基质金属蛋白酶及其抑制剂在异常出血子宫内膜中的表达

2019年8月
基质金属蛋白酶及其抑制剂在异常出血子宫内膜中的表达
白建莲1，刘朝阳2，李芳3，申存梅1，魏东林
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（1.陕西省子长县妇幼保健院妇产科，陕西延安，717300；2.陕西省西北妇女儿童医院妇一科，陕西西安，710061；
3.陕西省西北妇女儿童医院妇保科，陕西西安，710061）
摘要：目的分析子宫异常出血（AUB ）患者子宫内膜中前基质金属蛋白酶2（proMMP-2）、MMP-2、基质金属蛋白酶组织抑制因
子1（TIMP-1）的表达及其与性激素浓度的关系。

方法收集2015年1月1日至2017年12月31日在陕西省西北妇女儿童医院
与子长县妇幼保健院就诊的健康妇女和AUB 患者的子宫内膜标本，标本组织由病理学专家在显微镜下评估。

用明胶酶谱法检测proMMP-2、MMP-2蛋白表达水平，逆向酶谱法检测TIMP-1蛋白水平，线性回归分析其表达与组织病理学诊断及性激素浓度的相关性。

结果病例组子宫内膜proMMP-2的表达与雌激素、孕激素水平、内分泌功能障碍的发生相关（P <0.05）。

病例组MMP-2的表达与雌激素、孕激素水平无相关性（P >0.05），但与子宫内膜息肉、内分泌功能障碍、子宫内膜增生的发生相关（P <0.05）。

病例组TIMP-1的表达与激素浓度无相关性。

结论AUB 患者的proMMP-2表达量低于健康女性。

随着出血时间的延长，AUB 患者的MMP-2表达增加，此时雌激素促进proMMP-2的表达上调，但孕激素使其表达下调。

关键词：基质金属蛋白酶；金属蛋白酶抑制剂；子宫内膜；子宫异常出血中图分类号：R711.71文献标志码：A 文章编号：2096-1413(2019)23-0059-03
DOI :10.19347/ki.2096-1413.201923025
作者简介：白建莲（1975-），女，汉族，陕西延安人，副主任医师，学士。

研究方向：围产期保健的研究，妇科内分泌研究。

Expression of matrix metalloproteinases and tissue inhibitor of metalloproteinase
in endometrium of abnormal uterine bleeding
BAI Jian-lian 1,LIU Zhao-yang 2,LI Fang 3,SHEN Cun-mei 1,WEI Dong-lin 1
(1.Obstetrics and Gynecology Department,Zichang County Maternal and Child Care Health Hospital,Yan'an 717300;2.No.1Gynaecology Department,Northwest Women's and Children's Hospital,Xi'an 710061;3.Women Health Care
Department,Northwest Women's and Children's Hospital,Xi'an 710061,China)
ABSTRACT:Objective To analyze the expression of pro-matrix metalloproteinase 2(proMMP-2),MMP-2and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1(TIMP-1)in endometrium of patients with abnormal uterine bleeding (AUB)and their relationship with sex hormone concentration.Methods Endometrial specimens of healthy women and AUB patients were collected from 1January 2015to 31December 2017in Northwest Women's and Children's Hospital and Zichang County Maternal and Child Health Care Hospital.The specimens were evaluated by pathologists under a microscope.The expression levels of proMMP-2and MMP-2protein were detected by gelatin zymography and TIMP-1protein by reverse zymography;linear regression analysis was used to analyze the correlation between its expression and histopathological diagnosis and sex hormone concentration.Results The expression of proMMP-2in the endometrium of the case group was correlated with the levels of estrogen,progesterone and the occurrence of endocrine dysfunction (P <0.05).The expression of MMP-2in the case group was not correlated with the levels of estrogen and progesterone （P >0.05）,but it was correlated with the occurrence of endometrial polyps,endocrine dysfunction and endometrial hyperplasia (P <0.05).The expression of TIMP-1in the case group was not related to hormone concentration.Conclusion The expression of proMMP-2in AUB patients was lower than that in healthy women.With the prolongation of bleeding time,the expression of MMP-2in AUB patients increased,while the expression of proMMP-2was up-regulated by estrogen,but down-regulated by progesterone.KEYWORDS:matrix metalloproteinase;metalloproteinase inhibitor;endometrium;abnormal uterine bleeding
临床医学
异常子宫出血（abnormal uterine bleeding,AUB ）是影响年轻女性生活质量的重要疾病之一[1]，其最常见的原因是子宫肌瘤、子宫内膜息肉、激素失衡、子宫内膜增生和子宫内膜炎，但仍有约40%~50%的AUB 患者出血原因不明[2]。

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs ）能够在自然pH 条件下分解细胞外基质，这对于子宫内膜在正常月经周期中的脱落和再生至关重要[3]。

本研究评估2015年1月1日至2017年12月31日在陕西省西北妇女儿童医院与子长县妇幼保健院就诊的29例AUB 患者子宫内膜中MMP-2及基质金属蛋白酶组织抑
制因子1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1）的表达活性及其与组织病理学诊断、性激素浓度的相关性，以明确导致AUB 患者长期大量出血的病理机制，并指导激素治疗的用法、用量和服药时间，现将具体研究内容报道如下。

1资料与方法
1.1一般资料
选择2015年1月1日至2017年12月31日在陕西省西北妇女儿童医院与子长县妇幼保健院就诊的59例女性为研究对象。

病例组共29例，均为经筛选符合AUB 诊断，阴道不规则出血病程超过半年以上，且未服用激素类药物的患者；排除器质性疾病且无宫内节育器而发生的阴道不规则出血、所有因器质性病变导致阴道出血及服用激素治疗或口服避孕药
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表1两组研究对象的一般资料比较（x⎺±s）
一般资料病例组（n=29）对照组（n=30）年龄（岁）34.15±5.3435.09±6.22 BMI（kg/m2）24.66±5.6922.39±7.31雌激素（pg/mL）94.57±66.9046.90±16.57*孕激素（pg/mL）9.43±4.50 5.51±9.28*注：与病例组比较，*P<0.05。

表2两组研究对象的proMMP-2、MMP-2和TIMP-1表达情况
分析（x⎺±s）
指标病例组（n=29）对照组（n=30）proMMP-20.29±0.400.56±0.59* MMP-20.16±0.120.21±0.30 TIMP-1 2.13±1.71 1.98±1.42
注：与病例组比较，*P<0.05。

表3病例组患者proMMP-2、MMP-2和TIMP-1影响因素的广
义线性回归模型分析[茁（SE）]
因素proMMP-2MMP-2TIMP-1
月经周期
子宫内膜增生-0.143（0.032）–0.113（0.049）*0.029（0.021）分泌期0.617（0.214）#0.526（0.305）0.306（0.060）内分泌功能障碍0.173（0.045）#–0.113（0.048）*0.144（0.052）子宫内膜息肉0.169（0.034）0.180（0.061）#0.211（0.039）诊断
分泌期log孕激素0.151（0.047）#0.180（0.055）0.104（0.039）异常出血期log孕激素-0.042（0.015）*-0.057（0.043）0.063（0.032）分泌期log雌激素-0.180（0.060）#0.169（0.057）-0.205（0.076）异常出血期log雌激素0.059（0.019）#0.129（0.031）0.097（0.022）激素
异常出血期（月经期除外）0.021（0.010）0.003（0.001）*0.010（0.011）增殖期0.426（0.063）0.382（0.247）0.321（0.048）
者。

对照组共30例，均为与病例组年龄相当且月经正常的妇女。

所有研究者均已婚且有分娩或流产史。

本研究分别经西北妇女儿童医院与子长县妇幼保健院伦理委员会批准，所有研究对象在纳入试验前均被详细告知本研究的目的和研究方法，并签署了知情同意书。

1.2方法
1.2.1收集标本。

对照组研究对象在月经周期增殖期（第8~13天）或分泌期（第18~25天）进行子宫内膜取材，病例组患者在第一次就诊时获得样本，将同一标本分成两部分，一部分标本立即冷冻于液氮中保存，另一部分浸入4%甲醛溶液固定、脱水、石蜡包埋、5μm连续切片备用，拟行组织病理学检查。

在获取两组研究对象子宫内膜组织当天评估雌激素和孕激素水平，通过明胶酶谱法检测前基质金属蛋白酶2（pro-matrix metalloproteinase2,proMMP-2）、MMP-2，逆向酶谱法检测TIMP-1的表达[4]。

1.2.2实验试剂与主要仪器。

MMP-2活性检测试剂盒购于上海信帆生物科技有限公司。

1.2.3明胶酶谱法测proMMP-2和MMP-2。

具体如下。

1〇子宫内膜组织匀浆制备。

取子宫内膜组织于冷匀浆缓冲液中超声震荡20s，离心5min（12000rpm，4℃），取上清液加1/10体积的1%TritonX-100于-20℃保存。

2〇proMMP-2与MMP-2表达水平检测。

聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后，将底物胶用漂洗缓冲液（TritonX-100）充分洗涤后孵育18h。

结束后用考马斯亮蓝R-250染色、脱色，用图像分析仪进行灰度扫描。

1.2.4逆向酶谱法检测TIMP-1的活性。

聚丙烯酰胺凝胶电泳后置于TritonX-100溶液中洗涤，再置于含重组人TIMP-1标准品的酶孵育缓冲液中孵育，而后染色、脱色，进行图像扫描分析。

TIMP-1的抑制活性表现为背景清晰的蓝色条带。

1.2.5组织病理学检查。

对固定好的子宫内膜组织进行石蜡包埋，然后切片，HE染色。

所有切片由2名病理学专家观察和评估。

1.3统计学方法
采用SPSS18.0统计学软件进行数据分析，计数资料用n/%表示，用χ2检验，计量资料用x⎺±s表示，用t、秩和检验，激素水平采用log转换，病例组患者proMMP-2、MMP-2和TIMP-1的影响因素采用广义线性回归模型分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果
2.1两组研究对象的一般资料比较
两组研究对象的年龄、BMI比较，差异不具有统计学意义（P>0.05）；病例组的雌激素、孕激素水平高于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。

见表1。

2.2两组研究对象的组织病理学结果及proMMP-2、MMP-2和TIMP-1表达情况分析
对照组子宫内膜组织病理形态与月经周期相一致，18例为增殖期，12例为分泌期。

病例组组织病理学结果为子宫内膜复合性增生8例，子宫内膜不典型增生7例，单纯性子宫内膜增生6例，激素功能障碍3例，子宫颈息肉5例。

病例组的proMMP-2表达量低于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）；两组的MMP-2和TIMP-1表达量比较，差异不具有统计学意义（P>0.05）。

见表2。

2.3病例组患者proMMP-2、MMP-2和TIMP-1影响因素的广义线性回归模型分析
与增殖期和异常出血期相比，分泌期与proMMP-2表达相关（P<0.01）。

proMMP-2表达水平与雌激素和孕激素水平之间的相关性因周期不同而异。

异常出血期雌激素水平增加，proMMP-2的表达增加，而在分泌期则降低。

异常出血期孕激素水平升高，proMMP-2表达减少，而在分泌期则升高。

与其他AUB患者比较，内分泌功能障碍的发生与proMMP-2表达相关（P<0.01）。

MMP-2在各月经周期内表达稳定，在分泌期升高趋势不明显，在异常出血期，其表达量增加。

MMP-2水平的表达与雌激素和孕激素水平无相关性（P>0.05），但与子宫内膜息肉、内分泌功能障碍、子宫内膜增生的发生相关（P<0.05）。

TIMP-1在月经周期和异常出血两阶段的表达相似，在不同组织病理学诊断的患者中无显著差异，也与激素水平无关。

见表3。

注：*P<0.05；#P<0.01。

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3讨论
MMPs水平可以在一定程度上影响AUB病理生理发展过程，通过研究类固醇激素浓度与AUB患者MMPs活性的相关性，有助于进一步明确长期异常出血的病理机制，并用于指导激素治疗的用法、用量和服药时间，从而制定更好的个体化治疗方案[5]。

MMPs是细胞外基质降解的关键酶，MMPs在子宫内膜通过自分泌和旁分泌等途径受到性激素、细胞因子、蛋白酶及维生素A代谢产物等调控，并在多种病理生理过程中起到关键调节作用[3]，例如MMPs可以通过调节子宫内膜细胞外基质的降解而促进月经来潮[6]。

生理条件下，以孕激素为主的性激素浓度降低可促进MMP-1、MMP-3、MMP-9表达上调，从而促进子宫内膜组织的降解，引发月经来潮[7]。

相反，TIMP-1和TIMP-2在出血周期中达到最高水平，继而促进子宫黏膜组织愈合，停止出血[8-9]。

MMP-2主要通过对广泛存在于组织细胞膜中的Ⅳ型胶原的降解来实现其对细胞膜稳定性的调控作用[10]。

既往研究证实了MMP-2的复杂分泌和活化机制[11]。

本研究结果表明，性激素浓度通过proMMP-2间接影响MMP-2的表达。

异常出血时MMP-2的表达量高于增殖期和分泌期且随出血时间延长而增加，与激素水平无相关性，提示其可能受旁分泌因子的作用。

由于proMMP-2和MMP-2表达水平缺乏相关性，提示两者可能遵循不同的调控机制。

有研究显示，与对照组相比，病例组子宫内膜组织更容易发生与息肉相关的病理学改变，发生率约73%，且AUB患者中MMP-2表达升高[11]。

有研究认为MMP-2与异常血管生成的相关性导致其对AUB患者的子宫内膜息肉增生起促进作用[12]。

本研究结果显示，雌激素浓度与proMMP-2的表达显著相关，而孕激素则降低proMMP-2表达，这一结果与TOKYOL 等[12]的研究相一致。

在生理条件下TIMP-1表达的增加由诱导月经来潮的类固醇激素浓度快速下降引起[13]，然而关于TIMP-1在AUB患者子宫内膜中的作用研究较少，已有研究发现月经期子宫内膜TIMP-1表现出强烈的异质性表达，可能与抑制蛋白酶活性和子宫内膜再生相关[14]。

本研究结果显示，TIMP-1在异常出血的子宫内膜中表达没有明显增加，该结果亦证实AUB患者体内雌激素浓度与TIMP-1蛋白表达及出血时间长短没有相关性，与BRENNER等[9]及VINCENT等[15]的研究结果一致。

本研究发现AUB与雌激素和孕激素浓度的快速降低没有关系，与正常女性月经周期相比，AUB患者TIMP-1水平亦缺乏差异性，但TIMP-1活性可能决定了AUB 持续时间。

这些结果表明MMPs与TIMP比值在维持子宫内膜完整性和异常出血的病理机制中的重要性。

根据本研究的结果，可提出以下假设：采用孕激素治疗因激素紊乱引起的AUB，其原理为减少出血期间MMP-2活性并刺激TIMP-1活性，从而促进子宫内膜修复。

这为临床治疗探索了一种新的途径，但尚需要进一步完成多中心前瞻性随机对照临床研究才能证实这一设想。

综上所述，AUB患者子宫内膜的proMMP-2和MMP-2活性无相关性。

出血时proMMP-2的表达受类固醇激素浓度影响而升高，且其水平在激素性子宫内膜异常的患者中显著升高，但MMP-2的表达与雌激素和孕激素水平无相关性，其表达随出血时间的延长而增加，提示两者活化途径可能不同。

AUB患者子宫内膜中TIMP-1的表达不受激素水平、出血时间长短或组织病理学原因的影响，提示在短期出血的情况下通过孕激素治疗激素紊乱引起的AUB可能有一定效果。

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