上海科华HBsAg-ELISA两步法

1、检验申请
单独检验项目申请：乙型肝炎病毒表面抗原（缩写HBsAg）测定；组合项目申请：肝炎标志物检查组合。

临床医生根据需要提出检验申请。

2、样本采集与处理
2.1 样本采集
2.1.1 常规静脉采血约2ml，不抗凝，置普通试管中，或采用含分离胶的真空采血管。

也可采集血浆，用肝素、EDTA或枸橼酸盐抗凝。

2.1.2 检验申请单和血样本试管标上统一且唯一的标识符。

2.1.3 急诊样本采集后，在检验申请单上填写样本采集时间。

2.1.4 样本采集后与检验申请单一起及时运送至检验科。

专人负责样本的接收并记录样本的状态，对不合格样本予以拒收。

2.1.5 下列样本为不合格样本
2.1.5.1 样本量不足：少于0.3ml的全血样本，或少于0.1ml的血清或血浆。

2.1.5.2 对检测结果可能有干扰的样本，包括严重溶血、严重浑浊的样本。

2.1.5.3 无法确认样本与申请单对应关系的。

2.1.5.4 其他如标识涂改、样本试管破裂等。

2.2 样本保存
2.2.1接收样本后放置1-2h后将样本离心分离出血清或血浆，避免溶血。

离心必须达到3000rpm 15min，离心后的血清中不能含有颗粒物和微量纤维蛋白。

2.2.2 样本保存时间：室温（15-25℃）下可稳定48h，普通冰箱中（2-8℃）稳定7d，在-20℃最多可保存4周。

避免反复冻融。

不可使用热灭活的样本。

2.2.3已完成测试的样本保持完整的识别号，置4-8℃冰箱内保存7d。

2.3 样本采集的注意事项
采血前使受检者保持平静、松弛，避免剧烈活动。

3．检验原理
本试剂盒采用抗-HBs包被反应板，加入待测样本，经孵育后，加入抗-HBs-HRP，当样本中存在HBsAg时，该HBsAg与包被抗-HBs结合并与抗-HBs-HRP 结合形成抗-HBs-HBsAg-抗-HBs-HRP复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。

4．试剂及其他用品
4.1试剂：乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒（上海科华生物工程股份有限公司生产），试剂盒药品批准文号：国药准字S1*******(48人份)；国药准字S1*******(96人份)。

未打开的试剂盒保存于2-8℃，不可冻存。

开启的包被反应板放入干燥剂密封后在2-8℃保存并尽快使用。

4.2 试剂盒组分
微孔反应板 HBsAg阴性对照
HBsAg阳性对照酶结合物
显色剂A 显色剂 B
终止液洗涤液（蒸馏水1：25稀释）
封片纸说明书
4.3 其他试剂及用品
加液器：型号。

离心机：型号。

温箱（或水浴箱）：型号。

洗板机：型号。

酶标仪：型号。

5．室内质控与室内质控规则
5.1 质控品：采用卫生部临床检验中心临床免疫室或其他单位提供的免疫质控血清，浓度 IU/ml。

5.2 质控品重建方法：采购来的质控品按每周用量分装-20℃冻存，复融后充分颠倒混匀。

5.3 质控品测定：在每一次（板）样本中测定质控血清。

5.4 质控规则：绘制质控图，求出SD和CV值。

6．检测步骤
（1）洗涤液配制：将浓缩洗涤液用蒸馏水（或去离子水）作1：25稀释。

（2）加样
加入75微升待测样本和阴、阳性对照于反应孔中（共预留阴性对照3孔、阳性对照1孔、建议预留空白对照1孔。

），用封片纸覆盖反应板后，将
反应板置37℃孵育60分钟。

（3）取出反应板，撕去封片，在已加入待测样本和阴、阳性对照的孔中加入50微升酶结合物；在微孔震荡器上震荡10秒钟，或手工轻轻震荡10秒钟; 用封片纸覆盖反应板后，将反应板置37℃孵育30分钟。

（4）洗板
手工洗板：弃去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置30-60秒，甩干，重复5次后，在干净的吸水纸上拍干。

洗板机洗板：采用洗板机洗板，选择洗涤5次程序，用配置的工
作浓度洗涤液注满每孔，每次工作浓度洗涤液在反应微孔
中的停留时间为30-60秒，并确保每次吸净无残留，洗完
后在干净的吸水纸上拍干。

（5）显色
每孔加显色剂A液、B液各50微升，充分混匀后封板，置37℃
孵育30分钟。

（6）终止
每孔加入50微升终止液，震荡反应板5秒钟，使之充分混匀。

（7）比色
使用酶标仪，波长450nm。

（建议使用双波长的酶标仪比色，参考波长630nm或630nm相近的波长。

）若需扣除显色剂空白，则先用显色剂空白对照孔校零，然后读取各孔OD值。

7．结果判断
Cutoff值计算：COV=阴性对照平均OD值 +0.100
当S/COV≥1.0，说明该待测样本HBsAg结果为阳性。

当S/COV＜1.0，说明该待测样本HBsAg结果为阴性。

8．检验结果的报告及范围
8.1 结果的报告
8.1.1 结果经审核后，确认准确无误后发出报告。

8.1.2 报告单上标明结果的参考区间、报告日期、时间、操作者和审核者签名，并有与申请单相同的信息。

8.1.3 如收到样本的质量可能对测定结果有影响的也在报告单上指出。

8.2临界值：对临界值样本或阳性样本再以双孔重复试验确定它的结果。

如果重复检测都是临界性结果的样本建议对其进行跟踪检测。

9．操作性能
9.1从冷藏环境中取出的试剂盒需平衡至室温后方可使用，余者应按前述方法保存和使用。

在平衡试剂的同时，待测样本需平衡至室温后再行测试。

9.2 使用前试剂应摇匀。

9.3 显色过程必须封片。

所有封片纸不能重复使用。

9.4 结果判断须在反应终止后10分钟内完成。

9.5 不同批号的试剂不可混用。

9.6 洗板机洗板时应时常检查加液头，确保其畅通无堵塞；洗板时所用的吸水纸请勿反复使用。

洗板机的管路用纯化水冲洗，以防堵塞和腐蚀。

防腐。

9.7 待测样本不可用NaN
3
9.8 本试剂盒应视为有传染性物质，请按传染病实验室检查规程处理。

10．参考范围及医学决定水平
阴性结果：提示没有检测到与乙型肝炎病毒感染相关的HBsAg浓度水平。

11．临床意义
11.1乙型病毒性肝炎是一种重要的公众危害性疾病，据估计全球范围内目前大约有3亿乙型肝炎病毒携带者。

感染乙型病毒性肝炎可引起广泛的急、慢性肝脏疾病，流行病学研究已经清楚地表明乙肝病毒与肝细胞癌的发生有联系。

11.2感染乙型肝炎病毒后，机体会产生各种不同模式的抗原、抗体血清学免疫应答反应。

通过监测这些标志物，不仅可以诊断感染，而且还可以判断疾病的进程和预后。

HBsAg是HBV感染后第一个出现的标志物，是提示血清有潜在传染性的最好的间接指标。

12．结果审核以及分析与相关项目的联系
12.1由资深专业人员负责检验结果的审核。

12.2审核者认真审核每一个测定结果，对发出报告结果的可靠性负责，并在报单的审核者处签字。

12.3相关项目：审核与其他肝炎标志物等的关系，如出现与临床不符甚至相悖的情况，应分析与查找原因。

13．参考文献
13.1 体外诊断试剂说明书编写指导原则（国食药监械[2007]240号）。

13.2《中华人民共和国药典》2010年版三部。