RhoA激酶的硫巯基化修饰在硫化氢抗大鼠神经细胞缺氧性损伤中的作用
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中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBulletin 2021Jul;37(7):979-84
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网络出版时间:2021-6-1712:19 网络出版地址:https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20210616.1416.036.html
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中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBulletin 2021Jul;37(7)
号:20200820;二硫 苏 糖 醇 (DTT),购 自 阿 拉 丁 试 剂 有限公司,批号:D8220。 1.2 仪器 流式细胞仪(美国 BD公司);凝胶电泳 仪和电泳槽 (美国 BIORAD公司);TGL16H超速 冷冻离心机(珠海黑马仪器有限公司);细胞培养箱 (美国 Thermo公司) 1.3 动物 SPF级 SD大鼠新生鼠,购自安徽医科 大学实验动物中心,实验动物合格证号:SCXK(皖) 2017001。 1.4 方法 1.4.1 原代培养大鼠海马神经细胞[10] 取新生 24 h内的 SD大鼠,在麻醉状态下断头取脑并剥离海马 组织,0.125%胰酶液消化 20min,加入 10% FBS的 DMEM/F12完全培 养 基,巴 氏 吸 管 将 组 织 吹 散,70 μm细胞过滤器过滤,1000r·min-1常温离心 5min 并留沉淀。加入完全培养基重悬细胞,调整细胞数 目为 1×107个·L-1,接种于预先用多聚赖氨酸包 被好的 6孔板中,24h后用专用培养基(Neurobasal +2% B27+05mmol·L-1 Lglutamine+1%青霉 素 -链霉素溶液)半量换液,每隔 3d全量换液。
mLHENS缓冲液吹打溶解,加入 50μL链霉亲和素 琼脂糖珠,室温避光放置 24h。再 12000r·min-1 离心 2min后弃上清,用 HENS缓冲液重悬琼脂糖 珠并反复离心洗涤 3次,用洗脱缓冲液洗脱琼脂糖 珠后得到纯化的硫巯基化蛋白。 1.4.3 ROCK2 或 硫 巯 基 化 ROCK2(SSHROCK2) 的蛋白含量检测 神经元总蛋白或硫巯基化蛋白中 的 ROCK2含量分别用 Westernblot法测定。将 100 μg的总蛋白或硫巯基化蛋白置 100℃ 变性后,在 12% SDS聚丙稀酰胺凝胶中电泳后将蛋白转膜至 PVDF膜。5%脱脂牛奶中封闭 15h,ROCK2 一抗 孵育过 夜。次 日 加 入 HRP标 记 的 二 抗 孵 育 1h。 TBST洗膜后用 ECL化学发光显色液显影并拍照以 兔抗 βactin多克隆抗体为内参照,ImageJ进行灰 度值分析。 1.4.4 ROCK2活性检测 将培养 8d的海马神经 元细胞随 机 分 为 NS对 照 组 和 NaHS(200μmol· L-1)组。NaHS或生理盐水处理 24h后,将 NaHS组 进行硫巯基化蛋白分离纯化。采用 Westernblot法 定量分析各组 ROCK2蛋白的浓度,以灰度值的比值 来调整 ROCK2 蛋白的浓度,待浓度一致后再进行 ROCK2活性检测。将蛋白样品加入到 96孔板中, 并设置空白孔和标准孔,按试剂盒说明书进行操作, 以空白孔调零,450nm波长测吸光度。 1.4.5 神经细胞缺氧复氧损伤模型的建立 将原 代海 马 神 经 细 胞 随 机 分 为 正 常 对 照 组、模 型 组、 NaHS(50、100、200μmol·L-1)组、硫巯基化抑制剂 DTT组以及 NaHS(200μmol· L-1)+DTT组。除 正常对照组外,细胞预处理 24h后弃去培养基加入 缺氧液,置于 90% N2 -10% CO2 三气培养箱中孵 育 4h,再更换成完全培养基置于正常三气培养箱 (37℃、5%CO2)孵育 12h,进行后续实验。 1.4.6 CCK8法检测细胞活力 取缺氧 4h/复氧 12h铺满 96孔板(100μL/孔)的神经元,每孔加入 10μLCCK8试剂,培养箱中孵育 1h后用酶标仪测 定 450nm处的吸光度,计算细胞活力。 1.4.7 检测培养上清中 LDH、NSE水平 使用试 剂盒检测细胞培养上清中 LDH和 NSE活性。 1.4.8 细胞凋亡检测 将细胞用不含 EDTA的胰 酶消化吹打分离出后,加入 1∶3稀释的结合缓冲 液。将 5μLAnnexinV和 10μL碘化丙啶(PI)加入 100μL细胞悬液中避光放置 5min,立即检测各组 凋亡率。 1.4.9 数据分析 使用 GraphpadPrism8软件对 数据进行分析,采用 t检验进行两组间比较,单因素
关键词:硫பைடு நூலகம்氢;ROCK2;硫巯基 化;缺 氧 复 氧 损 伤;细 胞 凋 亡;DTT
开放科学(资源服务)标识码(OSID):
硫巯基化(S-sulfhydration)是继乙酰化(acety lation)和磷酸化 (phosphorylation)等之后发现的一 种新的蛋白质翻译后修饰方式[1],硫巯基化修饰可 以被 二 硫 苏 糖 醇 (dithiothreitol,DTT)等 还 原 剂 抑 制[2]。
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方差分析(onewayANOVA)进行多组间比较,数据 均以 x珋±s表示。 2 结果 2.1 原代培养大鼠海马神经元的鉴定 取生长 8d 的大鼠海马细胞,用神经元特异性标志物 MAP2免 疫荧光法进行细胞鉴定。如 Fig1所示,原代培养的 细胞的细胞核被 DAPI染成蓝色,和阴性对照组相 比,胞体和轴突经 MAP2抗体染色呈绿色荧光,结果 表明所培养的大鼠海马细胞为神经元。 2.2 NaHS对大鼠海马神经元 H/R损伤的影响 2.2.1 NaHS对细胞活力及 LDH和 NSE活性的影 响 如 Fig2A所示,与正常对照组相比,H/R模型 组细胞活 力 显 著 降 低 (P<001),而 给 予 外 源 性 H2S供体 NaHS100和 200μmol· L-1可显著提高 H/R损伤导致的细胞活力降低(P<001,与模型组 相比);Fig2B和 Fig2C显示,相比正常对照组,H/ R模型组细胞上清中 LDH和 NSE活性有明显提高, 提示 H/R损伤细胞致 NSE和 LDH漏出增多。相比 模型组,100和 200μmol·L-1NaHS可降低 H/R导 致的神经细胞 LDH和 NSE的漏出 (P<001),50
硫化氢(hydrogensulfide,H2S)是机体内一种重 要的气体 信 号 分 子[3],与 多 种 生 理 及 病 理 过 程 有 关。H2S具有抗神经细胞凋亡、抗炎症反应、保护血 脑屏障等效 应 [4]。 有 研 究 表 明,H2S可 通 过 硫 巯 基 化修饰靶蛋白的半胱氨酸残基,使半胱氨酸的 -SH 基团转化为 -SSH或过硫酸盐基团,改变靶蛋白的 生物学功能,如 H2S硫巯基化修饰 ATP敏感性钾离 子(KATP)通 道 蛋 白 的 半 胱 氨 酸 残 基,进 而 影 响 该 通道开放[5]。
RhoARho激酶(Rhoassociatedcoiledcoilform ingproteinkinase,ROCK)信号转导通路是机体内一 种与细胞的生长、增殖和分化等功能有关的信号通 路,与高血压和缺血性脑损伤等血管性疾病密切相 关。ROCK属于丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶家族成员, 有 ROCK1和 ROCK2两种亚型,ROCK2 主要表达在 大脑、心脏和肌肉中[6]。有研究表明 ROCK2激活促 进缺血性神经元损伤,而抑制 ROCK2活性或者降低 ROCK2 蛋白表达,可减轻 神 经 元 损 伤 [7]。 我 们 前 期 研究发现 H2S对小鼠脑缺血损伤具有明显保护作 用,并可抑制小鼠脑血管平滑肌细胞中 ROCK2 活 性[8]。但是,H2S抑制 ROCK2活性的机制至今未见 明确报道。鉴于 ROCK2 分子结构中的半胱氨酸富 集的锌指样结构域(cysteinerichzinefingerlikemo tifdomain,CRD)中 富 含 半 胱 氨 酸 残 基[9],H2S是 否 通过硫巯基化修饰来抑制神经细胞中 ROCK2 活性 抗神经细胞 H/R损伤?因此,本研究拟探讨 H2S是 否可通过抑制 ROCK2对大鼠神经细胞 H/R损伤产 生保护作用及其 ROCK2 抑制作用的硫巯基化修饰 机制。 1 材料与方法 1.1 药品与试剂 ROCK2抗体,购自 Abcam公司, 批号:125025;NaHS,购 自 Sigma公 司,批 号:#SH BF1746V;链霉亲和素琼脂糖珠,购自北京博尔西科 技有限公司,批号:B190319;ROCK2 活性试剂盒,购 自江苏酶免实业有限公司,批号:0069R1;BiotinHP DP,购 自 APExBIO公 司,批 号:A800831337769;细 胞凋亡试剂 盒,购 自 北 京 四 正 柏 生 物 有 限 公 司,批
收稿日期:2021-02-06,修回日期:2021-04-15 基金项目:国家自然科学基金面上项目(No81973510,81374002) 作者简介:谢伟明(1993-),男,硕 士 生,研 究 方 向:心 血 管 药 理 学,
Email:1570700053@qq.com; 郭 岩(1978-),女,副 教 授,硕 士 生 导 师,研 究 方 向:心 血管药理学,通讯作者,Email:guoyanzx@126.com
取培养 8d的海马神经元细胞,用 4%的多聚甲 醛室温固定 10min,PBS溶液清洗后,加 0.3% Tri tonx100放置 30min。弃掉 Tritonx100,清洗 3遍, 滴加 10%山羊血清工作液封闭 30min。加 1∶100 稀释的一抗 MAP2,4℃放置过夜,次日清洗后滴加 同样稀释倍数的 FITC标记山羊抗兔 IgG(H+L)荧 光二抗,室温避光放置 1h,于激光共聚焦显微镜下 观察拍照,进行海马神经元细胞的鉴定。 1.4.2 硫巯基化蛋白的分离纯化 采用改良生物 素转换法[1]分离纯化硫巯基化蛋白。在培养 8d的 海马神经元细胞中分别加入 50、100、200μmol·L-1 NaHS或等体积的生理盐水(NS)培养 24h后,调节 细胞悬液为每 mL含有 1×105个神经元,取 500μL 细胞悬液置于 6孔培养板中,加入 100μL的蛋白裂 解液,置冰盒上裂解 30min,离心取上清并进行蛋白 定量。将 200μL上清液加入 2mL离心管中,再加 入 800μL甲基硫代磺酸甲酯 (Methylmethanethio sulfonate,MMTS)和 HENS缓冲液配制的终止缓冲 液,50℃ 恒温水浴 30min,封闭剩余的游离巯基。 加入 1mL -20℃预冷的丙酮静置 30min后 15000 r·min-14℃离心 20min。加入 1mLHENS缓冲液 将留下的沉淀吹打溶解。再加入 250μLBiotinHP DP工作液混匀,室温避光放置过夜。次日再加满 - 20℃预冷的丙酮,-20℃冰箱中静置 30min,立即 12000r·min-14℃离心 20min,弃上清。加入 1
RhoA激酶的硫巯基化修饰在硫化氢抗大鼠 神经细胞缺氧性损伤中的作用
谢伟明,陈志武,郭 岩
(安徽医科大学药理学教研室,安徽 合肥 230032)
doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2021.07.017 文献标志码:A 文章编号:1001-1978(2021)07-0979-06 中 国 图 书 分 类 号:R332;R32281;R32925;R34557; R4429;R84522 摘要:目的 研究 RhoA激酶 2(ROCK2)的硫巯基化修饰在 硫化氢(H2S)抗 大 鼠 神 经 细 胞 缺 氧 性 损 伤 中 的 作 用。方 法 原代培养大鼠海马神经细胞,给予硫氢化钠(NaHS)和硫 巯基化抑制剂二硫苏糖醇 DTT预处理,构建细胞缺氧复氧 模型。检测细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)和神经特异性烯醇 化酶(NSE)活性以及细胞凋亡。纯化神经细胞中硫巯基化 蛋白,检测 ROCK2和硫巯基化修饰 ROCK2(SSHROCK2)蛋 白表达以及活性。结果 100、200μmol·L-1 NaHS明显提 高缺氧复氧神经细胞的活力、降低上清中 LDH和 NSE活性、 减少细胞凋亡,提示 NaHS的神经保护作用;但是 DTT可减 弱 NaHS对缺氧复氧神经细胞的保护作用。此外,100、200 μmol·L-1NaHS可减少海马神经细胞中 ROCK2 蛋白表达, 并通过增加 ROCK2 蛋白硫巯基化修饰而降低 ROCK2 蛋白 活性。结论 H2S对大鼠海马神经元 H/R损伤有明显的保 护作用,其 机 制 与 硫 巯 基 化 修 饰 致 ROCK2 活 性 降 低 及 ROCK2 蛋白表达减少有关。
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网络出版时间:2021-6-1712:19 网络出版地址:https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20210616.1416.036.html
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中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBulletin 2021Jul;37(7)
号:20200820;二硫 苏 糖 醇 (DTT),购 自 阿 拉 丁 试 剂 有限公司,批号:D8220。 1.2 仪器 流式细胞仪(美国 BD公司);凝胶电泳 仪和电泳槽 (美国 BIORAD公司);TGL16H超速 冷冻离心机(珠海黑马仪器有限公司);细胞培养箱 (美国 Thermo公司) 1.3 动物 SPF级 SD大鼠新生鼠,购自安徽医科 大学实验动物中心,实验动物合格证号:SCXK(皖) 2017001。 1.4 方法 1.4.1 原代培养大鼠海马神经细胞[10] 取新生 24 h内的 SD大鼠,在麻醉状态下断头取脑并剥离海马 组织,0.125%胰酶液消化 20min,加入 10% FBS的 DMEM/F12完全培 养 基,巴 氏 吸 管 将 组 织 吹 散,70 μm细胞过滤器过滤,1000r·min-1常温离心 5min 并留沉淀。加入完全培养基重悬细胞,调整细胞数 目为 1×107个·L-1,接种于预先用多聚赖氨酸包 被好的 6孔板中,24h后用专用培养基(Neurobasal +2% B27+05mmol·L-1 Lglutamine+1%青霉 素 -链霉素溶液)半量换液,每隔 3d全量换液。
mLHENS缓冲液吹打溶解,加入 50μL链霉亲和素 琼脂糖珠,室温避光放置 24h。再 12000r·min-1 离心 2min后弃上清,用 HENS缓冲液重悬琼脂糖 珠并反复离心洗涤 3次,用洗脱缓冲液洗脱琼脂糖 珠后得到纯化的硫巯基化蛋白。 1.4.3 ROCK2 或 硫 巯 基 化 ROCK2(SSHROCK2) 的蛋白含量检测 神经元总蛋白或硫巯基化蛋白中 的 ROCK2含量分别用 Westernblot法测定。将 100 μg的总蛋白或硫巯基化蛋白置 100℃ 变性后,在 12% SDS聚丙稀酰胺凝胶中电泳后将蛋白转膜至 PVDF膜。5%脱脂牛奶中封闭 15h,ROCK2 一抗 孵育过 夜。次 日 加 入 HRP标 记 的 二 抗 孵 育 1h。 TBST洗膜后用 ECL化学发光显色液显影并拍照以 兔抗 βactin多克隆抗体为内参照,ImageJ进行灰 度值分析。 1.4.4 ROCK2活性检测 将培养 8d的海马神经 元细胞随 机 分 为 NS对 照 组 和 NaHS(200μmol· L-1)组。NaHS或生理盐水处理 24h后,将 NaHS组 进行硫巯基化蛋白分离纯化。采用 Westernblot法 定量分析各组 ROCK2蛋白的浓度,以灰度值的比值 来调整 ROCK2 蛋白的浓度,待浓度一致后再进行 ROCK2活性检测。将蛋白样品加入到 96孔板中, 并设置空白孔和标准孔,按试剂盒说明书进行操作, 以空白孔调零,450nm波长测吸光度。 1.4.5 神经细胞缺氧复氧损伤模型的建立 将原 代海 马 神 经 细 胞 随 机 分 为 正 常 对 照 组、模 型 组、 NaHS(50、100、200μmol·L-1)组、硫巯基化抑制剂 DTT组以及 NaHS(200μmol· L-1)+DTT组。除 正常对照组外,细胞预处理 24h后弃去培养基加入 缺氧液,置于 90% N2 -10% CO2 三气培养箱中孵 育 4h,再更换成完全培养基置于正常三气培养箱 (37℃、5%CO2)孵育 12h,进行后续实验。 1.4.6 CCK8法检测细胞活力 取缺氧 4h/复氧 12h铺满 96孔板(100μL/孔)的神经元,每孔加入 10μLCCK8试剂,培养箱中孵育 1h后用酶标仪测 定 450nm处的吸光度,计算细胞活力。 1.4.7 检测培养上清中 LDH、NSE水平 使用试 剂盒检测细胞培养上清中 LDH和 NSE活性。 1.4.8 细胞凋亡检测 将细胞用不含 EDTA的胰 酶消化吹打分离出后,加入 1∶3稀释的结合缓冲 液。将 5μLAnnexinV和 10μL碘化丙啶(PI)加入 100μL细胞悬液中避光放置 5min,立即检测各组 凋亡率。 1.4.9 数据分析 使用 GraphpadPrism8软件对 数据进行分析,采用 t检验进行两组间比较,单因素
关键词:硫பைடு நூலகம்氢;ROCK2;硫巯基 化;缺 氧 复 氧 损 伤;细 胞 凋 亡;DTT
开放科学(资源服务)标识码(OSID):
硫巯基化(S-sulfhydration)是继乙酰化(acety lation)和磷酸化 (phosphorylation)等之后发现的一 种新的蛋白质翻译后修饰方式[1],硫巯基化修饰可 以被 二 硫 苏 糖 醇 (dithiothreitol,DTT)等 还 原 剂 抑 制[2]。
中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBulletin 2021Jul;37(7)
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方差分析(onewayANOVA)进行多组间比较,数据 均以 x珋±s表示。 2 结果 2.1 原代培养大鼠海马神经元的鉴定 取生长 8d 的大鼠海马细胞,用神经元特异性标志物 MAP2免 疫荧光法进行细胞鉴定。如 Fig1所示,原代培养的 细胞的细胞核被 DAPI染成蓝色,和阴性对照组相 比,胞体和轴突经 MAP2抗体染色呈绿色荧光,结果 表明所培养的大鼠海马细胞为神经元。 2.2 NaHS对大鼠海马神经元 H/R损伤的影响 2.2.1 NaHS对细胞活力及 LDH和 NSE活性的影 响 如 Fig2A所示,与正常对照组相比,H/R模型 组细胞活 力 显 著 降 低 (P<001),而 给 予 外 源 性 H2S供体 NaHS100和 200μmol· L-1可显著提高 H/R损伤导致的细胞活力降低(P<001,与模型组 相比);Fig2B和 Fig2C显示,相比正常对照组,H/ R模型组细胞上清中 LDH和 NSE活性有明显提高, 提示 H/R损伤细胞致 NSE和 LDH漏出增多。相比 模型组,100和 200μmol·L-1NaHS可降低 H/R导 致的神经细胞 LDH和 NSE的漏出 (P<001),50
硫化氢(hydrogensulfide,H2S)是机体内一种重 要的气体 信 号 分 子[3],与 多 种 生 理 及 病 理 过 程 有 关。H2S具有抗神经细胞凋亡、抗炎症反应、保护血 脑屏障等效 应 [4]。 有 研 究 表 明,H2S可 通 过 硫 巯 基 化修饰靶蛋白的半胱氨酸残基,使半胱氨酸的 -SH 基团转化为 -SSH或过硫酸盐基团,改变靶蛋白的 生物学功能,如 H2S硫巯基化修饰 ATP敏感性钾离 子(KATP)通 道 蛋 白 的 半 胱 氨 酸 残 基,进 而 影 响 该 通道开放[5]。
RhoARho激酶(Rhoassociatedcoiledcoilform ingproteinkinase,ROCK)信号转导通路是机体内一 种与细胞的生长、增殖和分化等功能有关的信号通 路,与高血压和缺血性脑损伤等血管性疾病密切相 关。ROCK属于丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶家族成员, 有 ROCK1和 ROCK2两种亚型,ROCK2 主要表达在 大脑、心脏和肌肉中[6]。有研究表明 ROCK2激活促 进缺血性神经元损伤,而抑制 ROCK2活性或者降低 ROCK2 蛋白表达,可减轻 神 经 元 损 伤 [7]。 我 们 前 期 研究发现 H2S对小鼠脑缺血损伤具有明显保护作 用,并可抑制小鼠脑血管平滑肌细胞中 ROCK2 活 性[8]。但是,H2S抑制 ROCK2活性的机制至今未见 明确报道。鉴于 ROCK2 分子结构中的半胱氨酸富 集的锌指样结构域(cysteinerichzinefingerlikemo tifdomain,CRD)中 富 含 半 胱 氨 酸 残 基[9],H2S是 否 通过硫巯基化修饰来抑制神经细胞中 ROCK2 活性 抗神经细胞 H/R损伤?因此,本研究拟探讨 H2S是 否可通过抑制 ROCK2对大鼠神经细胞 H/R损伤产 生保护作用及其 ROCK2 抑制作用的硫巯基化修饰 机制。 1 材料与方法 1.1 药品与试剂 ROCK2抗体,购自 Abcam公司, 批号:125025;NaHS,购 自 Sigma公 司,批 号:#SH BF1746V;链霉亲和素琼脂糖珠,购自北京博尔西科 技有限公司,批号:B190319;ROCK2 活性试剂盒,购 自江苏酶免实业有限公司,批号:0069R1;BiotinHP DP,购 自 APExBIO公 司,批 号:A800831337769;细 胞凋亡试剂 盒,购 自 北 京 四 正 柏 生 物 有 限 公 司,批
收稿日期:2021-02-06,修回日期:2021-04-15 基金项目:国家自然科学基金面上项目(No81973510,81374002) 作者简介:谢伟明(1993-),男,硕 士 生,研 究 方 向:心 血 管 药 理 学,
Email:1570700053@qq.com; 郭 岩(1978-),女,副 教 授,硕 士 生 导 师,研 究 方 向:心 血管药理学,通讯作者,Email:guoyanzx@126.com
取培养 8d的海马神经元细胞,用 4%的多聚甲 醛室温固定 10min,PBS溶液清洗后,加 0.3% Tri tonx100放置 30min。弃掉 Tritonx100,清洗 3遍, 滴加 10%山羊血清工作液封闭 30min。加 1∶100 稀释的一抗 MAP2,4℃放置过夜,次日清洗后滴加 同样稀释倍数的 FITC标记山羊抗兔 IgG(H+L)荧 光二抗,室温避光放置 1h,于激光共聚焦显微镜下 观察拍照,进行海马神经元细胞的鉴定。 1.4.2 硫巯基化蛋白的分离纯化 采用改良生物 素转换法[1]分离纯化硫巯基化蛋白。在培养 8d的 海马神经元细胞中分别加入 50、100、200μmol·L-1 NaHS或等体积的生理盐水(NS)培养 24h后,调节 细胞悬液为每 mL含有 1×105个神经元,取 500μL 细胞悬液置于 6孔培养板中,加入 100μL的蛋白裂 解液,置冰盒上裂解 30min,离心取上清并进行蛋白 定量。将 200μL上清液加入 2mL离心管中,再加 入 800μL甲基硫代磺酸甲酯 (Methylmethanethio sulfonate,MMTS)和 HENS缓冲液配制的终止缓冲 液,50℃ 恒温水浴 30min,封闭剩余的游离巯基。 加入 1mL -20℃预冷的丙酮静置 30min后 15000 r·min-14℃离心 20min。加入 1mLHENS缓冲液 将留下的沉淀吹打溶解。再加入 250μLBiotinHP DP工作液混匀,室温避光放置过夜。次日再加满 - 20℃预冷的丙酮,-20℃冰箱中静置 30min,立即 12000r·min-14℃离心 20min,弃上清。加入 1
RhoA激酶的硫巯基化修饰在硫化氢抗大鼠 神经细胞缺氧性损伤中的作用
谢伟明,陈志武,郭 岩
(安徽医科大学药理学教研室,安徽 合肥 230032)
doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2021.07.017 文献标志码:A 文章编号:1001-1978(2021)07-0979-06 中 国 图 书 分 类 号:R332;R32281;R32925;R34557; R4429;R84522 摘要:目的 研究 RhoA激酶 2(ROCK2)的硫巯基化修饰在 硫化氢(H2S)抗 大 鼠 神 经 细 胞 缺 氧 性 损 伤 中 的 作 用。方 法 原代培养大鼠海马神经细胞,给予硫氢化钠(NaHS)和硫 巯基化抑制剂二硫苏糖醇 DTT预处理,构建细胞缺氧复氧 模型。检测细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)和神经特异性烯醇 化酶(NSE)活性以及细胞凋亡。纯化神经细胞中硫巯基化 蛋白,检测 ROCK2和硫巯基化修饰 ROCK2(SSHROCK2)蛋 白表达以及活性。结果 100、200μmol·L-1 NaHS明显提 高缺氧复氧神经细胞的活力、降低上清中 LDH和 NSE活性、 减少细胞凋亡,提示 NaHS的神经保护作用;但是 DTT可减 弱 NaHS对缺氧复氧神经细胞的保护作用。此外,100、200 μmol·L-1NaHS可减少海马神经细胞中 ROCK2 蛋白表达, 并通过增加 ROCK2 蛋白硫巯基化修饰而降低 ROCK2 蛋白 活性。结论 H2S对大鼠海马神经元 H/R损伤有明显的保 护作用,其 机 制 与 硫 巯 基 化 修 饰 致 ROCK2 活 性 降 低 及 ROCK2 蛋白表达减少有关。