不同来源嗜水气单胞菌外膜蛋白基因检测及序列分析

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不同来源嗜水气单胞菌外膜蛋白基因检测及序列分析
葛慕湘;张艳英;靳晓敏;房海;陈翠珍
【摘要】Forty - two pathogenicity Aeromonas hydrophila strains isolated from Whitmania pigra, Rana temporaria chens-inensis, Paralkhthys olivaceus, Ctenopharyngodon idellua, Mylopharyngodon piceus and Cyprinus carpio were investigated for the presence of outer membrane protein (OMP) genes using PCR methods in this study, and the homology of OMP genes from diverse representative A. hydrophila strains were compared with available sequences in the NCBI GenBank including four strains of A. hydrophila ( FJ437030. 1, AF183931. 1, AF276639. 2 and
CP000462. 1 ) and one strains of A. sobria (FJ437029. 1) using the soft - ware DNAStar. The results show that all the detective strains contain the OMP gene, the carrier rate is 100% . The OMP genes of seven A. hydrophila strains which were sequenced share 86. 0% ~ 99. 2% nucleotide sequence homology with the reference strains. There is higher homology (98. 3% ~ 100% ) within seven A. hydrophila strains which were isolated from different hosts. Among them, the strain HTQ010505 - 1 isolated from W. pigra display the highest nucleotide (100% ) homology with strains
HL060811 -4 isolated from M. piceus.%采用PCR方法,对分离于发病宽体金线蛭(Whitmania pigra)、中国林蛙(Rana temporaria chensinensis)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、草鱼(Ctenopharyngodon idellua)、青鱼(Mylopharyngodon piceus)、鲤(Cyprinus carpio)的42株致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)进行了外膜蛋白(OMP)基因的检测;将代表菌株的外膜
蛋白基因通过DNAStar软件与GenBank中报道的4株嗜水气单胞菌
(FJ437030.1、AF183931.1、AF276639.2、CP000462.1)和l株温和气单胞菌(A.sobria,FJ437029.1)参考菌株进行了核苷酸同源性比较分析.结果表明,所检不同来源嗜水气单胞菌的OMP基因携带率为100%;所测代表菌株的OMP基因与参考菌株的同源性在86.0%~ 99.2%之间.所测得的不同来源嗜水气单胞菌OMP基因的同源性98.3%~100%,其中分离于宽体金线蛭的HTQ010505-1与青鱼的HL060811-4两菌株间同源性高达100%.
【期刊名称】《淡水渔业》
【年(卷),期】2013(043)002
【总页数】5页(P75-79)
【关键词】嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila);外膜蛋白基因;序列分析
【作者】葛慕湘;张艳英;靳晓敏;房海;陈翠珍
【作者单位】河北科技师范学院,河北省预防兽医学重点实验室,河北昌黎066600【正文语种】中文
【中图分类】S917.4;Q789
嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是危害鱼类、两栖类、爬行类和哺乳类动物的一种革兰氏阴性条件致病菌,可引起细菌性败血症、腹水病、腐皮病等多种疾病,给多种淡水养殖动物带来严重威胁[1]。

目前,开展免疫预防是控制鱼类嗜水气单胞菌感染暴发的重要手段,国内外学者已在其疫苗研发方面做了大量的工作[2-4],但因嗜水气单胞菌血清型多,对异种血清型菌株的免疫预防效果都不太
理想,难以大范围推广使用,嗜水气单胞菌的抗原多样性已成为开发有效疫苗的主要障碍[5]。

因此,寻找嗜水气单胞菌的共同保护性抗原是研制高效疫苗及筛选疫苗生产菌株的关键。

外膜蛋白(Outer membrane protein,OMP)是革兰阴性菌外膜的主要结构,在细菌的物质运输、形态维持和有关物质合成方面起着重要作用。

有研究表明细菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性,可激发机体的体液免疫,并可引发细胞免疫[6-7],且具有在异种血清型间一定的免疫交叉保护性,是一种潜在的共同保护性抗原[8]。

本研究对不同来源的42株致病性嗜水气单胞菌的外膜蛋白基因进行了检测,并分析了代表菌株的OMP基因序列,为研制嗜水气单胞菌引起的鱼类病害基因工程类疫苗提供科学依据。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源
42株嗜水气单胞菌,由河北科技师范学院、河北省预防兽医学重点实验室近些年来分离于不同水产养殖动物,其致病性、主要形态特征、理化特性等已做过较系统的研究,部分研究成果以论文形式公开发表[9-11]。

42株菌株的具体来源、株数、编号等见表1。

表1 供试菌株来源与编号Tab.1 The origin and number of tested strains登录号宽体金线蛭Whitmania pigra 10 HTQ010505-1至HTQ010505-10 HTQ010505-1(AY987394)来源株数编号代表菌株及16S rRNA GenBank中国林蛙Rana temporaria chensinensis 11 HQ070610A-1,HQ070610A-2;HQ070610B-1至HQ070610B-9 HQ070610A-1(GQ470995)HQ070610B-1(GQ470996)牙鲆Paralichthys olivaceus 10 HC010916B-1至HC010916B-10 HC010916B-1(AY827493)草鱼Ctenopharyngodon idellua 7
HC960715-1至HC960715-5;HL060811-1,HL060811-2 HL060811-
1(EF645798)青鱼Mylopharyngodon piceus 2 HL060811-3,HL060811-4 HL060811-3(EF645799)鲤鱼Cyprinus carpio 2 HC060718-1,HC060718-2 HC060718-1(EF669478)
1.1.2 引物
外膜蛋白引物参照胡靖等[12]引物,由上海生物工程有限公司合成。

引物序列为:上引物5’-GCT ATC CCG GCT CTG TTC GCA TCT-3’;下引物5’-CAG CAG GGT TTC GTC AAG CAG GTC-3’。

1.1.3 主要试剂及培养基
细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京赛百盛基因技术有限公司;DNA Marker DM2000及2×Taq Master Mix购自北京康为世纪生物科技有限公司;优质琼脂糖购自上海华美生物工程公司;LB培养基等按常规方法制备。

1.2 DNA模板的制备
将42株嗜水气单胞菌分别接种于LB平板于28℃培养24 h,各挑取1个菌落移接于LB肉汤,经28℃、110 r/min振荡培养16 h左右,按北京赛百盛基因技术有限公司生产的树脂型TM基因组DNA提取试剂盒说明所述方法提取DNA作为PCR模板DNA。

1.3 外膜蛋白基因的检测
随机选取不同来源嗜水气单胞菌各1株,以58℃为中心温度,以±5℃做梯度PCR,根据在1%琼脂糖凝胶电泳检测结果选择最适温度作为退火温度进行PCR 扩增。

PCR反应体系为25 μL:2× Taq Master Mix 12.5 μL,上下游引物各 0.5 μL,去离子水9.5 μL,DNA模板2 μL。

反应条件为:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,60℃退火50 s,72℃延伸 1.5 min,共 35个循环;最后72℃延伸10 min。

用1%琼脂糖凝胶电泳检测结果。

对没有出现预期条带的菌株,退火温度以58℃为中心温度,±5℃为幅度再做梯度
PCR,再次无预期带出现者视为无目的基因。

1.4 外膜蛋白基因序列分析
根据琼脂糖凝胶电泳检测结果,从各来源菌中分别选取菌株作为代表菌株,对其PCR产物由上海生物工程公司进行直接测序。

采用
Blast(/)和 DNAStar软件进行序列同源性分析,并构建进化树。

进行测序的代表菌株见表2。

表2 不同来源嗜水气单胞菌测序代表菌株Tab.2 The representative strains which were sequenced来源宽体金线蛭中国林蛙牙鲆草鱼青鱼鲤鱼代表HTQ010505-1 HQ070610B-2 HQ070610B-7 HC010916B-4 HC960715-4 HL060811-4 HC060718-2
2 结果
2.1 不同来源嗜水气单胞菌外膜蛋白基因检测结果
以42株分离于不同水产养殖动物的致病性嗜水气单胞菌DNA为模板,经PCR扩增,均扩增出大小约933bp的特异性条带,与预期产物大小相符(代表菌株电泳条带见图1),表明各来源菌株外膜蛋白基因的携带率为100%。

图1 代表菌株OMP基因PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification result of OMP genes of representative strains
2.2 不同来源嗜水气单胞菌外膜蛋白基因同源性分析
将所扩增的不同来源嗜水气单胞菌代表菌株OMP基因,通过Blast与GenBank 中公布的5株参考菌株OMP基因进行同源性比较,其中包括4株嗜水气单胞菌(登录号为 FJ437030.1、AF183931.1、AF276639.2、CP000462.1)和1株温和气单胞菌(A.sobria,登录号为FJ437029.1)。

结果所测代表菌株的OMP基因,与上述参考菌株同源性在86.0%~99.2%之间。

本试验所测得的不同来源嗜水气单胞菌株之间OMP基因的同源性在98.3%~100%,其中分离于青鱼的
HL060811-4与宽体金线蛭的HTQ010505-1两菌株间同源性高达100%(图2)。

图2 代表菌株与参考菌株的OMP基因序列比较Fig.2 The comparison of OMP gene sequences between representative strains and reference strains 图3 代表菌株与参考菌株OMP基因的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on OMP gene sequences of representative strains and reference strains
将所测得的7个代表菌株OMP基因与Gen-Bank中的公布的4株嗜水气单胞菌和1株温和气单胞菌参考菌株,采用DNAStar软件构建遗传发育系统进化树(如图3)。

结果显示,除AF183931株外,所测供试各代表菌株与其他参考菌株同为一支。

其中分离于鲤鱼的HC060718-2菌株与除AF183931.1外的其他4株参考菌聚于同一分支。

供试的7株代表菌中,分离自草鱼的HC960715-4菌株与分离自青鱼的HL060811-4、宽体金线蛭的HTQ010505-1菌株处于同一分支;牙鲆源的HC010916B-4与林蛙源的 HQ070610B-2、HQ070610B-7菌株处于同一分支。

3 讨论
嗜水气单胞菌的保护性抗原很多,如S层蛋白、外膜蛋白、蛋白酶等,其中外膜蛋白是革兰氏阴性菌外膜的主要成分,在维持外膜结构,保证物质运输,参与F 因子接合并作为大肠杆菌素和噬菌体受体等方面均起重要作用[13]。

已有的研究初步表明,在嗜水气单胞菌不同血清型菌株间发现存在有相同的 OMP成分[14]。

本试验检测鱼源、蛙源、水蛭源的42株嗜水气单胞菌,发现均含有OMP基因,并且同源性极高(98.3% ~100%),进一步证实了OMP在致病性嗜水气单胞菌中广泛存在,是其共同的保护性抗原。

从图3的系统发育树中我们可以看出,淡水鱼源(鲤HC060718-2、青鱼HL060811-4、草鱼HC960715-4)嗜水气单胞菌的OMP基因聚为一支,而与海水鱼源(牙鲆HC010916B-4)的处于不
同分支。

海水与淡水相比,盐度存在较大差异,可能导致了嗜水气单胞菌间OMP 基因发生了这种微小差异。

另外,不同来源嗜水气单胞菌OMP基因具有如此高的同源性,其中青鱼源的HL060811-4与宽体金线蛭源HTQ010505-1菌株间的同源性高达100%,也说明这些致病性嗜水气单胞菌有可能在淡水鱼、海水鱼、中国林蛙、宽体金线蛭间水平传播。

已有报道通过基因工程表达的外膜蛋白具有良好的免疫原性和保护作用[3]。

Khushiramani等(2007)在大肠杆菌中表达和纯化了ompTS蛋白,3次增强免疫小鼠后抗体滴度达到了1:64 000[15]。

本试验的研究结果必将对研制嗜水气单胞菌共同的高效疫苗具有一定的参考意义。

按OMP在菌细胞中的拷贝数高低可分为主要蛋白和微量蛋白,而主要蛋白包括外膜A蛋白(OmpA)、微孔蛋白(Porins)、脂蛋白(Lpp)[16]。

具有与本研究所克隆的OMP基因相似性较高的菌株,在GenBank中有5株,4株嗜水气单胞菌和1株温和气单胞菌,其中CP000462.1株为OMP的全基因系列,FJ437029.1和FJ437030.1株为未表明归属的OMP部分序列,AF183931.1株为ompⅡ基因,AF276639.2株为ompTS基因。

ompII是从分离自虹鳟(Oncorhynchus mykiss)的嗜水气单胞菌(Ah65)中得到的一种39kDa的外膜蛋白,具有孔道形成性质,与大肠杆菌(Escherichia coli)的孔蛋白OmpF、OmpC和PhoE的功能相似。

ompTS基因是根据已发表的外膜蛋白基因ompⅡ的核苷酸序列设计引物,从中华鳖源嗜水气单胞菌中扩增所得,具备与孔蛋白相似的性质[17]。

本研究所克隆的OMP基因与ompⅡ同源性为86.0% ~86.9%,与ompTS同源性高达98.1% ~98.9%,因此,认为本研究所克隆的外膜蛋白基因应属于微孔蛋白PorinⅡ家族的外膜蛋白基因。

PorinⅡ较为广泛地存在于嗜水气单胞菌中,可激活补体经典途径(C1q)[18]。

关于这些菌株OMP基因的表达情况有待进一步研究。

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