第四章细胞融合

2、细胞融合的基本过程
（1）细胞在促融剂或正弦电场 作用下凝集，彼此靠近； （2）两个相邻细胞之间的质膜 相互融合，随后两个亲本细 胞质膜上的受体、糖蛋白、 糖脂等质膜成分也在融合后 的质膜上重新分布； （3）细胞质发生融合； （4）细胞核融合，形成单核融 合细胞。
动植物细胞的融合过程
植物细胞融合过程
生物种类细胞来源成功年代烟草两个种间苷蓝青菜大豆马唐草矮牵牛龙面花大麦花生大麦大豆小麦矮牵牛油菜大豆油菜大豆玉米大豆大豆野豌豆大麦蚕豆大豆草香木犀酵母菌鸡大豆烟草大豆秋水仙人胡萝卜番茄马铃薯人小鼠叶叶叶根愈伤组织叶叶花瓣种子种子叶悬浮细胞叶花瓣叶悬浮细胞叶悬浮细胞叶悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞叶根悬浮细胞叶原生质体血红细胞悬浮细胞叶悬浮细胞叶腹水癌细胞原生质体叶根尖纤维肉瘤细胞畸胎瘤细胞1972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972几种细胞融合成功的例子植物融合细胞成长状态对比右瓶为地面融合的细胞左瓶中为太空微重力环境下融合的细胞动物细胞融合实验使用的小白鼠白化豚鼠hartley豚鼠?4意义和应用?1可以避开生殖细胞的受精过程在亲缘关系较远甚至毫无亲缘关系的物种间实现基因转移创造出自然界中没有的新物种
（1）将两种不同亲本细胞各5×l06混匀； （2）离心沉淀，吸去上清液； （3）加1ml 50％PEG溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触1分钟；
（4）加9ml 培养液，离心沉淀，吸去上清液；
（5）加5ml 培养液，分别接种5个直径60mm平皿，每个平皿加培养 液至 5ml，37℃的CO2培养箱中培养。
叶——叶 叶——根 愈伤组织——叶 叶——花瓣 种子——种子 叶——悬浮细胞 叶——花瓣 叶——悬浮细胞 叶——悬浮细胞 悬浮细胞——悬浮细胞 叶——根 悬浮细胞——叶 原生质体——血红细胞 悬浮细胞——叶 悬浮细胞——叶 腹水癌细胞——原生质体 叶——根尖 纤维肉瘤细胞——畸胎瘤细胞
成功年代
1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972
几种细胞融合成功的例子
生物种类
烟草两个种间 苷蓝——青菜 大豆——马唐草 矮牵牛——龙面花 大麦——花生 大麦——大豆 小麦——矮牵牛 油菜——大豆 玉米——大豆 大豆——野豌豆 大麦——蚕豆 大豆——草香木犀 酵母菌——鸡 大豆——烟草 大豆——秋水仙 人——胡萝卜 番茄——马铃薯 人——小鼠
细胞来源
电融合诱导法原理示意图
4、影响动物细胞融合的因素 亲本细胞表面性质影响较大，表而覆盖绒毛而不 规则者易融合，而表面光滑者难融合。 细胞融合时需要适宜温度和运动状态。 细胞融合的最适pH为7.4-7.8,在此范围之外，融 合率均较低。 细胞种类不同、融合效果也不同。 细胞融合过程中，通常耗氧量较大，缺氧时经常 不融合。 有些细胞融合时需要Ca2+，否则不融合，而且细 胞蛋白质也会发生变化。一般来说,最适合的离 子强度为0.1mol/L。
用灭活的病毒诱导的动物细胞融合盐类融合剂、PEG、DMSO、油酸盐、脂质、Ca2+络合 物等。

（1）盐类融合剂是应用最早的诱导原生质体融合的方法，优点：对 原生质体的活力破坏小；缺点：融合频率低，对液泡发达的原生质体 不易诱导融合。
（2）在众多的化学融合剂中，PEG应用最广泛。优点：PEG液比病 毒更易制备和控制，活性稳定、使用方便，促进融合的能力最强。 PEG为白色蜡状固体，具有强烈的吸水性以及凝集、沉淀蛋白质的作 用，分子质量1000~6000U的PEG均可做诱融剂。 （3）Ca2+离子法： Ca2+离子不仅是病毒诱导细胞融合所必不可少的 离子，而且本身就能诱导细胞融合。细胞质膜的稳定性和可塑性都依 赖于足够的Ca2+离子。 （4）溶血卵磷脂：对细胞膜极具破坏性，因而可诱导细胞融合，对 活细胞有毒，毒性可通过加入脱脂血清蛋白或白蛋白来降低。



聚乙二醇（PEG）法
优点是易得，用法简单，融合效果稳定。
聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH， 分子量大于200小于6000者均可用作细胞融合剂。 PEG浓度以W/W；如将10克PEG与10mlEagLe氏液混合 （假定1ml培养液为1g重)，即成50％PEG溶液。
（6）6—24小时后，换成选择培养液筛选杂交细胞。
3、物理方法诱导细胞融合-电融合法 电融合法是80年代出现的细胞融合技术，在直流电脉冲的 诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘 合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整 的膜，形成融合体。
电融合法的优点：
融合率高、重复性强、对细胞伤害小； 装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程；
B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再
进行细胞分裂，存活一段时间后便会死亡——短命

（1）抗药性筛选系统 如果一种细胞对药物A 敏感而对药物B不敏 感，另一种细胞正相反，可以把一定量的药物 A和药物B同时或轮流加入到培养基中，两种亲 本细胞及其融合形成的同核体将被杀死，只有 融合形成的杂种细胞能存活。采用X射线照射 或化学诱变剂处理来获得抗药性突变细胞株。

（2）营养缺陷型筛选系统 在缺少一种或几种营养成分（如氨基酸、碳水化合物等） 和碱基等的培养基中不能生长繁殖的细胞称为营养缺陷型细 胞。如当一种甘氨酸缺陷型细胞和另一种脯氨酸缺陷型细胞 融合，由于基因互补作用，只有杂交细胞才可以在缺少甘氨 酸和脯氨酸的培养基中存活，而亲本细胞及其同核体都将死 亡。 （3）温度敏感型筛选系统 如果用于细胞融合的亲本细胞一种适合于高温生长，而 另外一种适合于低温生长，融合的杂交细胞就可以通过分别 在较高和较低温度下培养而被筛选出来
免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。
电融合的基本过程：
细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通
电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在
电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；
膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以
使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。

第四节 杂交瘤技术与单克隆抗体
一、何谓单克隆抗体？
只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。
单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞(myeloma cell)与 经特定抗源免疫刺激的B淋巴细胞(antigen stimulated B lymphoblast)融合得到杂交瘤细胞(hybridoma cell)，杂交瘤 细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细 胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂 交瘤技术(hybridoma technology ）。
异核细胞：非同源细胞的融合体。 同核细胞：两个相同细胞的融合体。 多核细胞：含有双亲不同比例核物质的融合体。

筛选方法 1、非选择性筛选：指用机械方法把单个杂交 细胞挑选出来，让其分裂繁殖，培养出细胞 克隆。缺点是杂交细胞数量很少，挑选不易， 而且挑选出来的细胞不一定分裂。

2、选择性筛选：根据细胞对药物的抗性、营 养的需求或温度的敏感性等的不同，选择适 当的培养条件将杂交细胞分离出来。
植物融合细胞成长状态对比,右瓶为地面融合的 细胞，左瓶中为太空微重力环境下融合的细胞
动物细胞融合实验使用的小白鼠
白化豚鼠（Hartley豚鼠)




4、意义和应用 （1）可以避开生殖细胞的受精过程，在亲缘 关系较远、甚至毫无亲缘关系的物种间实现 基因转移，创造出自然界中没有的新物种； （2）创造细胞质杂种，作物育种和种质创新 上有独特的意义和作用； （3）动物细胞融合后形成的杂交瘤主要用来 获得单克隆抗体； （4）为携带外源遗传物质的大分子渗入细胞 创造条件。
二 融合方法选择
1、动物细胞：仙台病毒、PEG法和电融 合法均适用 2、植物细胞：PEG法和电融合法 3、微生物细胞：PEG法

三 融合细胞的筛选

筛选的基本原理就是把异核体从同核体以及 未发生融合的亲本细胞中分离出来。
根据已经发生融合的细胞中所含有核的类型，可将其 分为以下几种类型：
第四章 细胞融合
第一节 细胞融合概述


1、细胞融合的定义 细胞融合（Cell Fusion 又称体细胞杂交 （somatic hybridiazation）: 在外力（诱导剂 或促融剂）作用下，两个或两个以上的异源 （种、属间）细胞或原生质体相互接触，从而 发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细 胞的现象。亦称细胞杂交。如取材为体细胞则 称体细胞杂交。 自发细胞融合（Spontaneous cell fusion）和 诱导细胞融合（Induced cell fusion）。

仙台病毒法
仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段：
①两种细胞在一起培养，加入病毒，在4℃条件下病毒附着在细胞
膜上。并使两细胞相互凝聚； ②在37℃中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需
要Ca2+和Mg2+，最适PH为8.0一8.2；
②细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP； ④融合成巨大细胞，仍需ATP 。
第二节 细胞融合的基本原理
显微镜下细胞融合过程
融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解
第三节 动物细胞融合
一 细胞融合方法





1、病毒诱导细胞融合 病毒是研究最早的促融剂。能诱导细胞融合的病毒种 类很多，如疱疹病毒、牛痘病毒和副黏液病毒等，常 用的是副黏液病毒中的仙台病毒。 仙台病毒（HVJ）是最早用于动物细胞融合的融合剂， 毒力低、对人的危害小、易被紫外线灭活。形态为圆 球形，由RNA核心、衣壳和囊膜组成； 囊膜上有许多刺突，每个刺突都是一个单价血细胞凝 集素，仙台病毒能够凝集血细胞和其他细胞的能力与 刺突的存在是分不开的 刺突具有唾液酸苷酶的活性，能水解寡糖链上的唾液 酸残基，因而可以依赖刺突的唾液酸苷酶活性攻击细 胞表面 仙台病毒诱导细胞融合的能力与其核酸无关。
Niels K. Jerne G. Kohler
C. Milstein
二、杂交瘤技术的基本原理
三 杂交瘤技术的实验原理及其操作演示
（一）杂交瘤技术产生的3个技术关键
1. B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：
B淋巴细胞(B lymphocytes)： 接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异性
抗体，在体液免疫中具有重要功能。

（1）基本过程：①足够数量的病毒颗粒附着在细胞膜 上起搭桥作用，使细胞聚集在一起；②黏结部位质膜 被破坏，形成通道，细胞质流通并融合，病毒也随之 进入细胞质；③两个细胞合并变圆，形成融合细胞； ④恢复贴壁培养；⑤选择性培养基中筛选杂交细胞。 （2）病毒的加入方式：①两种亲本细胞均制备成单细 胞悬浮液，病毒加入悬浮液中；②一种亲本细胞为贴 壁状态，另一种亲本细胞制备成单细胞悬浮液，病毒 与细胞悬浮液体先后或共同加入；③将两种亲本细胞 混合贴壁培养，病毒加到培养液中
PEG经高压灭菌后，与温热的Engle氏液混合。
通常用分子量低于1000的PEG作融合剂最好，50％PEG 溶液能产生最多杂交细胞。 PEG溶液在pH6.0时细胞融合率最高。
聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程
•PEG诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿需特殊
设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。 其缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。
人造小鼠培育过程示意图
3、发展历史
Muller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。
Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。 Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。 Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。 Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。 1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。 1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。 1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定 单克隆抗体的杂交瘤细胞。 20世纪80年代出现了电融合技术。
•PEG的作用机理： Kao等认为，由于PEG分子具有
轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质 和碳水化合物等形成H键，从而在在质膜之间形成分子 桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合； 另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细 胞器发生融合成为可能。
聚乙二醇（PEG）法细胞融合步骤