换,形成A、B 2个等位基因,并检测到AA、AB和BB共3种基因型;天祝白牦牛第5外显子2 373 bp处发生G→T碱基颠换,形成C、D 2个等位基因,检测到CC和CD 2种基因型,但碱基改变并未引起氨基酸变化,因此这种碱基转换为沉默突变;天祝白牦牛和青海高原牦牛均为低度多态,经Hardy-Weinberg平衡检验2个牦牛群体均处于非平衡状态.
野牦牛(Bos grunniens mutus)mtDNA D-Loop区的遗传多样性
野牦牛(Bos grunniens mutus)mtDNA D-Loop区的遗传多样性马志杰;钟金城;韩建林;徐惊涛;窦全林;常怀普【摘要】为从分子水平上评价野牦牛(Bos grunniens mutus)的遗传多样性,对6头野牦公牛线粒体DNA D-loop 区全序列进行了克隆和测定(GenBank登录号为:FJ548840～FJ548845),结合GenBank中已刊登的2条野牦牛的相应序列,使用BioEdit 7 0 9、DnaSP 4.10.1、Arlequin 3.11等生物信息学软件,对全部8条序列开展了比对分析,确定了多态位点与单倍型数目,计算了核苷酸多样度和单倍型多样度.结果表明8条野牦牛线粒体DNA D-loop 区全序列长度在891～894 bp之间,其中A、T、G和C 4种核苷酸的平均含量分别为32.68%、28.65%、13.46%和25.21%,A+T的平均含量为61.33%.排除4处核苷酸的插入或缺失后,共检测到39处转换和颠换位点,占分析序列总长度的4.38%,其中包括4处单一多态位点和35处简约信息位点.依据序列间核苷酸变异共确定了7种单倍型,单倍型多样度(h)为0.9643,核苷酸多样度(π)为0.02144,提示野牦牛群体具有丰富的遗传多样性.【期刊名称】《生态学报》【年(卷),期】2009(029)009【总页数】6页(P4798-4803)【关键词】野牦牛;线粒体DNA;D-Loop区;遗传多样性【作者】马志杰;钟金城;韩建林;徐惊涛;窦全林;常怀普【作者单位】青海大学畜牧兽医科学院,西宁810016;西南民族大学生命科学与技术学院,成都610041;中国农业科学院-国际家畜研究所畜禽与牧草遗传资源联合实验室北京畜牧兽医研究所,北京100193;青海大学畜牧兽医科学院,西宁810016;青海大学农牧学院,西宁810003;西南大学生物技术学院,重庆400715【正文语种】中文【中图分类】Q145;Q958野牦牛(Bos grunniens mutus)隶属于牛科(Bovidae)牛亚科(Bovinae)，是青藏高原珍贵而特有的野生物种资源。
PCR检测牦牛肉掺伪技术研究现状和进展
食品科技PCR检测牦牛肉掺伪技术研究现状和进展赵雯玮1，王珊珊1，朱肖翔1，朱红波1，曹叶伟1，尹志娜2*（1.西藏自治区食品药品检验研究院，西藏拉萨 850000；2.广东药科大学，广东广州 510006）摘 要：牦牛生长于绿色无污染的高原环境，具有独特的食用和营养价值。
当前大量假冒伪劣产品充斥市场，欺骗消费者的同时也损害了牦牛肉的品牌价值，给西藏特色产业造成巨大冲击。
在此情况下，牦牛肉掺伪的检测方法应运而生。
本文综述了牦牛肉掺伪PCR检测方法和研究现状，以期为今后牦牛肉掺伪检测技术的研发提供参考。
关键字：牦牛肉；掺伪；PCR检测 Current Status and Progress of PCR Detection Technology forYak Meat AdulterationZHAO Wenwei1, WANG Shanshan1, ZHU Xiaoxiang1, ZHU Hongbo1, CAO Yewei1, YIN Zhina2*(1.Tibet Food and Drug Inspection and Research Institute, Lhasa 850000, China; 2.GuangdongPharmaceutical University, Guangzhou 510006, China)Abstract: The yak grows in a green and pollution-free plateau environment and has unique edible and nutritional value. At present, a large number of counterfeit and inferior products flood the market, deceiving consumers but also damaging the brand value of yak meat, causing a huge impact on Tibetan characteristic industries. In this case, detection methods for adulteration of yak meat came into being. This article reviews the PCR detection methods and research status of yak meat adulteration, with a view to provide reference for the future research and development of yak meat adulteration detection technology.Keywords: yak beef; adulteration; PCR detection牦牛（Bos grunniens）因其能够适应寒冷、缺氧等极端恶劣的条件，长期以来一直是高原山区畜牧业的主要畜类资源之一[1-2]。
关于表彰中国奶业协会2007年会优秀论文的决定
技术合作 ，中国奶业协 会 ２ ０ ０ ７年会组委会开展了论文征集活 ５ 不 同培 养条 件下对卵母细胞体外成熟的影响 田万强、昝林森、林 清等
． ｚ 浓度在 奶牛发情 周期中与 卵泡 发育对 比分析 动 ，此次共征集论文２ ０篇 ， 中， 牛育种与遗传改 良方面 ６ Ｅ 和 Ｐ ４ 其 奶
．我 国原料 乳安 全形势 分析 中继续总结经验 ， 积极撰写论文 ， 互相借鉴交流 ，为中国奶业 ３
王鹤 佳 、郭筱 华 、黄耀凌 等
的持续健康 发展做 出更大贡献。 特此决定。
中国奶业协会
２ ０ 年 ７ ０日 ０ ７ 月３
４ 牛结核 病抗体 胶体 金快 速检测 技术 的建立 和初步 运用 张 书环 、杨傻 兴 、晁彦 杰等 ５ ．牛传染 性鼻气管 炎病 毒 Ｐ ＣＲ检 测方法的建 立 杨 娟 、支海兵
３ 饲 喂秸秆 型 日粮 和青贮 型 日粮 对 青年奶 牛瘤 胃发酵及 氮代谢 的影 响 李长 皓 、张 思 维、 登攀 等 ４ ．维 生素 Ｅ富硒 舔砖对 泌乳期奶 牛生产 性能及 乳房 炎的影 响
王传 蓉 、安 孙子 仁 、大桥 秀一 等
７ 浅 谈液态 奶产 品稳定 性研 究常见 问题 与研究技 术手 段 樊启 程 ８．规 范奶 的热处理 工艺 是构 建现代 奶业 的关键 顾 佳 升 ９ 宫 廷奶 酪 的加工 工艺研 究 林 莉 、宋小红 、陈历俊 １ ０．风味蛋 白酶水 解乳清蛋 白的研 究 王 也 、胡 长利 、崔 建云 １ 乳 制品保质 期的确定 １ １ 低乳糖 牛奶生 产工艺 比较研究 ２
２ 篇 ，饲料 、饲养与环境 ５ ５ ８篇 ，奶牛繁殖与卫生保健 ６ 篇 ， ０
乳品加工和市场７ ２篇 ， 它 １ 其 ５篇。这些论文论点明确 ，主题 鲜明 ，内容详实，具有较高的水平 。经过 中国奶业协会各专业 委 员会组织专家评 审，共评选出 ５ ９篇优 秀论文。协会决定对 这些论文作者予 以表彰 ， 并颁发证书。希望获奖者今后在 实践
牦牛肌红蛋白的基因克隆测序、分离纯化、含量及其与乳酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶活力的关系
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9牦牛SRY和TRO基因部分序列克隆与测序分析_杨其沅
西南民族大学学报・自然科学版第33卷第5期 Journal of Southwest University for Nationalities ⋅Natural Science Edition Oct.2007______________________________________________________________________________________________收稿日期：2007-04-12作者简介：杨其沅(1981-), 男, 陕西省西安市人, 西南民族大学遗传学在读硕士研究生.通讯作者：字向东, 男, 西南民族大学生命科学与技术学院教授.文章编号：1003-2843(2007)05-1081-05 牦牛SRY 和TRO 基因部分序列克隆与测序分析杨其沅, 字向东, 马吉云(西南民族大学生命科学与技术学院, 四川成都 610041)摘 要：对牦牛SRY 和TRO 的部分基因克隆和序列分析, 以期为牦牛X 精子和Y 精子鉴定、性染色体的基因定位以及分子标记辅助选择研究提供理论依据. 从牦牛和西门塔尔牛冷冻精液中提取DNA, 用特定引物对SRY 、TRO 基因部分序列进行扩增并进行TA 克隆和测序. 结果表明, 这两个基因区域在牛种中有极高的保守性, 牦牛与普通牛SRY 和TRO 基因这两个区域的核酸同源性分别高达99.08%和99.39%.关键字：牦牛; 西门塔尔牛; SRY 基因; TRO 基因; 序列分析中图分类号: S823 文献标识码: A哺乳动物性别的决定和分化是多基因表达的有序协调表达的过程, 其中Y 染色体上的SRY (Sex-determining gene region of Y chromosome)基因在这一系列协同中起到开关作用[1]. 在胚胎发育的早期, SRY 基因可促使未分化的原始生殖脊分化成睾丸, 从而导致雄性性别的完全形成[2,3]. 目前已经在人、灵长动类、鼠、兔、有袋目等哺乳动物中发现SRY 基因具有高度的进化保守性[4]. 因此, 研究SRY 基因对探讨性别调控的机理有重要意义. 位于X 染色体TRO 基因是表达细胞粘附分子Trophinin(营养素)—一种内源性膜蛋白, 氨基端位于细胞质. TRO 基因可能在哺乳动物早期胎盘形成过程中也起着重要作用[5] .牦牛是生存在海拔3000～6000m 的青藏高原及其毗邻的高山、亚高山地区的特殊物种, 遗传资源十分丰富. 作为一种“全能”性家畜, 是当地人民的重要生活资源和生产资料[6]. 本研究将在对牦牛和西门塔尔牛的SRY 、TRO 基因部分序列克隆、测序的基础上, 结合GenBank 中刊登的普通牛相应基因序列进行序列比对分析, 以期为开展牦牛性别鉴定以及控制提供理论依据. 1 材料与方法1.1 实验动物及精子采集牦牛精液为细管冻精, 购自在青海省大通县牦牛育种场； 西门塔尔牛精液为颗粒冻精, 购自成都市种公牛站.1.2 主要试剂饱和酚、氯仿、酒精、蛋白酶K 、ExTaqDNA 聚合酶、dNTP 、MarkerDL2000、琼脂粉、PMD 18T Vector 试剂盒、PCR 产物胶回收试剂盒购等均购自TaKaRa 公司.1.3 基因组DNA 的提取和检测通过参考传统方法 [7, 8], 优化对精子DNA 的提取. 从液氮罐中小心取出细管冻精放入EP 管中并且在 37℃水浴锅中养活30min 加入400ul TNE ；50ul DTT, 150ul 水；25ul 蛋白酶K(10mg/µl)手摇混匀, 37℃保存2h. 经过以上处理后, 精子基因组DNA 用经典酚-氯法提取[9], 溶于TE 中,用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法双重检测DNA 的纯度和浓度, 然后稀释成25ng/µl 浓度, −20℃保存备用. 产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测. 外分光光度法双重检测DNA 的纯度和浓度, 然后稀释成25ng/µl.西南民族大学学报·自然科学版 1.4 引物设计、合成及稀释 参考普通牛SRY 基因DNA 序列(GenBank Accession No: Z30327)及普通牛TRO 基因部分序列(GenBank Accession No: M83753), 应用引物设计软件Premier5.0、Oligo6.0分别设计两对引物, 由上海基康生物有限公司合成. SRY -F: 5′TGAACGAAGACGAAAGGTGGCT 3′, R: 5′GTCCGCCGAAATCCGTGTAG3′. TRO -F: 5′CCACCCACAGCCAAATTACC T 3′, R: 5′GCCTGGACAGAAGCAGCAAC 3′.引物稀释前对其进行瞬间离心, 后加入一定量的超纯水, 使其终浓度为10pmol/ul 充分涡旋1～2min, -20℃保存备用.1.5 牦牛和西门塔尔牛SRY 和TRO 部分基因的PCR 扩增SRY 基因引物：PCR 反应在25µl 体系中进行, 10×ExTaq Buffer(Mg 2+Free)2.5µl, MgCl 2(25mmol/µl)1.5µl, dNTP(2.5mmol/µl)2µl, 上游引物(10pmol/ul)1µl, 下游引物(10pmol/ul)1µl, 模板DNA(25ng/µl)2.0µl, ExTaq 酶(5U/µl)0.25µl, 超纯水14.75µl.PCR 扩增按以下程序进行：95.0℃预变3min ；94.0℃变性45s, 57.0℃退火50s, 72.0℃延伸1min, 30个循环；72.0℃延伸5min, 4.0℃保存. 产物用1%琼脂糖凝胶电泳, EB 染色并用凝胶成像系统检测.TRO 基因引物：PCR 反应在25µl 体系中进行：10×ExTaq Buffer(Mg 2+Free)2.5µl, MgCl 2(25mmol/µl)1.5µl, dNTP(2.5mmol/µl)2µL, 上游引物(10pmol/µl)1µl, 下游引物(10pmol/µl)1µl, 模板DNA(25ng/µl)2.0µl, ExTaq 酶(5U/µl)0.25µl, 超纯水14.75µl.PCR 扩增按以下程序进行：95.0℃预变性3min ；94.0℃变性45s, 58.5℃退火50s, 72.0℃延伸1min, 30个循环；72.0℃延伸5min, 4.0℃保存. 产物用1%琼脂糖凝胶电泳, EB 染色并用凝胶成像系统检测.1.6 产物的纯化和测序利用小量胶回收试剂盒,对PCR 产物进行胶回收, 将纯化的PCR 产物插入PMD18T Vector, 转化TG1大肠杆菌,LB 液体培养基培养后提取重组质粒并进行测序.2 结果与分析2.1 PCR 扩增与测序结果应用设计的引物对牦牛和西门塔尔牛的SRY 基因和TRO 基因的部分序列进行扩增, 扩增大小分别为436bp 、435bp(图1、图2).1 2 3 4 5 6 7 8 9 10N图1 PCR 扩增SRY 基因产物的1%琼脂糖凝胶电泳图1～5泳道和6～10泳道分别为西门塔尔牛和牦牛SRY 基因扩增产物, N 泳道为DL2000第5期 1 2 3 4 5 6 7 8N图2 PCR 扩增TRO 基因产物的1%琼脂糖凝胶电泳图1～4泳道和5～8泳道分别为西门塔尔牛和牦牛TRO 基因扩增产物, N 泳道为DL2000 2.2 牦牛SRY 基因与TRO 基因的部分序列的同源比较和分析将所得到的DNA 序列用BLAST 与GenBank 数据库中已知牛的SRY 与TRO 序列进行同源性比较, 并用DNAMAN 软件对两个基因进行序列分析(图3).ORIGINQuery TGAACGAAGACGAAAGGTGGCTCT C G G G GGGAT C G AAATGA T A ..CTCAGACATC 55Sbjct1 ------------------------a -a -aatcc -a ------a -aa ---------- 55Sbjct2 ------------------------a -a -aatcc -a ------a -aa ---------- 55Query AGCAAGCAGCTGGGATATGAGTGGAAAAGGCTTACAGATGCTGAAAAGCGCCCAT 110Sbjct1 ------------------------------------------------------- 110Sbjct2 ------------------------------------------------------- 110Query TCTTTGAGGAGGCACAGAGACTACTAGCCATACACCGAGACAAATACCCGGGCTA 165Sbjct1 ------------------------------------------------------- 165Sbjct2 ------------------------------------------------------- 165Query TAAATATCGACCTCGTCGGAGAGCCAAGAGGCCACAGAAATCGCTTCCTGCAGAC 220Sbjct1 ------------------------------------------------------- 220Sbjct2 ------------------------------------------------------- 220Query TCTTCAATACTATGCAACCCGATGCATGTAGAGACATTGCACCCCTTCACATACA 275Sbjct1 ------------------------------------------------------- 275Sbjct2 ------------------------------------------------------- 275Query GGGATGGTTGTGCCAAGACCACATACTCACAAATGGAAAGCCAATTAAGCCGGTC 330Sbjct1 ------------------------------------------------------- 330Sbjct2 ------------------------------------------------------- 330Query ACAGTCCGTGATCATAACCAATTCACTCCTGCAAAAGGAGCATCACAGCAGCTGG 385Sbjct1 ------------------------------------------------------- 385Sbjct2 ------------------------------------------------------- 385西南民族大学学报·自然科学版Query ACAAGCCTGGGCCACAATAAGGTAACATTGGCTACACGGATT C CGGCGGAC 436Sbjct1 ------------------------------------------t-------- 436Sbjct2 ------------------------------------------t-------- 436图3 牦牛与普通牛SRY基因的序列同源比较分析(注：Query为牦牛基因测序序列, Sbjct1为西门塔尔牛的测序序列Sbjct2为NCBI上的普通牛序列)将牦牛TRO基因的测序序列通过Genebank中的BLASTN比较分析表明, 牦牛TRO基因与普通牛种同源性高达99.39%(图4).ORIGINQuery CACCCAC CAG CAAATTACCTCCATCCGAACTAAGAAAGGCTCTAAAGCCAAGAAG 55Sbjct1 -------agc--------------------------------------------- 55Sbjct2 -------agc--------------------------------------------- 55Query GCAATTTTATTGTTAAGGGCACAAATACTGATACTGAGCTCCCGGAGGCCTCAGA 110Sbjct1 ------------------------------------------------------- 110Sbjct2 ------------------------------------------------------- 110Query TGCCACTGAGATAGCTACCAGGCAGACTGAGGCCTCAGCAGCAGCTATCTGGCCC 165Sbjct1 ------------------------------------------------------- 165Sbjct2 ------------------------------------------------------- 165Query CCAAAATCCAAGGGCAAGAA A GTTGTCTACGAAGGCCCAAAATCTGCCTGTGAGA 220Sbjct1 ------------------------------------------------------- 220Sbjct2 --------------------g---------------------------------- 220Queryt TCTCTGAGGCCCTACCTGCCAGTCAAATGGTCACAAACCAACCCCTAGCAGCCAC 275Sbjct1 ------------------------------------------------------- 275Sbjct2 ------------------------------------------------------- 275Query CCTCTGGGTCAAGAGAGGGTACAGGGGTCAGAA A GT TGA CACTAAGACCCAAACA 330Sbjct1 ---------------------------------g--------------------- 330Sbjct2 ---------------------------------g--gac---------------- 330Query ACCAAAAGCCAGACTCAAGTTGACCAAGGGATCCAGGCCAAGATGGATACCTCTC 385Sbjct1 ------------------------------------------------------- 385Sbjct2 ------------------------------------------------------- 385Query AGACCCACATAAGTTCTCTTGAGACTCAGGTTGCTGCTTCTGTCCAGGC 434Sbjct1 ------------------------------------------------- 434Sbjct2 ------------------------------------------------- 434图4 牦牛与普通牛的TRO基因序列同源比较分析(注：Query为牦牛基因测序序列, Sbjct1为西门塔尔牛的测序序列Sbjct2为NCBI上的普通牛序列)3 讨论通过同源比对和分析可知, 牦牛与NCBI普通牛SRY基因序列共有12处发生碱基变异, 其中第25、27、29、30、31、32、33、35、42和428处位点碱基发生转换或颠换, 第44、45处碱基发生缺失, 然而对比西门塔尔牛和NCBI上普通牛的序列同源性达到100%, 在这个基因区域里没有发生有义突变, 这与西门塔尔牛是普通牛的一个品种的事实是符合的. 牦牛与NCBI普通牛的TRO基因共发生了8处碱基变异, 其中第8、9、10、186、309、312、第5期313和314处位点碱基发生转换或颠换. 西门塔尔牛与NCBI上普通牛TRO基因序列仅有4处碱基发生变异, 这可能是由于品种不同所致. 根据以上序列比对分析得出, 这两个区域的碱基在牦牛和普通牛种中是相当保守的,而且普通牛不同品种的亲缘关系要比与牦牛的亲缘关系更为接近. 由于SRY基因和TRO基因分别位于Y和X染色体上, 因此借助以上序列的分析对设计特异性探针或者分子标记杂交X染色体和Y染色体提供了便利和科学的理论依据, 进而为精确鉴定精液中X精子和Y精子的比例提供了可能. 近来人们利用荧光原位杂交(FISH)对人类精子进行性别鉴定[10], 通过被标记过的特异性DNA探针与性染色体杂交, 最终能估算出精子中X精子和Y精子的比例. 而对于精确鉴别牦牛精液中X精子和Y精子需要设计特异性分子探针, 以上的序列分析可以为牦牛X和Y精子特异性探针设计提供参考. Parati等人利用Taqman荧光定量PCR技术对奶牛精子性别进行鉴定[11], 获得了理想的结果. 然而对于Taqman探针来说一定要与目标基因完全结合才能有效的算出目标基因的拷贝数. 可以通过参考以上的序列设计牦牛的特异性探针去鉴别精子的性别, 对于牦牛性别控制研究工作具有积极意义.参考文献：[1] KOOPMAN P, MUNSTERBERG A, CAPEL B, et al. Expression of a candidate sex determining gene during mouse testisdifferentiation[J]. Nature, 1990, 248: 450-452.[2] SINCLAIR A H, BERTA P, PALMER M S, et al. A gene from the human sex-determining region encodes a protein with homologyto a conserved DNA binding motif [J]. Nature, 1990, 346: 240-244.[3] VAB de WETERING M. Sequence-specific interaction of the HMG box Protein TCF-1 and SRY occure within the minor groove ofWatson-Crick double helix[J]. EMBO, 1992, 11: 3039-3045.[4] GUBBY J, COLLIGNON J, KOOPMAN R, et al. Gene mapping to the sex-determining region of the mouse Y chromosome is amember of a novel family of embryonically expressed gene [J]. Genomics, 1995, 29: 541-545.[5] 肖丽娟, 杨增明. Trophinin, tastin和bystin在哺乳动物胚胎着床及早期胎盘形成中的作用[J]. 生殖医学, 2002, 11(2):120-123.[6] CAI L, WIENER G. The Yak[M]. Thailand:The Regional Office for Asia and the Pacific Food and Agriculture Organization of theUnited Nations. 1995.[7] 郑秀芬. 法医DNA分析[M]. 北京: 中国人民大学出版社, 2002:41-45.[8] 郑会芬, 董尚, 尚宝良. 混合精斑中精子DNA抽提方法的改进[J]. 中国司法鉴定, 2000,8:35-39.[9] 萨姆布鲁克J, 拉塞尔D. W. 分子克隆指南 [M]. 北京: 科学出版社, 2002.[10] 李善国, 施祖美, 邵敬於, 等. 荧光原位杂交同时检测精子X和Y染色体的方法[J]. 中国优生与遗传杂志,1997, 5(5): 4-6.[11] PARATI K, BONGIONI G, ALEANDRI R, et al. Sex ratio determination in bovine semen: A new approach by quantitative realtime PCR[J]. Theriogenology, 2006, 66: 2202-2209.Cloning sequence analysis of SRY and TRO partial gene of yaks (Bos grunniens)YANG Qi-yuan, ZI Xiang-don g, MA Ji-yun( School of Life Science & Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P. R. C. ) Abstract: SRY and TRO partial genes of the yak is cloned and sequenced with the aim to provide theoretical evidence for identification of X sperm and Y sperm, determination of these genes positions on the chromosomes and molecular assistant selection. By means of special perimers, SRY and TRO partial gene of yaks and Simmental cattle sequence are amplified by using PCR technology and cloned. According to the comparison result of cloning and relative sequence analysis, it is shown that the homology of these gene regions reaches 99.08% and 99.39% respectively. It is proved that these two sequence regions are conserved very much. Therefore, these results of sequence analysis offer strong date for identification of sperms or embryos sex in the further.Key words: yak; Simmental cattle; SRY gene; TRO gene; sequence analysis。
青海高原牦牛PRDM16基因克隆、生物信息学及组织差异表达分析
青海高原牦牛PRDM16基因克隆、生物信息学及组织差异表达分析赵生军;张勇;郭宪【摘要】本研究对青海高原牦牛PRDM16 (PR domain containing 16)基因部分编码区进行克隆及生物信息学分析,同时对PRDM16基因在雌、雄牦牛背最长肌肌肉组织中的表达差异进行了分析.选取雌、雄青海高原牦牛各5头,屠宰后采集背最长肌肌肉组织,克隆牦牛PR DM16基因部分CDS区序列,分析其生物信息学特征;应用实时荧光定量PCR技术检测PRDM16基因在雌、雄牦牛肌肉组织中表达水平.结果显示:克隆所得片段序列长323 bp,与黄牛同源性为100％,编码99个氨基酸,具有MDS1-EVI1 (complex locus protein MDS1)家族蛋白功能,具有CATH 蛋白功能活性,包含卷曲螺旋等典型结构域,与人甲基转移酶蛋白结构域PR蛋白1有20％的相似性;PRDM16基因在雌性牦牛肌肉组织中表达水平极显著高于雄性牦牛(P＜0.01).本试验结果为进步一研究青海高原牦牛PR DM16基因奠定了基础,为牦牛肉品质分析提供参考.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2016(043)002【总页数】8页(P363-370)【关键词】青海高原牦牛;PRDM16基因;背最长肌;基因表达【作者】赵生军;张勇;郭宪【作者单位】中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,甘肃省牦牛繁育工程重点实验室,兰州730050;甘肃农业大学动物医学院,兰州730070;甘肃农业大学动物医学院,兰州730070;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,甘肃省牦牛繁育工程重点实验室,兰州730050【正文语种】中文【中图分类】Q78牦牛(Bos gruniens)是青藏高原的优势畜种，可为牧民提供牛奶、肉类、纤维及燃料，并在高山生态系统中发挥着关键作用[1-2]。
牦牛肉风味独特，备受人们青睐，改善牦牛肉品质是牦牛产品加工研究的热点，其中应用分子生物学技术手段研究牦牛肉品质成为目前研究的焦点。
肉制品中牛源性成分PCR检测方法的建立及其应用
肉制品中牛源性成分PCR检测方法的建立及其应用熊蕊;郭凤柳;刘晓慧;赵同欣;王娜;颜红【摘要】根据牛特异性线粒体DNA片段,设计合成1对引物,以生、熟牛肉为材料,建立了肉制品中牛源性成分的PCR检测方法,并用该法对市售的67份牛肉制品进行检测.结果显示,所检牛源性成分在271 bp处出现预期的条带,扩增片段经Sau3AⅠ酶切分析确认,获得的214和57 bp片段与预期一致;运用该引物均可扩增出水牛肉、牦牛肉、奶牛肉、黄牛肉单一的相同大小的DNA条带,而对羊、马、狗、驴、兔和鸭等14种动物肉的DNA扩增则呈阴性,其检测灵敏度达到53.2fg/μLDNA;利用该法对67份牛肉制品进行检测,检出率为100％.结果表明,该法快速简便,且具有较高的特异性和敏感性,可用于市售牛肉制品中牛源性成分的鉴定.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2014(041)005【总页数】4页(P99-102)【关键词】PCR方法;检测;牛源性成分;特异性;灵敏度【作者】熊蕊;郭凤柳;刘晓慧;赵同欣;王娜;颜红【作者单位】保定出入境检验检疫局,河北保定 071051;保定出入境检验检疫局,河北保定 071051;保定出入境检验检疫局,河北保定 071051;保定出入境检验检疫局,河北保定 071051;保定出入境检验检疫局,河北保定 071051;保定出入境检验检疫局,河北保定 071051【正文语种】中文【中图分类】TS251.5伴随着中国食品工业的飞速发展，食品安全问题已成为当今社会的热点问题，尤其是肉与肉制品市场上掺杂掺假现象屡见不鲜。
近期据媒体报道，许多不法企业和个人使用廉价的猪肉、鸭肉等肉类原料，冒充牛肉、羊肉生产食品进行销售，严重侵犯了消费者的合法权益（何玮玲等，2012）。
然而，目前食品监管部门所采用肉类形态学的鉴别手段比较落后，掺假手段又越来越具有隐蔽性，且猪肉、牛肉和羊肉等在中国肉制品市场上的占有率较高。