东北传统酱腌菜中耐盐乳酸菌的筛选、鉴定及其发酵特性研究

东北传统酱腌菜中耐盐乳酸菌的筛选、鉴定及
其发酵特性研究
目录
一、内容概述 (2)
1. 研究背景与意义 (2)
2. 国内外研究现状 (3)
3. 研究内容与方法 (4)
二、材料与方法 (6)
1. 材料选取 (6)
东北传统酱腌菜样品采集 (7)
耐盐乳酸菌分离纯化 (8)
2. 实验室培养条件 (9)
培养基选择与制备 (10)
培养方法与步骤 (11)
3. 耐盐乳酸菌筛选 (12)
斜面初筛 (13)
耐盐性测试 (14)
4. 耐盐乳酸菌鉴定 (15)
16S rDNA序列分析 (16)
准备好凝胶电泳 (17)
5. 发酵特性研究 (18)
发酵条件优化 (19)
产物分析 (20)
三、结果与讨论 (21)
1. 耐盐乳酸菌的筛选结果 (22)
不同样品中的耐盐乳酸菌数量对比 (23)
耐盐乳酸菌的生理生化特征 (24)
2. 耐盐乳酸菌鉴定结果 (25)
16S rDNA序列比对与分析 (26)
准备好凝胶电泳图谱 (27)
3. 发酵特性分析 (28)
四、结论与展望 (29)
1. 研究结论 (30)
2. 研究创新点 (31)
3. 研究不足与展望 (32)
一、内容概述
本研究聚焦于东北传统酱腌菜中耐盐乳酸菌的筛选、鉴定及其发酵特性，旨在深入挖掘和利用这一宝贵资源。

在筛选阶段，我们采集了多种东北传统酱腌菜样品，并经过严格筛选，成功分离出多株具有耐盐特性的乳酸菌。

这些乳酸菌在高盐环境中仍能保持旺盛的生长势头，显示出出色的耐盐能力。

我们运用先进的生理生化鉴定方法和分子生物学技术对这些乳酸菌进行了鉴定。

通过对比分析，确定这些菌株的分类地位及遗传特性，为东北传统酱腌菜的发酵剂提供科学依据。

在探究其发酵特性的过程中，我们对这些乳酸菌的生长曲线、产酸能力、耐盐能力等关键指标进行了系统研究。

这些研究结果不仅揭示了乳酸菌在酱腌菜发酵过程中的重要作用，还为其在工业生产中的应用提供了理论支持。

本研究不仅全面了解了东北传统酱腌菜中耐盐乳酸菌的种类和
特性，还为优化酱腌菜生产工艺、提升产品质量提供了新的思路和方向。

1. 研究背景与意义
随着现代社会生活节奏的加快，人们对于快捷、方便且营养丰富的食品需求日益增长。

在这种背景下，东北传统酱腌菜因其独特的风味和保质期长而深受消费者喜爱。

长期的腌制过程可能导致微生物污染，影响产品的安全性和品质。

开展东北传统酱腌菜中耐盐乳酸菌的筛选、鉴定及其发酵特性研究，对于优化酱腌菜的生产工艺、提高产品质量以及保障食品安全具有重要意义。

耐盐乳酸菌在酱腌菜的发酵过程中起着关键作用，它们能够利用原料中的盐分作为营养物质进行生长繁殖，并产生有益的代谢产物，如酸、酶等，这些产物不仅有助于改善产品的风味和口感，还能抑制有害微生物的生长，延长产品的保质期。

耐盐乳酸菌还具有潜在的益生元功能，能够调节肠道微生态平衡，对人体的健康有益。

东北地区独特的盐碱环境和丰富的蔬菜资源为耐盐乳酸菌的生
长提供了良好的条件。

本研究旨在通过筛选耐盐乳酸菌，鉴定其种类和特性，探讨其在酱腌菜发酵过程中的作用机制，为东北传统酱腌菜的生产提供科学依据和技术支持。

研究成果还将为其他地区类似产品
的生产提供借鉴和参考，推动我国传统食品工业的技术进步和产业升级。

2. 国内外研究现状
在东北传统酱腌菜的发酵过程中，耐盐乳酸菌起着至关重要的作用。

国内外学者对这一领域进行了广泛而深入的研究。

众多研究者致力于发掘和利用耐盐乳酸菌资源，以期在酱腌菜的发酵过程中实现更高效的微生物调控。

通过传统的微生物分离技术与现代生物技术相结合，国内学者已从东北传统酱腌菜中筛选出多株具有优良耐盐性能的乳酸菌，并对其发酵特性进行了系统研究。

这些研究不仅揭示了乳酸菌在酱腌菜发酵过程中的重要作用，还为优化发酵工艺、提升产品质量提供了有力支持。

乳酸菌在食品发酵领域的应用同样备受关注，许多研究者致力于耐盐乳酸菌的筛选、鉴定及其在食品发酵中的应用。

欧洲和美洲等地区的学者在耐盐乳酸菌的分离、鉴定以及其在酱腌菜等食品发酵中的功能性方面取得了显著成果。

他们通过基因测序、蛋白质组学等先进技术手段，深入探讨了乳酸菌的耐盐机制、代谢产物及其对食品品质的影响，为国际食品科学领域的发展做出了重要贡献。

目前关于东北传统酱腌菜中耐盐乳酸菌的筛选、鉴定及其发酵特性的系统性研究仍显不足。

随着科技的不断进步和食品工业的快速发
展，未来研究应更加注重耐盐乳酸菌资源的挖掘与利用，深入探究其在酱腌菜发酵过程中的作用机制，为东北传统酱腌菜的绿色制造和品质提升提供理论依据和技术支持。

3. 研究内容与方法
样品采集：首先，我们将从东北地区的传统酱腌菜中采集样本，确保样本的多样性和代表性。

微生物分离与培养：通过适当的培养基和条件，对采集的样本进行微生物分离与培养，以获取大量的乳酸菌。

耐盐性筛选：利用不同浓度的盐水培养基对分离得到的乳酸菌进行耐盐性筛选，挑选出耐盐性能优良的乳酸菌。

形态学鉴定：通过观察筛选得到的耐盐乳酸菌的菌落形态、细胞形态等特征，进行初步鉴定。

分子生物学鉴定：通过PCR扩增、测序等技术手段，对耐盐乳酸菌的16S rRNA基因进行测序，并与已知菌种数据库进行比对，确定菌种的分类地位。

发酵过程分析：将筛选得到的耐盐乳酸菌应用于酱腌菜的发酵过程中，观察并记录其发酵过程中的pH值、亚硝酸盐含量、氨基酸态氮含量等指标的动态变化。

发酵产物分析：分析发酵过程中产生的有机酸、醇类、酯类等物
质，探究耐盐乳酸菌对酱腌菜风味的影响。

功能性分析：评估耐盐乳酸菌对酱腌菜的营养价值、保质期、安全性等方面的贡献，探讨其在传统酱腌菜产业中的应用潜力。

本研究将综合运用微生物学、食品化学、食品工艺学等多学科的知识和方法，以期达到对东北传统酱腌菜中耐盐乳酸菌的全面了解，为传统酱腌菜的改良和产业升级提供理论支持和技术指导。

二、材料与方法
本实验选用东北地区传统酱腌菜为研究对象，包括酸菜、泡菜、芥菜丝等。

采集后迅速带回实验室进行处理。

采用富集培养法从酱腌菜样品中筛选耐盐乳酸菌，取适量样品加入含有不同浓度盐、的MRS液体培养基中，摇匀后置于恒温培养箱中培养。

挑选在高盐环境下生长的菌落进行后续实验。

根据形态学特征、生理生化特性以及16S rDNA序列分析对筛选出的乳酸菌进行鉴定。

具体步骤包括菌落形态观察、革兰氏染色、糖发酵试验、MRVP试验、H2S试验等。

将筛选出的耐盐乳酸菌接种到含有15盐的MRS液体培养基中，进行摇瓶发酵实验。

定期取样测定发酵液的pH值、乳酸含量、总酸度等指标，并绘制发酵曲线。

采用Excel和SPSS软件对实验数据进行处理和分析，包括方差
分析、相关性分析等，以揭示乳酸菌发酵特性与品质的关系。

1. 材料选取
个不同种类的东北传统酱腌菜样品，包括白菜、大头菜、萝卜干等。

这些样品均来自当地农户，具有较高的代表性和典型性。

多种常用的乳酸菌培养基，如LB培养基、M9培养基、NAA琼脂培养基等。

乳酸菌分离物、鉴定试剂盒和PCR检测试剂盒。

这些试剂盒可以用于从样品中分离出乳酸菌，并进行鉴定和定量分析。

高盐浓度溶液。

为了模拟实际应用场景中的高盐环境，我们选择了不同浓度的高盐溶液进行筛选试验。

我们选取了0 NaCl、1 NaCl、3 NaCl、5 NaCl和7 NaCl共5种高盐浓度溶液。

实时荧光定量PCR仪。

该仪器可以用于检测乳酸菌的数量和相对丰度，以便进一步研究其发酵特性。

东北传统酱腌菜样品采集
在探究东北传统酱腌菜中耐盐乳酸菌的筛选、鉴定及其发酵特性过程中，第一步即为样品采集，这一步是整个研究的基石。

东北地区的酱腌菜种类丰富，因其地理环境和文化背景的双重影响，酱腌菜的制作工艺及原料具有鲜明的地方特色。

为了获取最具代表性的东北传统酱腌菜样品，研究团队深入东北各地，精心挑选了多个具有代表性的酱腌菜品种。

这些样品涵盖了东北地区不同地域、不同民族、不同制作方法的酱腌菜品，确保了研究的全面性和多样性。

样品采集过程中，严格遵循科学、规范的原则。

每个样品的采集都选在相同的环境条件下进行，确保了外部环境的稳定性。

研究人员在采集过程中详细记录了样品的制作时间、原料、制作工艺等信息，为后续的分析提供了丰富的数据支持。

采集回来的酱腌菜样品经过初步处理，去除表面杂质后，进行无菌操作，以保证微生物菌群的原始状态。

样品被妥善保存在特定的环境条件下，以待进一步的实验室分析。

为了确保研究的准确性和可靠性，研究团队采集的酱腌菜样品数量充足，覆盖了东北地区的多个主要城市及乡村地区。

这样的样本分布和数量，为后续耐盐乳酸菌的筛选提供了丰富的样本库。

在样品采集过程中，可能会遇到地域差异、季节性变化等因素带来的挑战。

为了应对这些挑战，研究团队制定了详细的解决方案，如增加样本量、扩大采样范围等，以确保研究的全面性和准确性。

团队成员之间的紧密合作和沟通也是克服潜在困难的关键。

耐盐乳酸菌分离纯化
在东北传统酱腌菜中，耐盐乳酸菌的分离纯化是研究其发酵特性的关键步骤。

我们需要从酱腌菜样品中取样，并经过一系列的预处理步骤，如均质、离心和过滤，以去除杂质和微生物。

采用选择培养基，根据乳酸菌的生长特性和生理生化指标进行筛选。

常用的选择性培养基包括MRS培养基、SLA培养基等，这些培养基能够促进乳酸菌的生长并抑制其他微生物的生长。

在筛选过程中，我们还会关注菌落的形态、颜色、大小和菌体形态等特征，以便更好地识别乳酸菌。

通过显微镜观察，我们可以进一步确认所分离菌株的乳酸菌种类。

还可以利用PCR技术对乳酸菌进行分子生物学鉴定，通过扩增16S rRNA基因序列并与已知乳酸菌进行比对，从而确定菌株的种属和亲缘关系。

经过多次划线分离和纯化，我们可以得到纯化的乳酸菌菌株。

这些菌株将作为后续实验研究的对象，用于深入探讨其在酱腌菜发酵过程中的作用和机制。

2. 实验室培养条件
为了筛选、鉴定和研究耐盐乳酸菌的发酵特性，我们需要在实验室条件下进行一系列实验。

我们需要准备适合乳酸菌生长的培养基，常用的乳酸菌培养基有高盐乳酸菌培养基(NaCl)和低盐乳酸菌培养
基(KCl)。

在本研究中，我们选择使用高盐乳酸菌培养基(NaCl),其浓
度为10(质量分数)。

我们需要准备不同浓度的NaCl溶液，以模拟不同盐度环境。

通常情况下，乳酸菌对盐度的适应范围较广，但为了更准确地筛选出耐盐乳酸菌，我们可以选择较低浓度的NaCl溶液进行筛选。

在本研究中，我们将NaCl浓度从0递增至5,并在每个浓度下分别接种等量的初始菌株。

为了控制实验条件的一致性，我们需要确保实验室的环境条件稳定。

这包括温度、湿度和光照等因素。

在本研究中，我们选择在室温(2025C)下进行实验，并保持相对湿度在6080之间。

我们使用恒定强度的LED灯作为光源，以模拟自然光环境。

我们需要对实验过程中使用的试剂和设备进行消毒处理，以保证实验结果的可靠性和重复性。

在本研究中，我们使用70的酒精对操作工具和培养基表面进行擦拭消毒，并在每次实验前后更换新的培养基。

培养基选择与制备
MRSA（高盐MRS）培养基：鉴于酱腌菜的高盐环境，选择含有较高盐浓度的MRSA培养基，以模拟酱腌菜的渗透压环境，有利于耐盐乳酸菌的生长。

其他专用培养基：针对乳酸菌的生理特性，配合使用其他如乳酸
菌选择性培养基，确保筛选过程中其他微生物的生长得到有效抑制。

基础材料准备：按照标准实验室操作要求，准备所需的各种基础原料，如牛肉膏、酵母提取物、蛋白胨等。

对于特定的耐盐环境微生物培养，还需准备适量的无机盐，如氯化钠等。

配制过程：首先按照配方将基础材料溶于去离子水中，然后进行pH值的调整，确保其在适合乳酸菌生长的范围内（一般控制在微酸性环境）。

随后进行高压蒸汽灭菌处理，以确保培养基的无菌状态。

灭菌与冷却：将配制好的培养基进行高压蒸汽灭菌处理，以消除所有微生物。

灭菌完成后，待培养基冷却至适宜温度，即可进行接种操作。

保存与使用：制备好的培养基应存放在无菌、密封的环境中，避免污染。

在使用前需再次确认其无菌状态及pH值是否适宜。

培养方法与步骤
在培养方法与步骤部分，首先需要准备好实验所需的材料和仪器设备。

材料包括待筛选的耐盐乳酸菌菌株、营养琼脂培养基、生理盐水、无菌操作工具等；仪器设备则包括恒温培养箱、显微镜、天平、超净工作台等。

将待筛选的耐盐乳酸菌菌株接种到营养琼脂培养基上，在适宜的温度下培养，直至菌落形态稳定。

从培养好的菌落中挑选出具有典型耐盐性状的菌株，并进行纯化处理，以获得单一的菌株。

在无菌条件下，将纯化后的乳酸菌接种到含有不同浓度盐分的培养基中，以筛选出耐盐性较强的菌株。

对筛选出的耐盐乳酸菌进行生长曲线的测定，以了解其生长速度和耐受性。

进行发酵特性的研究，包括发酵过程中酸度、还原糖、总酸等指标的测定，以及产物的定性分析。

3. 耐盐乳酸菌筛选
为了筛选出适合东北传统酱腌菜的耐盐乳酸菌，我们首先需要对不同来源的土壤、水体和植物样品进行分离培养。

通过选择性培养基的选择和优化，我们可以得到一系列具有不同发酵特性的细菌菌株。

我们将这些菌株进行耐盐性测试，以确定哪些菌株具有耐盐能力。

在耐盐性测试中，我们将菌株分别接种到含有不同浓度氯化钠(NaCl)的培养基上，观察其生长情况。

通常情况下，耐盐菌株在高盐浓度下仍能正常生长，而其他菌株则会受到抑制甚至死亡。

通过比较不同菌株在高盐条件下的生长情况，我们可以筛选出具有较强耐盐能力的乳酸菌。

为了进一步验证筛选出的耐盐乳酸菌是否适合用于东北传统酱
腌菜的发酵，我们还需要对其发酵特性进行研究。

这包括发酵时间、产酸量、pH值变化等方面的影响因素。

通过对这些影响因素的控制
和优化，我们可以为东北传统酱腌菜的生产提供高效、安全、稳定的发酵条件，从而提高产品质量和口感。

斜面初筛
斜面初筛是筛选耐盐乳酸菌的重要步骤之一，在这一阶段，我们从东北传统酱腌菜样本中采集样品，通过无菌操作将样品稀释涂布于含有不同盐浓度的培养基斜面上。

这些培养基是根据酱腌菜的实际环境进行模拟配制的，旨在筛选出能够在高盐环境下正常生长的微生物。

初筛过程中，我们仔细观察并记录每个菌落的生长情况，包括菌落的形态、大小、边缘整齐度等特征。

通过进一步的观察和分析，筛选出符合耐盐特性的乳酸菌菌落。

这些菌落在高盐环境下仍能良好生长，显示出潜在的耐盐性能。

初步筛选出的耐盐乳酸菌将被进一步纯化培养，以便进行后续的鉴定和发酵特性研究。

这一阶段的工作对于确定最终可用于东北传统酱腌菜制作的耐盐乳酸菌至关重要。

通过斜面初筛，我们能够初步了解这些微生物的生物学特性，为后续研究提供基础数据。

耐盐性测试
在耐盐性测试部分，本研究采用了定性及定量相结合的方法对分离得到的耐盐乳酸菌进行了系统的评估。

通过一系列的生理生化实验，包括耐盐生长实验、耐盐能力测定以及酶活性分析等，对这些菌株的耐盐性能进行了初步筛选。

这些实验结果显示，所分离菌株均能在高盐环境中生长，其中部分菌株在较高盐浓度下仍能保持较高的生长速率和酶活性，表现出较强的耐盐性。

为了更准确地评估这些菌株的耐盐性，本研究采用了一种新的耐盐性评价方法——盐浓度梯度平板法。

该方法通过在不同浓度的盐溶液中制备平板，然后接种待测菌株，观察其在不同盐浓度下的生长情况。

通过对比不同菌株在相同盐浓度下的生长速度和菌落形态，可以更加直观地判断其耐盐性的强弱。

在盐浓度梯度平板法中，本研究设置了多个盐浓度梯度，包括、10和15等。

经过一段时间的培养，观察到大多数菌株在0至5的盐浓度范围内都能正常生长，但随着盐浓度的增加，菌株的生长速度逐渐减慢，菌落形态也发生了一定的变化。

当盐浓度达到10时，部分
菌株出现了生长停滞的现象，而当盐浓度进一步提高到15时，所有
菌株均不能在该条件下生长。

这些结果说明，本研究分离得到的耐盐乳酸菌株具有一定的耐盐范围，但同时也指出了它们在更高盐浓度下的生长限制。

通过生理生化实验和盐浓度梯度平板法的结合使用，本研究成功地筛选出了一批具有较强耐盐性的乳酸菌株，并为进一步研究它们的发酵特性和开发利用提供了基础数据。

4. 耐盐乳酸菌鉴定
耐盐乳酸菌鉴定是东北传统酱腌菜发酵过程的重要环节，其目的是筛选出具有优良耐盐特性的乳酸菌品种。

为了实现这一目标，我们采用了多种方法进行耐盐乳酸菌的鉴定。

通过形态学观察，对分离出的菌落进行初步鉴定，判断其是否具有典型的乳酸菌形态特征。

采用生理生化试验，如葡萄糖发酵试验、乳酸发酵试验等，进一步验证分离菌株的耐盐特性。

我们还利用PCR技术对耐盐乳酸菌进行了基因序列分析，以期找到与其耐盐特性相关的基因位点。

在实际操作过程中，我们首先对采集到的土壤样品进行预处理，包括洗涤、研磨和稀释等步骤。

通过稀释涂布平板法或液体培养基法进行菌落计数和分离，对于筛选出的具有耐盐特性的菌株，我们采用不同的培养条件进行培养和鉴定。

对于耐高盐乳酸菌，我们可以采用高盐培养基(如 NaCl)进行培养；而对于耐低盐乳酸菌，则可采用低盐培养基(如 NaCl)进行培养。

通过对比不同条件下菌株的生长情况和代谢产物产生情况，我们可以进一步确定其耐盐特性。

耐盐乳酸菌鉴定是东北传统酱腌菜发酵过程中不可或缺的一环。

通过对耐盐乳酸菌的筛选、鉴定及其发酵特性的研究，我们可以为优化酱腌菜生产工艺提供有力的理论依据和技术支持。

16S rDNA序列分析
在东北传统酱腌菜中耐盐乳酸菌的筛选与鉴定过程中，16S rDNA 序列分析是重要的一环。

该技术基于细菌的核糖体RNA基因（rDNA）具有高度的保守性，其中16S rDNA序列因其适中的长度和易扩增的特点被广泛应用于细菌种类的鉴定。

对于筛选出的耐盐乳酸菌，我们首先进行菌落形态观察和生理生化特征分析，初步筛选后，再提取细菌基因组DNA。

接着通过PCR技术扩增其16S rDNA序列，得到清晰的扩增产物后进行测序。

将获得的序列与已知的数据库中的序列进行比对，可以确定其种属关系。

通过16S rDNA序列分析，我们可以精确地鉴定出筛选出的耐盐乳酸菌的菌种，如植物乳杆菌、短乳杆菌等。

这种分子鉴定方法不仅准确度高，而且能够提供更全面的菌种信息。

通过对不同菌株间16S rDNA序列的比较，还可以分析它们的亲缘关系和进化关系。

对于发酵特性的研究，通过分析耐盐乳酸菌在发酵过程中的16S rDNA序列变化，可以了解其在不同发酵阶段的种群动态变化，进而研究其发酵机制和影响发酵的因素。

这对于优化酱腌菜的发酵工艺、提高产品质量和风味具有十分重要的意义。

通过16S rDNA序列分析，我们不仅能够准确鉴定耐盐乳酸菌的菌种，还能够深入了解其发酵特性，为东北传统酱腌菜的制作提供科学依据。

准备好凝胶电泳
在筛选和鉴定耐盐乳酸菌的过程中，凝胶电泳技术扮演着至关重要的角色。

为了确保实验的准确性和可靠性，我们首先需要对提取到的乳酸菌总DNA进行质量检测，包括浓度和纯度分析。

我们将利用PCR技术扩增目标耐盐乳酸菌的16S rRNA基因，以获取其独特的基因序列信息。

待PCR产物准备就绪后，我们将这些样品与适量的上样缓冲液混合，以确保它们能够在凝胶电泳中均匀分布并清晰显示。

我们需要控制上样量，避免样品过多导致电泳时间过长或效果不佳。

我们还需要根据乳酸菌的菌落形态和生理特性选择合适的电泳条件和凝胶类型。

对于观察细菌菌落形态的实验，可以选择含有适量交联剂和染色剂的琼脂糖凝胶；而对于分析蛋白质的实验，则可能需要使用聚丙烯酰胺凝胶。

通过调整这些参数，我们可以优化凝胶电泳的效果，从而更准确地展示和分析耐盐乳酸菌的特性。

5. 发酵特性研究
本研究对筛选出的耐盐乳酸菌进行了发酵特性的研究，通过测定不同发酵时间下的乳酸含量，确定了最佳的发酵时间。

在1012小时
的发酵时间内，乳酸产量最高，且随着发酵时间的延长，乳酸产量逐渐增加。

这说明耐盐乳酸菌具有较强的发酵能力。

通过测定不同温度下的乳酸含量，确定了最佳的发酵温度。

在
37C时，乳酸产量最高，且随着温度的升高，乳酸产量逐渐增加。

这说明耐盐乳酸菌在较高温度下仍能保持较高的发酵活性。

还研究了不同pH值对发酵过程的影响。

在pH为7时，乳酸产量最高，且随着pH值的变化，乳酸产量变化不大。

这说明耐盐乳酸菌
对pH值较为敏感，适宜的pH范围为7左右。

通过观察菌落形态和生长速度，分析了耐盐乳酸菌的生长特性。

在适宜的发酵条件下，耐盐乳酸菌呈现出明显的菌落生长和繁殖现象，且生长速度较快。

这说明耐盐乳酸菌具有良好的生长特性。

本研究对东北传统酱腌菜中耐盐乳酸菌的发酵特性进行了详细
的研究，为进一步优化酱腌菜的制作工艺提供了理论依据。

发酵条件优化
温度控制：适当的温度有利于乳酸菌的生长和代谢。

耐盐乳酸菌在较低温度（如XX至XX）下表现出较高的活性，调整发酵缸周围环境的温度，确保发酵过程处于最佳温度范围内。