DNA序列测定

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第十章 核酸分子杂交技术
• 概念：具有互补序列的两条核酸单链在 一定条件下，按碱基配对原则形成双链 的过程。
• 探针 待测核酸 杂交分子 • 核酸分子杂交的基本原理 • 核酸分子杂交的基本方法 • 探针的标记
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核酸分子杂交的基本原理
基的引物 – PCR标记法 – 末端标记法
• 探针的纯化
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– 用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质
• 探针的选择和标记 • 杂交 • 杂交结果检测
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Western 杂交印迹法(Western bloting)
• 检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋 白质转移到固相载体上，用特异的抗血 清对蛋白质进行鉴定及定量的方法
• 主要步骤：
– 蛋白质样品的制备 – SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳 – 蛋白质的电转移：NC膜 – 靶蛋白的免疫学检测
* 靶蛋白于第一抗体（一抗）反应 * 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应 * 显色反应：酶促反应
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液相杂交
• 核酸分子与核酸探针存在于杂交液中 • RNA酶保护分析法 • 核酸酶S1保护分析法
• 将标记的核酸探针与细胞或组织中的核 酸进行杂交，称为原位杂交。
• 特点
– 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究 – 不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低
的靶序列灵敏度高 – 能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态
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核酸原位杂交的基本步骤
• 细胞或组织的固定：载玻片 • 组织细胞杂交前的预处理
– 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 – 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法
• 探针的制备 • Southern杂交 • 杂交结果的检测
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Northern 印迹杂交(Northern bloting)
• 检测RNA（主要是mRNA）的方法 • 与Southern杂交的不同
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感谢您的欣赏！
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Southern 印迹杂交
• 1975年，英国Southern创建 • DNA/DNA杂交，即将DNA电泳、转印到
固相支持物上，用探针进行检测的方法。
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Southern 杂交(Southern bloting)的主要步骤
• 待测DNA样品的制备、酶切 • 待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 • 凝胶中DNA的变性：碱变性 • Southern转膜：
– 靶核酸：RNA – RNA电泳 – 转膜：不需变性
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斑点印迹杂交(dot bloting)
• 将RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或 尼龙膜上
• 优点：简单、快速、可同时检测多个样 品
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原位杂交(in situ hybridization)
• Southern 印迹法 • Northern 印迹法 • 斑点印迹杂交 • 原位杂交 • Western 印迹法 • 液相杂交
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A
B
C
M
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bp
—1534
— 994 — 695
— 515
— 377 — 237
• 测序过程:
– 1.模板与引物杂交 – 2.引物的延长和合成阻断
* 四个试管分别加入 DNA聚合酶 dNTP 标记底物 * 终止剂不同 ddA ddG ddC ddT * 四个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸
的聚合链
– 3.电泳 ACGT次序 高压电泳 – 4.放射自显影得到直读图象
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探针的标记
• 探针的种类
– cDNA 探针、基因组DNA探针、寡核苷酸探针、 RNA探针
• 标记物
– 核素标记物（同位素标记）：32P、35S、3H等 – 非核素标记物（非同位素标记）：生物素、地
高辛、荧光素等
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• 探针物法(random primer)：六核苷酸残
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影响杂交的因素
• 核酸分子的浓度和长度
– 浓度大，复性快；分子量大，复性慢
• 温度 • 离子强度 • 杂交液中的甲酰胺 • 核酸分子的复杂性 • 非特异性杂交反应
– 预杂交：封闭非特异性杂交位点，用鲑鱼精子DNA
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分子杂交的基本方法
• DNA变性
– 方法
* 热变性：90~100℃ * 酸碱变性：常采用碱变性 * 化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等
– 特点：粘度增加、密度增加、增色效应、溶 解温度(melting temperature,Tm)
• DNA复性或杂交(hybridization)
– DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等