反向遗传技术与猪口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗

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2018 年第 4 期 特科学别用关药注
对该流行毒分离株也开展了疫苗种毒驯化筛选工作，但 队利用制苗种毒拯救框架对 O 型 Mya-98 病毒进行了
都因病毒产量低、免疫效力差而没有成功。
改造和提升。再通过 L、5'UTR 和 P12A 等基因修饰，
2C) 和 P3(3A、3B、3C 和 3D)。3′U TR 长约 92 nt。 “一类新兽药注册证书（证号 ：（2017）新兽药证字 56
Poly(A) 尾巴长约 100 nt。
号）。中农威特生物科技股份有限公司已于 2018 年 2 月
疫苗研发团队通过全基因信息解读发现，A 型 Sea- 23 日获得了猪口蹄疫 O 型、A 型二价灭活疫苗（Re-O/
特科学别用关药注 2018 年第 4 期

反向遗传技术与 猪口蹄疫 O 型、A 型二价灭活疫苗
李永霞 / 中农威特生物科技股份有限公司
反向遗传学是相对于经典遗传学而言的。经典遗传 学的认知路线为由表及里，是从生物体自身的性状、表 型出发到它的遗传物质来研究生命的发生和发展规律。 而反向遗传学则与经典遗传学恰恰相反，是一条由里及 表的认知路线，其首先是获得生物体基因组的全部序列， 然后对靶基因有目的地进行加工和修饰，如基因插入、 基因缺失、基因置换及定点突变等，再按组成顺序构建 含生物体必需元件的修饰基因组，让其装配出具有生命 活性的个体，研究生物体基因组的结构与功能，以确定 这些变化对表型性状的直接影响，与之相关的技术为反 向遗传技术。
反向遗传技术现已成功应用于禽流感、新城疫、口 蹄疫等畜禽重大疫病的疫苗研究中，除口蹄疫疫苗外具 有代表性的产品有三例 ：一是重组禽流感病毒灭活疫苗 (H5N1 亚型，Re-1 株 )，2005 年获得一类新兽药注册证 书（（2005）新兽药证字 3 号）；二是利用新城疫 LaSota 弱毒疫苗反向遗传系统，构建表达不同 H5 高致病力禽 流感病毒 HA 抗原的重组病毒，成功研制禽流感、新城
口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、高 度接触传染性，且可快速远距离传播的动物疫病。侵染 对象是猪、牛、羊、骆驼等主要畜种及其他家养和野生 偶蹄动物，易感动物多达 70 余种。发病动物的主要症状 是精神沉郁、流涎、跛行、卧地，近查可见口、鼻、蹄 和母畜乳头等无毛部位发生水疱，水疱破损后形成溃疡 或斑痂。口蹄疫的发病率高，可造成巨大的经济损失和 社会影响。该病为世界动物卫生组织法定报告的动物传 染病，我国将其列为一类动物疫病。目前，口蹄疫仍然 在世界许多地区流行，实践证明有效的疫苗免疫能够控 制口蹄疫大范围的暴发和流行。世界动物卫生组织和泛 美口蹄疫中心肯定灭活疫苗免疫是当前防控口蹄疫的最 有效手段。中国政府对口蹄疫的防控一直高度重视，有 健全的组织机构与防控体系，长期坚持实施 “预防为主、 免疫和扑杀相结合”的综合防控措施，取得了举世公认 的成效。
口蹄疫病毒为单股正链 RNA 病毒，基因组全长 减弱其致病性，制备出针对 O/Mya-98 株的重组病毒
约 8 500 个核苷酸 (nt) , 由 5′端非编码区 (5′-UTR)、 Re-O/MYA98/JSCZ/2013。该重组疫苗毒的病毒产量
开放阅读框 ( ORF) 和 3′-UTR 及 Poly( A) 尾巴组 明显提高，对家畜致病性减弱，抗原针对流行毒株，提
起始密码子和终止密码子组成，长约 6.5 kb，编码一个 物科技股份有限公司等单位联合成功研制的猪口蹄疫 O
大的聚合蛋白。此蛋白随后被逐级降解为病毒所需的各 型、A 型 二 价 灭 活 疫 苗（Re-O/MYA98/JSCZ/2013
个组分 L/L′，P1(1A、1B、1C 和 1D)、 P2(2A、2B 和 株 +Re-A/WH/09 株 ） 已 于 2017 年 12 月 11 日 获 得
成。 5′-U TR 长约 1200 nt，含有 S 片段、Poly(C) 和 高了疫苗生产效率、免疫效力和疫苗及疫苗生产的安全
IRES 等，并在其 5′末端连有一个 VPg。ORF 由 L 基 性。
因、P1 结构蛋白基因、P2 和 P3 非结构蛋白基因以及
由中国农业科学院兰州兽医研究所和中农威特生
反向遗传技术在口蹄疫疫苗中的应用起源于 2009 年 A 型口蹄疫 Sea-97 疫情。2009 年，A 型口蹄疫 Sea-97 毒株由东南亚跨区域传播至中国、韩国、蒙古、俄罗斯、 朝鲜等东亚和东北亚国家，引起大流行，全世界为之瞩目。 世界口蹄疫参考实验室利用国际疫苗毒株库储备疫苗株 与之抗原匹配性试验，其匹配值均低于国际标准，无合 适疫苗株可推荐。' 端非编码区（3'UTR）茎环发生了突变，用 MYA98/JSCZ/2013 株 +Re-A/WH/09 株）的兽药产
单质粒病毒拯救系统证实，该突变将导致病毒在细胞 品批准文号，不日产品即可面市。猪口蹄疫 O 型、A 型
疫重组二联活疫苗（rL-H5 株），2007 年获得一类新兽 药注册证书（(2007) 新兽药证字 03 号）；三是重组新城 疫病毒灭活疫苗（A- Ⅶ株），2014 年获得一类新兽药注 册证书（（2014）新兽药证字 40 号，农业部公告第 2169 号），其为防控畜禽疫病做出了卓越的贡献。本文主要介 绍反向遗传技术在研发口蹄疫疫苗中的应用。
反向遗传技术在生命科学的各个领域应用广泛，且 在疫苗研发方面已显示出重要的作用。该技术的问世和 发展为生产合适的疫苗株提供了可能，其原因有以下几 个方面，第一 ：相比于传统疫苗株的筛选方法，反向遗 传技术改造基因进而获得的疫苗株更直接且更合理 ；第 二 ：该技术能够消除那些非允许细胞系分离毒株可能带 来的污染或其他病原体 ；第三 ：通过操作质粒，能够改 造影响病毒毒力的基因，去除那些致病因素，进而提高 疫苗及疫苗生产的安全性。疫苗免疫依然是防控大部分 动物疫病的最有效手段，反向遗传技术的应用为设计和 改造疫苗发挥了巨大作用。