川黄连中小檗碱的提取及纯化工艺的研究_林叶新

黄连为毛莨科植物黄连 Coptis chinensis Franch 的干燥根 茎［1］。 小 檗 碱 为 黄 连 中 含 有 量 最 高 的 原 小檗碱型生物碱，也是最重要的活性成分之一，具 有抗炎、抗菌、抗癌，治疗糖尿病和心血管疾病， 及抑制脂肪分化等多方面药理作用［2-6］。
传统用于提取黄连小檗碱的方法有稀硫酸法、 乙醇浸提法、水提法等［7-9］，这些方法有一定的局 限性，如消耗溶剂量大、耗时长、提取率低等。因 此，为提高黄连小檗碱的提取率，一些现代化方 法，如有超声波提取法、超微振动法、亚临界水提 取法、加速 溶 剂 萃 取 法、 微 波-索 氏 工 艺 联 合 提 取 法等［10-13］也 被 采 用 于 黄 连 小 檗 碱 的 提 取 中。 尤 其 是微波辅助提取，因微波具有能促进植物细胞破 裂，提高有效成分从物料内部向提取溶剂界面的扩
2013 年 6 月 第 35 卷 第 6 期
中成药 Chinese Traditional Patent Medicine
June 2013 Vol． 35 No． 6
川黄连中小檗碱的提取及纯化工艺的研究
林叶新1 ， 夏之宁1，2* ， 陈 华2 ， 杨丰庆2 （ 1． 重庆大学生物工程学院，重庆 400030； 2． 重庆大学化学化工学院，重庆 400030）
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沸现象，并降低了高温破坏目标产物的可能性。通 过与传统提取工艺的对比，发现此方法提取时间 短，提取率高，优于其他提取方式。此外，本研究 还采用了 AB-8 大孔吸附树脂对黄连生物碱进行分 离纯化。通过比较小檗碱的提取率和纯化后的纯 度，得到一种快速简单有效地提取及纯化川黄连中 小檗碱的方法。 1 材料与方法 1. 1 材料 川黄连购买于重庆康济跃洪药业有限 公司。将黄连粉碎，过 50 目筛。盐酸小檗碱标准 品 （ 纯度≥ 98% ，上海源叶生物科技有限公司） 、 乙腈 （ 分析纯，上海陆都试剂化工厂） 、冰醋酸 （ 分析 纯，重 庆 川 东 化 工 有 限 公 司） 、无 水 乙 醇 （ 分析纯，重庆川东化工有限公司） 、AB-8 大孔树 脂 （ 天津市光复精细化工研究所） 。 1. 2 仪器 TCMC—204 型温控式微波化学反应器 （ 南京陵江科技开发有限责任公司） 、LC—900B 高 效液相色谱仪 （ 配 LB 900 型紫外检测器，重庆川 仪九厂） 、HW—2000 色谱工作站 （ 南京千谱软件 有限公司） 、SHZ-D （ Ⅲ） 循环水式真空泵 （ 巩义 市予华仪器有限责任公司） 、UV—2450 紫外分光 光度计 （ 日本岛津公司） 、AY120 电子天平 （ 日本 岛津公司） 1. 3 方法 1. 3. 1 色谱条件 Kromasil C18 色 谱 柱 （ 250 mm × 4. 6 mm，5 μm） 色谱柱，柱温 25 ℃ ； 流动相 为乙腈-水 （ 30 ∶ 70） 含 0. 6% 冰醋酸，体积流量 1. 0 mL / min； 检测波长 342 nm。 1. 3. 2 对照品工作曲线的测定 准确称取 2. 5 mg 盐酸小 檗 碱 标 准 品，用 色 谱 流 动 相 溶 解 成 0. 025 mg / mL 的盐酸小檗碱母液，备用。使用时，用色 谱流 动 相 逐 级 稀 释 至 所 需 的 质 量 浓 度。 用 RPHPLC 测定盐酸小檗碱的量，每个样品测定 3 次。 以盐酸小檗碱峰面积对质量浓度拟合工作曲线。 1. 3. 3 微波辅助回流法提取 准确称取川黄连药 粉 （ 3. 0 g） ，在设定条件下，采用 TCMC—204 型 温控式微波化学反应器，对黄连小檗碱进行提取。 提取工艺优化时，先通过单因素试验 （ 考察乙醇 浓度、微波回流时间、提取温度、料液比、提取次 数等因素） 选取影响黄连小檗碱提取率的因素和 水平，再进行正交试验，确定最佳提取工艺。提取 率计算公式为 （ 提取所得小檗碱的质量 /生药质 量） × 100% 。单因素初始条件为乙醇 40% ，微 波时间 10 min，温度为 70 ℃ ，料液比为 1 ∶ 20，提
crowave assisted reflux extraction （ A） and berberine hydrochloride standard （ B）
2. 1. 2 RP-HPLC 外标法绘制小檗碱的标准曲线 将 小 檗 碱 母 液 用 流 动 相 稀 释 成 12. 50、6. 25、 3. 125、1. 562、0. 781 和 0. 391 μg / mL 6 个质量浓 度，分别进行 RP-HPLC 分析，在 0. 391 ～ 12. 50 μg / mL 范围内，小檗碱的量与其峰面积具有良好 的线性关系 Y = 48 965X + 6 396， （ R2 = 0. 999 3， n = 6） ，小檗碱质量浓度与其峰面积具有良好的线
取次数为 1 次。 1. 3. 4 回流提取及水浴加热提取 准确称取黄连 药粉 （ 3. 0 g） ，进行回流提取和水浴加热提取 1 h， 各进行平行试验 3 次。其他提取条件与通过正交试 验获得的微波辅助回流提取条件如温度、乙醇质量 分数、料液比、提取次数等保持一致。测定提取液 中小檗碱的量，计算提取率。 1. 3. 5 AB-8 大孔树脂纯化工艺 （ 1） 大孔吸附 树脂预处理： 将大孔吸附树脂用 95% 乙醇浸泡 24 h，使其充分溶胀，再用乙醇洗至溶液加适量蒸馏 水无白色浑浊现象时为止，最后用蒸馏水洗至无醇 味，备用。 （ 2） 最大上样量的考察： AB-8 树脂湿 法装柱，将微波辅助回流法提取得到的样品浓缩至 小檗碱质量浓度为 2. 9 mg / mL，之后把浓缩液 100 mL 缓慢加入装有 10 mL 湿 AB-8 的树脂的玻璃柱 中，控制体积流量为 1. 0 mL / min，每树脂床体积 （ Bed volume，BV） 即 10 mL 收集 1 个流分，并用 RP-HPLC 法测定每 1 BV 中小檗碱的量。根据每 1 BV 中小檗碱的量确定最大上样量。 （ 3） 水洗脱用 量的考察： 将已吸附好黄连提取液的 AB-8 树脂， 用 蒸 馏 水 洗 脱 杂 质， 洗 脱 液 体 积 流 量 为 1. 0 mL / min。每 1 BV 收 集 一 次，测 定 小 檗 碱 泄 漏 情 况。 （ 4） 洗脱剂体积分数的考察： 根据确定的最 大上样量上样，将吸附好黄连提取液的大孔树脂， 用适 量 蒸 馏 水 洗 脱 杂 质，再 分 别 用 30% 、50% 、 70% 、90% 的乙醇溶液作为洗脱液，洗脱液体积流 量为 1. 0 mL / min，洗脱 5 BV，并收集好。测定 5 BV 流分中小檗碱的总量。 （ 5） 洗脱剂用量的考 察： 按 （ 3） 和 （ 4） 项所得的蒸馏水洗脱剂用量 和乙醇洗脱剂体积分数，洗脱已吸附好黄连提取液 的 AB-8 树脂，洗脱液体积流量为 1. 0 mL / min。每 1 BV 为一个考察单位，至洗脱液近无色，分别测 定各 BV 洗脱液中小檗碱的量。（ 6） 纯化试验及小 檗碱回收率： 取一定量的黄连提取浓缩液按最佳纯 化条件进行吸附和洗脱，将洗脱液和上样前浓缩液 分别旋转蒸发至黏稠状，移置真空干燥箱干燥，测 定纯化前后提取物中小檗碱的量，并计算纯度及小 檗碱回收率。 2 结果 2. 1 小檗碱定量测定 2. 1. 1 RP-HPLC 色谱条件 在选定的 1. 3. 1 项的 色谱条件下，川黄连提取物中目标物小檗碱的峰与 其他成分可实现基线分离。小檗碱色谱峰的 tR值为 8. 6 min，见图 1。
盐酸小檗碱标准纯度98上海源叶生物科技有限公司分析纯上海陆都试剂化工厂冰醋酸分析纯重庆川东化工有限公司无水乙醇分析纯重庆川东化工有限公司ab8仪器tcmc204型温控式微波化学反应器南京陵江科技开发有限责任公司lc900blb900型紫外检测器重庆川仪九厂hw2000色谱工作站南京千谱软件有限公司shzd循环水式真空泵巩义市予华仪器有限责任公司uv2450紫外分光光度计日本岛津公司ay120电子天平日本岛津公司色谱条件kromasil18色谱柱250mmmm5m色谱柱柱温25
本实验采用微波辅助回流法提取，对黄连中的 小檗碱进行提取，并通过单因素及正交设计法确定 提取的最佳工艺。研究中采用的 TCMC—204 型温 控式微波化学反应器是可控温式的，能有效避免爆
收稿日期： 2012-08-18 基金项目： 自然科学基金 （ 21175159、21005092） ； 国际合作项目 （ 2010DFA32680） 。 作者简介： 林叶新 （ 1984—） ，女，博士生，从事天然产物的分离及其生物活性的分析和评价研究。E-mail： starelin@ 163． com * 通信作者： 夏之宁 （ 1961—） ，男，教授，博士生导师，研究方向： 药物化学与分析化学。E-mail： chem_ lab_ cqu@ yahoo． com． cn
LIN Ye-xin1 ， XIA Zhi-ning1，2* ， CHEN Hua2 ， YANG Feng-qing2
（ 1． College of Bioengineering，Chongqing University，Chongqing 400030，China； 2． College of Chemistry and Chemical Engineering，Chongqing University，Chongqing 400030，China）
KEY WORDS： Coptis chinensis Franch from Sichuan Province； berberine； microwave-assisted reflux extraction； macroporous resin； extraction； purification
中图分类号： R284. 2
文献标志码： A
文章编号： 1001-1528（ 2013） 06-1204-06
doi： 10． 3969 / j． issn． 1001-1528． 2013． 06． 021
Extraction and purification technology of berberine from Coptis chinensis Franch from Sichuan Province
散速率，减少 提 取 溶 剂 的 使 用 量［14］ 等 优 点， 在 天 然产物提取中得到广泛的应用。
虽然已有采用微波辅助提取黄连中的生物碱的 报道，但在微波提取工艺中，因微波时间过长，容 易引 起 爆 沸 现 象，通 常 只 能 采 取 间 歇 式 微 波 提 取［15］。所以常 规 的 微 波 辅 助 提 取，一 般 有 两 种： 直接采用微波提取的方式［15］； 或是先用微波处理 样品，提高物料的扩散率，再用其他方法 （ 如索 氏抽提） 提取目标物［16］。这类微波提取方式，耗 时长、操作步骤繁琐。
摘要： 目的 研究川黄连中小檗碱的最佳提取及纯化工艺。方法 以提取物中小檗碱为指标，采用正交试验设计法优
化微波辅助回流提取川黄连小檗碱的工艺； 并通过对 AB-8 大孔树脂吸附和解吸性能的考察，确定最佳的纯化工艺。
结果 最佳提取工艺为加入 25 倍量的 50% 乙醇，80 ℃ 下微波回流 10 min，提取次数 2 次，提取率为 8. 5% ； 最佳纯
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图 1 川黄连微波辅助回流提取液 （ A） 与盐酸小檗碱标准品 （ B） 的 RP-HPLC 谱图对照 Fig. 1 RP-HPLC chromatograms of Coptis chinensis Franch from Sichuan Province extracts using mi-
化工艺为小檗碱上样质量浓度 8. 7 mg / mL 树脂 （ 湿体积） ，吸附及洗脱体积流量 1. 0 mL / min，3 BV 的蒸馏水和 70%
乙醇分别洗脱杂质和小檗碱，最终小檗碱纯度可达 73. 2% 。结论 建立了一种快速简单有效地提取及纯化川黄连中小
檗碱的方法。
关键词： 川黄连； 小檗碱； 微波辅助回流法； 大孔树脂； 提取； 纯化