膜片钳技术及其发展概况烟台绿叶

（3）使用的标本种类繁多 从最早的肌细胞（心肌、平滑肌、骨骼肌）、神经元和
内分泌细胞发展到血细胞、肝细胞、耳窝毛细胞、胃壁细胞、 上皮细胞、内皮细胞、免疫细胞、精母细胞等多种细胞；从 急性分散细胞和培养细胞（包括细胞株）发展到组织片（如 脑片、脊髓片）乃至整体动物；从蜗牛、青蛙、蝾螈、爪蟾 卵母细胞发展到昆虫细胞、鸡细胞、大鼠细胞、人细胞等等； 从动物细胞发展到细菌、真菌以及植物细胞。此外，膜片钳 技术还广泛地应用到平面双分子层（Planar bilayer）、脂质 体（Liposome）等人工标本上。
数模/模数转换器 高速、低噪音的Digidata 1440A
pClamp 10数据采集分析软件
PatchMaster采样软件
正置显微镜
组织薄片 盲法膜片钳－ 普通解剖显微镜 可视膜片钳－ DIC显微镜
IR-DIC显微镜 （Olympus BX51, Nikon FN-1）
显微镜X-Y移动台与支撑平台
（4）研究对象已经不局限于离子通道 从对离子通道（配体门控性、电压门控性、第二信使介导的
离子通道、机械敏感性离子通道以及缝隙连接通道等等）的研究 发展到对离子泵、交换体以及可兴奋细胞的胞吞、胞吐机制的研 究等。
（5）膜片钳电极已经不单单是传统意义上的电信号记录电极 它还作为其它研究方法的工具使用，如用于进行单细胞
1983 年 10 月 ， Sakmann 和 Neher 主 编 的 《Single-Channel Recording》一书问世，对当时的膜片钳技术进行了全面、 系统的总结，从此奠定了膜片钳技术的里程碑。
1995年，《Single-Channel Recording》一书再版，增添了 大量膜片钳技术的新内容，几乎当时国际上所有的知名膜 片钳专家都参与了编写，成为目前膜片钳技术研究领域的 最经典著作。
☆每次只能记录一个细胞，是一项耗时耗力的工作 ☆不适合在药物开发初期和中期进行大量化合物的筛选 ☆不适合需要记录大量细胞的基础实验研究。 全自动膜片钳技术的出现在很大程度上解决了这些问题， 它不仅通量高，一次能记录几个甚至几十个细胞，而且记 录质量均匀、稳定，此外从找细胞、形成封接、破膜等整 个实验操作实现了自动化，免除了这些操作的复杂与困难。 这些优点使得膜片钳技术的工作效率大大提高了！
全自动膜片钳的发展 1998 年 ， 由 NeuroSerach 和 Pfizer 公 司 合 作 开 发 出 Neuro-
Patch自动膜片钳设备，可对哺乳动物细胞进行自动化膜片钳操 作。随后，丹麦Sophion公司将其改进并推出世界上第一台全自 动膜片钳Apatchi-1。
德国Flyion公司的Flyscreen 8500和PatchBox 德国Cytocentrics公司的CytoPatch 美国MDS公司的PatchXpress 7000A和IonWorks系列 丹麦Sophion公司的QPatch 系列 德国Nanion公司的Patchliner系列和Port-a-Patch。 全自动膜片钳的记录技术方法：
将电极轻轻地接触细胞，形成低阻封接（MΩ）
电极
细胞膜 轻轻吸吮，形成高阻封接（GΩ）
继续稍用力吸吮或 给予电击打破细胞膜
细胞贴附记录模式 （Cell-attached recording）
迅速提起电极
电极内液与 细胞内液沟通
继续提起电极，使膜片 脱离细胞，形成囊泡
缓缓提起电极
在低 Ca2+液中 提起电极
A
B
D
电极接触细胞
C
负压吸引形成Ω形膜囊泡
提起电极,囊泡与细胞脱离
1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50 cm H2O的负压 吸引，得到10-100GΩ的高阻封接，大大降低了记录时的 噪声，实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流 的突破。
1981年Hamill、Marthy、Neher、Sakmann和Sigworth等 五人在总结膜片钳技术的基础上对其进行了重大改进，并 完善了游离膜片技术和全细胞记录技术，从而使膜片钳技 术走向成熟，他们的这一重要结果发表在后来的著名杂志 “欧洲生理学杂志（Pflügers Archive）”上
对膜片钳技术概念的理解
在对膜片钳概念的理解上不能将膜片钳技术与电流钳、 电压钳技术完全分割开，实际上在使用膜片钳技术时不 可避免地要使用到电压钳或电流钳技术。
在进行单通道记录时，电极下的膜片往往含有不止一个 离子通道，所记录的通道电流因此往往也不是一个通道 的电流。
膜 片 钳 技 术 的 基 本 记 录 模 式
美国Sutter公司、SD公司、国产
显微镜X-Y移动台与支撑平台
（2）应用技术不断涌现 为了更换电极内液和从电极内施加药物，发展了微电极内灌
注技术（Micropipette perfusion technique）； 在研究细胞间的缝隙连接（Gap junction）通道时，发展了双
膜片记录法（Double patch recording）； 将富含神经递质受体的游离膜片靠近突触部位，可检测递质
三、膜片钳技术的发展概况
膜片钳记录技术自创立以来，经历了许多发展变化 简单介绍如下：
（1）记录方式有很大变化 除了传统的单通道记录方式以及普通全细胞记录方式外，
又陆续发展了膜穿孔记录方式（Perforated patch clamp）、巨 膜片记录方式（Giant membrane patch）、松散封接记录方式 （Loose patch clamp）等等。
脑片记录系统
1. 膜片钳放大器 2. 数模/模数转换器 3. 数据采集分析软件 4. 计算机 5. 正置显微镜 6. 显微镜移动平台与支撑平台 7. 微操纵器：电动、手动 8. 微电极拉制仪 9. 电极抛光仪 9. 浴槽系统 10. 温控装置 11. 蠕动泵 12. 给药系统 13. 红外系统 14. 防震台和屏蔽网 15. 仪器架 16. 其他：渗透压仪、零配件等 17. 切片机 18. 刺激器
（2）可进行细胞内灌注，如灌注药物、信使物质、荧 光染料等；
（3）可进行细胞内容物的抽吸，如抽取mRNA等； （4）可研究细胞胞吞、胞吐机制。
全细胞记录模式
〈缺点〉
（1）对工作台的机械稳定性要求较高，维持长时间记 录难度较大；
（2）破裂的细胞膜残片易堵塞电极口，导致记录的不 稳定；
（3）存在Rundown现象； （4）大细胞存在空间钳制问题； （5）存在液接电位的校正问题； （6）存在串联电阻补偿问题 。
维持细胞静息膜电位，产生动作电位，从而调节细胞的 兴奋性、不应性和传导性；
调节细胞内Ca2+、cAMP、cGMP等第二信使 的浓度， 触发肌肉收缩、腺体分泌、基因表达等一系列细胞生理 反应；
参与神经元的突触传递； 维持细胞的正常体积。
细胞膜上的离子通道
细胞膜上至少有400种不同类型的离子通道，目前只有大约 100多种离子通道被克隆出来并进行了通道功能的研究。
释放和突触活动，这一技术称为膜片探针技术（Detector-patch technique）；
若将特异的膜片探针插入卵母细胞，可检测细胞内第二信使 含量，此为膜片填塞技术（Patch cramming technique）；
为研究细胞的胞吞与胞吐机制，发展了膜电容测定法（Membrane capacitance measurement）。
人类的很多疾病，如： 囊性纤维化（Cystic fibrosis） 癫痫（Epilepsy） 青春晚期糖尿病（MODY） 长QT综合征（Long QT syndrome） 以及多种神经、肌肉疾病，都是由于离子通道功能缺陷所致。 这类疾病被称为离子通道病（Channelopathy）。
离子通道病可由编码离子通道基因的突变引起，也可由编码 调节离子通道的一些蛋白的基因突变引起。 离子通道重要的生理作用以及众多离子通道病的存在，使离 子通道成为新药的热门作用靶点。目前约有20%的注册药物 是通过作用于离子通道而发挥药物作用的，药物通过调节特 定的离子通道功能来影响细胞行为。
1983年第一版
1995年第二版
《Single-Channel Recording》
内尔(Neher) （1944-） （德国细胞生理学家）
萨克曼(Sakmann) （1942-）
（德国细胞生理学家）
合作发明了膜片钳技术，并应用这一技术首次证实了细胞膜上 存在离子通道。该成果对于研究细胞功能的调控至关重要，可 揭示神经系统、肌肉系统、心血管系统及糖尿病等多种疾病的 发病机理，并提供治疗的新途径。 二人共获1991年诺贝尔奖。
EPC 10 Plus膜片钳放大器
• 计算机控制 • 单、双、三、四探头
EPC 10 Double膜片钳放大器
EPC 10 USB膜片钳放大器
MultiClamp700B 电阻反馈膜片钳和高速电流钳放大器
计算机控制 双电极探头
Axopatch 200B膜片钳放大器
• 单通道记录（最佳） • 全细胞记录 • 脂双层电压钳记录 • 电化学测量（伏安法） • 松散封接记录
将电极提出液面， 短暂暴露在空气中
全细胞记录模式 （Whole-cell recording）
外面向外记录模式
内面向外记录模式
（Outside-out recording） （Inside-out recording）
膜 片 钳 技 术 的 基 本 记 录 模 式
全细胞记录模式
〈优点〉
（1）便于更换细胞外液，可用于研究电压和配体门控 性离子通道、泵电流、交换体电流等，适合于离子通道药理 学的研究；
Diabetes 离子通道病

神经元
微电极
10μm
海马脑片CA1区锥体神经元的IR-DIC影象
10μm
海马脑片CA1区中间神经元的IR-DIC影象
什么是膜片钳技术（Patch clamp）？ 膜片钳技术是一种通过微电极与细胞
膜之间形成紧密接触的方法，采用电压钳 或电流钳技术对生物膜上离子通道的电活 动进行记录的微电极技术。
☆ Flip-Tip翻转技术 ☆芯片技术 ☆ Population Patch Clamp技术
四、膜片钳系统的仪器构成
刺激器
屏蔽网 监视器
显微镜
微操纵器
放大器 转换器
探头
防震台
膜片钳系统的仪器构成
单细胞记录系统
1. 膜片钳放大器 2. 数模/模数转换器 3. 数据采集分析软件 4. 计算机 5. 倒置显微镜 6. 显微镜加宽平台 7. 微操纵器：电动、手动 8. 微电极拉制仪 9. 电极抛光仪 9. 浴槽系统 10. 温控装置 11. 蠕动泵 12. 给药系统 13. 监视系统 14. 防震台和屏蔽网 15. 仪器架 16. 其他：渗透压仪、零配件等
PCR技术时的细胞内容物抽吸工具。
（6）应用范围日趋广泛 为解决实际问题的需要，膜片钳技术已经渗透到生物学领域
的许多学科中，如分子生物学、药理学、免疫学等等，成为生物 学研究中的一种主要技术手段，与其它生物学技术的结合应用已 经成为膜片钳技术的主要发展趋势。
（7）全自动膜片钳技术的崛起 传统膜片钳技术的局限
膜片钳技术及其发展概况
广州医学院生理系 汪鹏
主要内容
一、膜片钳技术的原理 二、膜片钳技术的发展历史 三、膜片钳技术的发展概况 四、膜片钳技术的仪器构成
一、膜片钳技术的原理
离子通道简介
离子通道是镶嵌在动、植物细胞膜上的一类特殊蛋白质， 它们负责转运细胞膜内外的各种离子，参与各种细胞功 能，主要包括：
二、膜片钳技术的发展历史
1976 年 德 国 马 普 生 物 物 理 化 学 研 究 所 Neher 和 Sakmann首次在青蛙肌细胞上记录到ACh激活的 单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。这是 人类首次记录到单通道的离子电流，这一创造性 结果发表在著名的Nature杂志上。
大鼠肌球细胞ACh受体单通道电流
离子通道具有如下特点： 1．离子选择性。大多数离子通道只运输一种离子，这
是离子通道多以所运输离子的名称来命名的原因，如K+离子 通道。
2．开启与关闭受不同门控机制控制。电压门控性离子 通道，配体门控性离子通道，机械敏感性离子通道，酸感受 离子通道等等。
3．大多数离子通道至少具有开放、关闭、失活等几种 状态。药物可能通过作用于离子通道的不同状态来影响通道 功能。