六味地黄生物制剂对衰老小鼠脾淋巴细胞DNA损伤的保护作用

六味地黄生物制剂对衰老小鼠脾淋巴细胞DNA损伤的保护作
用
李天河;丘婷;杨霞;翁志平;汤佩莲;赵越
【摘要】Objective To study the mechanism of LW-PSB in delaying senescence. Method Mice were randomly divided into 4 groups, including the control group, the positive drug group, the aging model group and the LW-PSB group. Animal model was established by subcutaneous injection with 0. 5 mL 5% D-gal once daily for 50 consecutive days,except for the control group which was treated with saline. Mice in each group began to be given corresponding drug at 0. 2 mL o 10 g-1 dosage at day 10. Spleen lymphocytes were extracted and subjected to electrophoresis to analyzing the DNA damage at day 50. Results Compared with the control group, spleen lymphocytes in aging model of mice were serious damage (P <0. 01 ) ,and the ta il length, tail moment and tail DNA% were (145. 96 ±94. 63) μm, (51. 34 ±44. 67) μm and (23. 14 ± 15. 90)% .respectively. Compared with the model group,changes of these parameters in the positive drug group and the LW-PSB group were significant ( P < 0. 01 ). Conclusion LW-PSB can obviously protect against DNA damage of spleen lymphocytes in aging model mice induced by D-galactose that may be one of the molecular mechanisms by which LW-PSB delays senescence.%目的探讨六味地黄生物制剂延缓衰老的机制.方法小鼠随机分为正常对照组、阳性药物(维生素E)组、衰老模型组与六味地黄生物制剂组.除正常对照组注射生理盐水外,其余各组皮下注射0.5mL 5％D-半乳糖以建立衰老模型,连续50 d.第10天开始以0.2
mL· 10g-1给予各组小鼠灌胃相应的药物,50 d后处死小鼠,分离脾淋巴细胞并利用单细胞凝胶电泳法检测各组小鼠脾脏淋巴细胞的DNA损伤情况.结果与正常对照组比较,衰老模型组小鼠的脾淋巴细胞有较为严重的损伤(P＜0.01),尾长、尾距与DNA拖尾率分别为(145.96±94.63)μm、(51.34 ±44.67) μm、(23.14±15.90)％;与衰老模型组比较,阳性药物组和六味生物制剂组小鼠的DNA损伤均显著降低(P＜0.01).结论六味地黄生物制剂对D-半乳糖所致的衰老小鼠的脾淋巴细胞有明显的保护作用,这可能是六味地黄生物制剂延缓衰老的机制之一.
【期刊名称】《广东药学院学报》
【年(卷),期】2012(028)006
【总页数】3页(P644-646)
【关键词】六味地黄生物制剂;衰老小鼠;脾淋巴细胞;DNA损伤
【作者】李天河;丘婷;杨霞;翁志平;汤佩莲;赵越
【作者单位】广东药学院中药学院,广东广州510006;广东药学院中药学院,广东广州510006;广东药学院中药学院,广东广州510006;广东药学院中药学院,广东广州510006;广东药学院中药学院,广东广州510006;广东药学院中药学院,广东广州510006
【正文语种】中文
【中图分类】R285
光合细菌(photosynthetic bacteria，PSB)是一种以光为能源的厌氧细菌，含有多种生理活性物质，具有进行光合作用、发酵等功能。

近年来利用安全无毒的光合细
菌菌株来开发具有多种药理活性功能的保健食品成为一个新的研究热点[1]。

本研
究把光合细菌生物发酵技术运用到传统的六味地黄汤中，探索性地研制出经光合细菌代谢后的新型六味地黄生物制剂(以下简称“六味生物制剂”)并成功申请专利(专利号200610123868.6)。

经动物实验研究表明，光合细菌保健食品具有延缓衰老、抑制肿瘤、免疫调节的显著功效[2]。

前期化学成分研究表明[3]，经光合细菌
代谢后的六味地黄汤的化学成分发生明显变化，多糖的含量增加；药理实验表明[4-6]，六味生物制剂在提高免疫、抗衰老和治疗阴虚等作用上均优于传统的六味
地黄汤。

本实验通过建立小鼠衰老模型并从保护免疫器官角度来探讨六味生物制剂延缓衰老的机理。

1 材料
1.1 药物
六味生物制剂的制备：取熟地黄、山药、山茱萸、泽泻、牡丹皮、茯苓按处方质量比(8∶4∶4∶3∶3∶3)配药。

加8倍量的水，文火煎煮1.5 h，滤过。

药渣再加6
倍量的水煎煮1.5 h，滤过。

合并滤液，浓缩至质量浓度为0.5 g/mL。

上述药液
按一定比例加入光合细菌，于光照培养箱中培养，6个月后即得。

所制备的药液含生药材量同上，活菌数为109个/mL。

批次为20100901，苯酚硫酸法测定多糖
含量不低于代谢前的2倍。

1.2 动物
SPF级KM种小鼠，体质量(20±2) g，雌雄各半，广州中医药大学动物中心提供，生产许可证号SCXK(粤)2008-0020，正常饲养3 d后供试。

1.3 试剂
D-半乳糖(上海晶纯实业有限公司，批号40064)；维生素E(广州星群药业股份有
限公司，批号HE50010)；小鼠淋巴细胞分离液(深圳达科为生物技术有限公司)；
正常熔点凝胶(NMA，上海蓝季科技发展有限公司，批号100305)；低熔点凝胶
(LMA，Sigma公司进口分装)。

1.4 仪器
天能EPS-600电泳仪(上海天能科技有限公司)；天能HE-90水平电泳槽(上海天能科技有限公司)；剪去边缘的24孔细胞培养板盖。

2 方法
2.1 动物模型的制备[7]与脾脏淋巴细胞的分离
小鼠随机分成4组，即正常对照组、衰老模型组、阳性药物组(维生素E组)和六味生物制剂组。

阳性药物组、模型组与六味生物制剂组动物每天皮下注射0.5 mL 5% D-半乳糖溶液，建立亚急性衰老模型，同时正常组给予等体积的生理盐水，连续
50 d。

第10 天开始阳性药物组与六味生物制剂组以0.2 mL·10 g-1分别灌胃
0.27 g·kg-1的维生素E混悬液和0.50 g·kg-1六味生物制剂，其余两组以等体积
生理盐水灌胃。

末次给药1 h后，颈椎脱臼法处死小鼠，迅速取出脾脏，生理盐水洗净残留血迹后研碎，小鼠淋巴细胞分离液获得脾淋巴细胞，以PBS调节细胞浓
度为106 个·mL-1，4 ℃贮存备用。

2.2 单细胞凝胶电泳试验(SCGE)
2.2.1 制片吸取50 μL 0.5%的NMA滴在24孔细胞培养板盖凹槽中，快速用移液枪头平整地铺满凹槽，4 ℃下放置10 min，此为第一层胶；取20 μL细胞混悬液
在37 ℃下与0.98 mL 0.75%的LMA混均匀后迅速铺在第一层胶上，4 ℃下放置10 min，此为第二层胶。

2.2.2 细胞裂解将铺好胶的24孔细胞培养板盖置于新配置的裂解液(2.5 mol·L-1 NaCl，0.1 mol·L-1 Na2EDTA，0.01 mol·L-1 Tris-HCl；NaOH调节pH为10，使用前加入终浓度为1%(φ)曲拉通和10% DMSO)中，4 ℃条件下裂解2 h。

2.2.3 解旋与电泳取出24孔细胞培养板盖，用PBS冲洗多余的裂解液，置于4 ℃预冷的电泳液(0.3 mol·L-1 NaOH，1 mmol·L-1 Na2EDTA，pH13)中20 min，
使DNA充分解旋。

设置电压25 V，电流250 mA，4 ℃下电泳20 min。

2.2.4 中和与染色电泳结束后取出24孔细胞培养板盖，用pH为7.5的0.4 mol·L-1 Tris-HCl漂洗3次，每次10 min；用1 mg·mL-1的PI暗处染色10 min，然后蒸馏水冲去多余的PI，立即阅片。

2.3 观察与数据处理
把24孔板盖置于倒置荧光显微镜下观察，每个凹槽随机选择50个细胞，拍照保存，并用casp软件计算每个细胞的DNA拖尾百分率(TailDNA%)、尾距(TailMoment)和尾长(TailLength)。

2.4 统计学处理
采用SPSS进行统计分析，计量资料用表示，组间比较用SNK-q检验，以
P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果
3.1 单细胞电泳后脾淋巴细胞图像分析
见图1。

从图1可知，在荧光显微镜下正常组的小鼠淋巴细胞大多呈圆形，细胞核完整，DNA未出现迁移(图1A)；而衰老模型组产生长短不一的DNA碎片迁移，
形成彗星状尾巴，细胞损伤越严重DNA碎片迁移越远(图1C)；与衰老模型组对比，阳性药物组与六味生物制剂组小鼠淋巴细胞的DNA碎片迁移明显较短(图1B与图1D)，表明阳性药物组与六味生物制剂对衰老小鼠脾淋巴细胞有保护作用。

A.正常组
B.阳性药物组
C.衰老模型组
D.六味生物制剂组图1 各组小鼠淋巴细胞的DNA经电泳检测后荧光图像(200×)Figure 1 Fluorescent image of spleen lymphocyte DNA by electrophoresis in each group (200×)
3.2 六味生物制剂对小鼠脾淋巴细胞DNA迁移的影响
衰老模型组小鼠脾淋巴细胞的尾长、尾距和DNA拖尾百分率都明显高于正常对照组，差异有统计学意义 (P<0.01)，提示造模成功。

与模型组相比，阳性药物组与
六味生物制剂组小鼠脾淋巴细胞的尾长、尾距和DNA拖尾百分率都明显缩短，差异有统计学意义 (P<0.01)，提示维生素E与六味生物制剂对衰老小鼠的脾淋巴细胞DNA氧化损伤都有保护作用。

见表1。

表1 六味生物制剂对小鼠脾淋巴细胞DNA迁移的影响Table 1 Influence of LW-PSB on the migration distance of spleen lymphocyte DNA in ，n=6)组别剂量/(g·kg-1)尾长/μm尾距/μmDNA拖尾率/%正常对照组 -
7.02±4.71 0.72±0.39 4.50±2.77衰老模型组 -
145.96±94.63* 51.34±44.67* 23.14±15.90*阳性药物组 0.27 14.86±0.33# 2.19±0.04# 5.34±0.25# 六味生物制剂组 0.50 72.74±54.80# 30.47±21.11# 14.90±10.58#
与正常对照组比较：*P<0.01；与模型组比较：#P<0.01。

4 讨论
D-半乳糖衰老模型是常用的实验性衰老模型，该模型由于耗时短、操作简单等优点被广泛应用于抗衰老药物研究。

连续注射D-半乳糖使细胞内积聚了大量的半乳糖醇，从而影响正常渗透压，造成细胞肿胀，功能受损而衰老。

免疫衰老是机体衰老的重要组成部分，免疫器官如胸腺、脾脏等在衰老过程中会出现不同程度的退化[5]，而脾脏是人体最大的免疫器官，在机体的免疫应答中起重要的作用，随着机体的衰老使脾脏免疫功能衰退，导致老人抗感染能力降低，恶性疾病发生率增高，加速老化过程。

本文从保护免疫器官的角度初步探讨六味地黄生物制剂延缓衰老的机理，采用灵敏、可靠的碱性单细胞凝胶电泳法检测淋巴细胞的损伤，实验表明六味生物制剂对脾脏淋巴细胞有明显保护作用，能显著抑制D-半乳糖所导致的脾脏淋巴细胞损伤，这可能是六味生物制剂延缓衰老的机制之一。

脱胶问题是单细胞凝胶电泳法中关键的难题之一，由于操作过程中要经过多次反复漂洗，铺在载玻片上的凝胶很容易被冲掉从而导致前功尽弃。

本实验把凝胶铺在
24孔细胞培养板盖的凹槽里，利用凹槽的保护从而大大减少了脱胶现象，并且一次同时可做24个样本，简化操作步骤的同时也降低了铺胶的难度。

参考文献:
【相关文献】
[1] 徐芬芬，俞晓凤．光合细菌的光合应用及应用展望[J]．生物学教学，2011，36(6)：2.
[2] 李东风．光合细菌的开发应用动态[J]．微生物学杂志，1998，18(2)：44.
[3] 曾常青，曾宇，黄应起，等．经光合细菌作用的六味地黄汤成分变化的研究[J]．中国中医基础医学杂志，2007,13(8)：598.
[4] 陈艳芬，臧建伟，唐春萍，等．六味地黄汤生物制剂对氢化可的松模型的药理作用研究[J]．时珍国医国药，2008,19(5)：1035.
[5] 臧建伟，胡旭光，唐春萍，等．六味地黄汤生物制剂的抗衰老作用[J]．中草药，2007,38(1)：99.
[6] 陈艳芬，陶曙红，赵越，等．六味地黄汤生物制剂对阴虚动物的药理作用研究[J]．中药药理与临床，2007,23(5)：26.
[7] 付玉荣，王跃，刘明方，等．双歧杆菌脂磷壁酸延缓脾脏衰老的研究[J]．中华微生物学和免疫学杂志，2004,24(7)：568.。