从“扶正祛邪”角度探讨升阳益胃汤加减方治疗溃疡性结肠炎大鼠的效应机制吕

基础研究中国民间疗法
C H I N A S N A T U R O P A T H Y ,A p
r .2024,V o l .32N o .8 җ基金项目:
山西省中医药研究院院级课题创新骨干人才专项(2021C X G G -05);第5批全国中医临床优秀人才研修项目(国中医药人教函 2022 1号)
第一作者:吕小燕,E -m a i l :1270929351@q q
.c o m 从 扶正祛邪 角度探讨升阳益胃汤加减方治疗
溃疡性结肠炎大鼠的效应机制җ
张瑜,尚可,杜慧娟,冯五金
(山西省中医药研究院,山西太原030024
)ʌ摘要ɔ 目的:从中医 扶正祛邪 角度探讨升阳益胃汤加减方治疗溃疡性结肠炎(U C )
大鼠的效应机制㊂方法:选取S P F 级S D 大鼠40只,随机分为正常组㊁模型组㊁中药组和西药组,每组10只㊂除正常组外,
其余组大鼠构建葡聚糖硫酸钠(D S S )致U C 模型,观察升阳益胃汤加减方对U C 大鼠肠黏膜屏障蛋白闭锁小带蛋白1(Z O -1)㊁o c -
c l u
d i n 及炎症因子白细胞介素-6(I L -6)㊁肿瘤坏死因子α(T N F -α)表达的影响,以及对结肠组织形态及病理评分的影响㊂结果:正常组结肠黏膜上皮组织整齐,细胞排列密集,可见杯状隐窝,无炎症细胞浸润,未见糜烂㊁溃疡㊂模型组结肠黏膜上皮缺损,基本无结构完整的隐窝,黏膜及黏膜下层可见大量炎症细胞浸润㊂中药组结肠黏膜上皮部分中断,与模型组相比缺损面积小,部分隐窝结构破坏,可见少许炎症细胞浸润㊂西药组结肠黏膜组织变化接近中药组㊂与正常组相比,模型组病理学评分显著升高(P <0.01);与模型组相比,中药㊁西药组病理评分显著下降(P <0.01)㊂与正常组相比,模型组肠黏膜屏障蛋白o c c l u d i n ㊁Z O -1表达显著下降;与模型组相比,中药㊁西药组肠黏膜屏障蛋白o c c l u d i n ㊁Z O -1表达增加,但低于正常组,差异均有统计学意义(P <0.01)㊂与正常组相比,模型组肠黏膜T N F -α㊁I L -6表达显著增加;与模型组相比,中药㊁西药组肠黏膜T N F -α㊁I L -6表达均低于模型组,差异均有统计学意义(P <0.01)㊂结论:拮抗炎症因子T N F -α㊁I L -6表达,修复损伤的肠黏膜屏障蛋白Z O -1㊁o c c l u -
d i n ,扶正祛邪以恢复肠道免疫平衡,以上可能是升阳益胃汤加减方治疗U C 的效应机制㊂
ʌ关键词ɔ 扶正祛邪;升阳益胃汤加减方;溃疡性结肠炎;美沙拉秦肠溶片;葡聚糖硫酸钠中图分类号:R 243;R 574.1 文献标识码:A D O I :10.19621/j
.c n k i .11-3555/r .2024.0829 溃疡性结肠炎(u l c e r a t i v ec o l i t i s ,U C )因腹痛㊁黏液脓血便等症状反复发作被世界卫生组织列为现代难治性疾病之一,其发病机制与在肠黏膜屏障受损基础
上的肠道免疫失衡有关[1
]㊂目前西医治疗U C 的关注
点仍以5-氨基水杨酸㊁糖皮质激素㊁免疫抑制剂㊁生物制剂等逐渐升阶梯的祛邪抗炎治疗方案为主,忽略修复损伤肠黏膜屏障功能的重要性㊂结合目前临床治疗中患者存在病情反复㊁疗效不稳定㊁潜在感染等正气亏虚的特征,笔者认为可从中医 扶正祛邪 角度出发治疗U C ,修复损伤的肠黏膜屏障,调节菌群失调状态等,以恢复U C 患者的肠道免疫平衡㊂
升阳益胃汤加减方是在李东垣升阳益胃汤益气健
脾㊁祛湿的基础上,结合U C 久病及肾,久病入络㊁多瘀等病机特点,加仙茅㊁淫羊藿㊁丹参㊁秦皮㊁厚朴等补肾活血㊁燥湿止痢中药组成,具有益气健脾㊁祛湿止痢㊁扶正祛邪的功效㊂本研究从中医 扶正祛邪 角度观察升阳益胃汤加减方对U C 大鼠肠黏膜屏障蛋白闭锁小带蛋白1(Z O -1)㊁o c c l u d i n 及炎症因子白细胞介素-6(I L -
6)㊁肿瘤坏死因子α(T N F -α)表达的影响㊂1 材料
1.1 药物与试剂 ①升阳益胃汤加减方煎剂组成:黄芪30g ,半夏9g ,党参片15g
,炙甘草5g ,羌活㊁独活㊁防风㊁炒白芍各15g ,麸炒白术30g ,陈皮15g
,茯苓30g ,柴胡9g ,泽泻15g ,黄连片3g ,仙茅9g ,淫羊藿9g ,厚朴15g ,秦皮15g ,丹参15g ㊂由山西省中医药研究院东山科教院区实验室提供并熬制成水煎剂,按标准成人剂量与大鼠转换系数6.25,计算大鼠的给药剂量,含生药量为31.73g /k g
㊂②美沙拉秦肠溶片69 中国民间疗法2024年4月第32卷第8期
基础研究中国民间疗法
C H I N A S N A T U R O P A T H Y ,A p
r .2024,V o l .32N o .8(L o s a nP h a r m aG m b H ,国药准字H 20171358,0.5g /袋),含药量为0.34g /k g ,至研磨机中研磨成细微粉末,加100ʎC 蒸馏水制成混悬液,现用现配㊂③I L -6
抗体(批号:G R 3337471-16)㊁o c c l u d i n 抗体(
批号:G R 3452603-3)㊁T N F -α抗体(批号:G R 3405981-5)
㊁Z O -1抗体(批号:G R 3354270-17)均购自A b c a m 公司㊂④葡聚糖硫酸钠(D S S )(上海麦克林生化科技有限公司,批号:C 12469988)㊂⑤10%水合氯醛溶液㊁中性福尔马林溶液由山西省中医药研究院东山科教院区实验室提供㊂⑥C o n t o u rE l i t e 三维光学显微镜购有美国布鲁克公司㊂
1.2 实验动物与分组 S P F 级S D 大鼠40只,雌雄各半,体质量190~210g ,由山西省中医药研究院东山科教院区实验室提供(实验动物合格证号:110324210102969274,伦理编号:S Z Y L Y 2021K Y -0329)㊂40只S D 大鼠适应性喂养1周后标号㊁称重,随机均分为模型组㊁正常组㊁中药组和西药组,每组10只㊂
2 方法
2.1 模型制备及给药方法 模型组㊁中药及西药组大鼠经适应性喂养1周后,采用葡聚糖硫酸钠盐(D S S )
诱导建立U C 大鼠模型:上午按1m L /100g 体质量予
5%D S S 溶液灌胃,同时予5%D S S 溶液自由饮,连续7d 建立U C 大鼠模型(根据预实验结果,随机抽取5只大鼠,予上述方法造模,7d 后处死2只大鼠,观察结肠黏膜组织充血㊁水肿㊁溃疡等情况,确定造模成功)㊂中药组大鼠每日下午按1m L /100g 体质量给予升阳益胃汤加减方煎剂灌胃,西药组给予美沙拉秦肠溶片粉末溶液灌胃,正常组大鼠按1m L /100g 给予纯净水灌胃及自由饮,各组大鼠连续灌胃7d
㊂2.2 结肠组织形态学观察 实验期满后,各组大鼠禁食不禁水12h ,后用10%水合氯醛按0.35m L /100g
行腹腔注射麻醉后,取出结肠,纵向切开肠腔,用生理盐水冲洗肠道内容物,肉眼观察其结肠黏膜变化,然后采用中性福尔马林固定,继续予以水洗㊁脱水㊁透明㊁浸蜡㊁包埋,冰冻切片机做连续冠状切片,片厚50μm ,取部分切片进行苏木精-伊红(H E )染色,光镜下观察结肠黏膜组织细胞的病理改变,按表1进行评分㊂
表1 光镜下病理形态评定表
评分镜下表现
0分
未见明显损伤
续表
评分镜下表现
1分上皮层和固有层炎症细胞浸润,组织充血水肿程度
轻,不超过膜下层,伴轻度腺体损伤2分炎症局灶性改变累及黏膜下层,组织充血水肿程度显著,伴中度腺体损伤3分
黏膜下层炎症细胞形成灶状浸润,上皮坏死,溃疡深大,可累及肌层,伴严重黏膜腺体损伤
2.3 Z O -1㊁o c c l u d i n 及I L -6㊁T N F -α指标测定 在室温下取出冰冻石蜡切片,进行脱蜡水合,采用枸橼酸溶液进行抗原修复;H 2O 2孵育后,加入山羊血清封闭,清洗后加入按说明书比例稀释的I L -6㊁o c c l u d i n ㊁T N F -α
㊁Z O -1一抗,4ħ孵育;次日加入二抗,室温孵育,采用D A B 法显色,再进行冲洗,苏木精复染,封片,在显微镜下观察不同部位Z O -1㊁O c c l u d i n ㊁I L -6㊁T N F -α表达情况并摄片㊂参照‘免疫组织化学检测技术共识“中评分标准对各指标进行评分,根据阳性细胞染色程度及着色细胞百分率进行计分:0分为不着色,1分为浅棕色,2分为深棕色;着色细胞<5%计0分,5%~25%计1分,26%~50%计2分,>50%计3分㊂两个分值
相加,0~1分为(-),2分为弱阳性(+),3分为阳性
(++),4~6分为强阳性(+++)
[2]
㊂2.4 统计学方法 采用S P S S23.0统计软件分析数据㊂等级资料采用秩和检验㊂P <0.05表示差异有统
计学意义㊂3 结果
3.1 一般状态观察 正常组大鼠大便成形㊁色黄,皮毛浓密㊁光洁,体态正常,食欲可,体质量逐日增加㊂模型组大鼠在造模第4日出现少许黏液便;造模第6日食欲减退,进食量减少,后逐渐出现精神不振㊁乏力㊁喜静少动㊁悬空拉尾抗力减弱㊁自发活动数降低㊁皮毛粗糙;造模第16日出现血便㊂西药及中药组大鼠状态较正常组稍差,较模型组好㊂造模结束后,模型组有1只大鼠死亡,西药组有1只大鼠死亡,中药组有2只大鼠死亡,正常组均存活㊂
3.2 对结肠组织形态的影响 正常组结肠黏膜上皮
组织整齐,细胞排列密集,可见杯状隐窝,无炎症细胞浸润,未见糜烂㊁溃疡㊂模型组结肠黏膜上皮缺损,基本无结构完整的隐窝,黏膜及黏膜下层见大量炎症细胞浸润㊂中药组结肠黏膜上皮部分中断,与模型组相比缺损面积小,部分隐窝结构破坏,可见少许炎症细胞浸润㊂西药组结肠黏膜组织变化接近中药组㊂见图1
79
中国民间疗法2024年4月第32卷第8期
基础研究中国民间疗法
C H I N A S N A T U R O P A T H Y,A p r.2024,V o l.32N o.8 (见本期第129页)㊂
3.3对结肠组织病理评分的影响与正常组相比,模型组病理学评分显著升高(P<0.01);与模型组相比,中药㊁西药组病理评分均显著下降(P<0.01)㊂见表2㊂表24组大鼠结肠组织病理评分比较
组别只数
病理评分(只数)
0分1分2分3分平均秩次(次)
正常组10100005.50
模型组9005429.78ә中药组8044020.50әһ西药组9054019.89әһ
注:与正常组比较,әP<0.01;与模型组比较,һP<0.01㊂3.4对o c c l u d i n㊁Z O-1蛋白表达的影响与正常组相比,模型组肠黏膜屏障蛋白o c c l u d i n㊁Z O-1表达显著下降;与模型组相比,中药㊁西药组肠黏膜屏障蛋白o c c l u d i n㊁Z O-1表达增加,但低于正常组,差异均有统计学意义(P<0.01)㊂见图2㊁3(见本期第129页)及表3㊂3.5对T N F-α㊁I L-6表达的影响与正常组相比,模型组大鼠肠黏膜炎症因子T N F-α㊁I L-6表达均显著增加;与模型组相比,中药㊁西药组大鼠肠黏膜T N F-α㊁I L-6表达均降低,差异均有统计学意义(P<0.01)㊂见图4㊁5(见本期第129页)及表4㊂
4讨论
U C是一种侵及结肠黏膜和黏膜下层的慢性非特
异性炎性疾病,以反复发作的腹泻㊁黏液脓血便,伴腹痛㊁里急后重为主要临床表现㊂目前西医治疗U C以美沙拉秦制剂抗炎为主,虽短期疗效较好,但存在肝肾功能损害㊁病情反复等弊端[3]㊂在患者对美沙拉嗪制剂治疗不应答或病情加重㊁反复等情况下,采用激素㊁生物制剂等治疗,虽能取得一定的治疗效果,但有疗效不稳定㊁发生感染㊁免疫抑制等问题[4-6]㊂U C的发病机制目前虽尚未阐明,但近年研究表明遗传㊁环境㊁心理㊁感染等多重致病因素致肠黏膜免疫失衡是该病发生的主要病理机制,在肠黏膜免疫失衡的病理基础上,肠黏膜屏障受损致肠上皮细胞间通透性增加是启动U C㊁主导U C进展的重要因素[7]㊂扶正祛邪修复损伤的肠黏膜屏障,恢复肠道免疫平衡是U C治疗的重点㊂o c c l u d i n及Z O-1蛋白是肠黏膜屏障的重要组成部分,分属于肠黏膜屏障紧密连接跨膜蛋白和连接跨膜蛋白及细胞骨架间的连接复合物蛋白,是肠黏膜屏障功能受损的重要检测指标㊂研究表明,U C患者受损的肠黏膜屏障致肠上皮细胞间通透性增加,可使细菌㊁病毒等进入肠黏膜,激活以T N F-α为主的肠黏膜炎性反应, T N F-α进一步刺激单核巨噬细胞和中性粒细胞,合成I L-6,进一步加重肠黏膜组织损伤,形成结肠黏膜及黏膜下层持续性或间断性炎症[8]㊂
溃疡性结肠炎属于中医 久痢 肠澼 等范畴㊂‘溃疡性结肠炎中西医结合诊疗共识意见(2017年)“指出
表34组大鼠结肠黏膜屏障蛋白o c c l u d i n㊁闭锁小带蛋白1表达水平比较
组别只数
o c c l u d i n表达水平
-++++++平均秩次
闭锁小带蛋白1表达水平
-++++++平均秩次
正常组100001030.000001031.00模型组972005.22ә81005.17ә中药组8016118.06әһ026016.88әһ西药组9016219.39әһ017119.39әһ注:与正常组比较,әP<0.01;与模型组比较,һP<0.01㊂
表44组大鼠结肠黏膜白细胞介素-6㊁肿瘤坏死因子α表达比较
组别只数肿瘤坏死因子α表达水平
-++++++平均秩次
白细胞介素-6表达水平
-++++++平均秩次
正常组10100005.50100005.50
模型组9002730.78ә003629.83ә
中药组8044018.25әһ026020.00әһ
西药组9027020.89әһ027020.28әһ注:与正常组比较,әP<0.01;与模型组比较,һP<0.01㊂(下转第110页) 89中国民间疗法2024年4月第32卷第8期
综述中国民间疗法
C H I N A S N A T U R O P A T H Y,A p r.2024,V o l.32N o.8
[12]黄循铷,王承党,王瑞幸,等.溃疡性结肠炎小鼠肠道通透
性改变与T N F-α及N F-κBP65的关系[J].中国应用生理
学杂志,2016,32(2):112-115,193.
[13]路蔓,付强,张静.肿瘤坏死因子-α诱导对膀胱癌细胞株
N F-κB信号通路分子表达及细胞增殖水平的影响[J].检
验医学与临床,2021,18(15):2145-2147,2151. [14]罗心静,莫选荣,周玲玲.T N F-α诱导类风湿关节炎滑膜细胞
N F-κB信号通路活化的探讨[J].免疫学杂志,2012,28(4): 321-323,332.
[15]F U J I S A W A K,A O N O H,H A S U N UM A T,e t a l.A c t i v a t i o n o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o rN F-k a p p a Bi nh u m a ns y n o v i a l c e l l s i n r e s p o n s e t o t u m o r n e c r o s i s f a c t o r a l p h a[J].A r t h r i t i sR h e u m, 1996,39(2):197-203.
[16]罗心静,莫选荣,周玲玲.H S P72对类风湿关节炎滑膜细
胞I L-6㊁I L-8表达及N F-κB活化的影响[J].中国应用生
理学杂志,2012,28(4):336-339.
[17]刘珍琦,张艺焓,刘幸卉.异甘草酸镁抑制N F-κB信号通
路减轻I L-1β诱导软骨细胞炎症[J].湖北医药学院学报, 2022,41(6):555-560,544.[18]鲁宏,宋俊,孟京红,等.香叶木素通过N F-κB通路缓解
I L-1β诱导的新生大鼠骨关节炎软骨细胞凋亡和免疫反
应[J].中国免疫学杂志,2019,35(3):292-297. [19]陈瑞林,黄文辉,黄成辉,等.P P A R-γ在类风湿关节炎患者
外周血单个核细胞中的表达及与疾病活动度的关系[J].
实用临床医药杂志,2015,19(7):65-67,90.
[20]Z H A N GL M,Z H U MJ,L IM M,e t a l.G i n s e n o s i d eR g1a t-t e n u a t e s a d j u v a n t-i n d u c e da r t h r i t i s i nr a t sv i a m o d u l a t i o no f P P A R-γ/N F-κBs i g n a l p a t h w a y[J].O n c o t a r g e t,2017,8(33): 55384-55393.
[21]W E NQ,M I A OJ F,L A UN,e t a l.R h e i n a t t e n u a t e s l i p o p o l y s a c-
c h a r i
d e-p r i m
e d i n
f l a m m a t i o n t h r o u
g
h N F-κB
i n h i b i t i o n i n
R A W264.7c e l l s:t a r g e t i n g t h e P P A R-γs i g n a l p a t h w a y [J].C A NJ P H Y S I O LP H A R M A C O L,2020,98(6):357-365.
[22]杨蕾,张正菊,相瑞阳,等.虎杖对胶原诱导性关节炎大鼠
滑膜P P A Rγ/N F-κB信号途径的影响[J].中国中西医结
合杂志,2019,39(5):591-596.
(收稿日期:2023-01-07)
[编辑:白晓晖张思思]
(上接第98页)
脾气亏虚是U C发生的基本病机[9]㊂在脾虚基础上,湿㊁热㊁瘀等病理因素互结致 内疡 是U C发病的主要病机㊂升阳益胃汤加减方是在李东垣升阳益胃汤益气健脾㊁祛湿的基础上,结合 脾病及肾㊁湿困脾土 的中医理论及U C久病入络㊁多瘀的病机特点,加仙茅㊁淫羊藿㊁丹参㊁秦皮㊁厚朴,具有益气健脾㊁活血祛湿解毒的功效,符合中医扶正祛邪的组方特点㊂本研究结果表明,升阳益胃汤加减方可显著降低U C大鼠肠黏膜T N F-α㊁I L-6表达,升高肠黏膜屏障蛋白o c c l u d i n㊁Z O-1表达,表明修复损伤的肠黏膜屏障㊁祛湿消滞㊁扶正祛邪可能是该方治疗U C的主要效应机制㊂本研究为中医药防治U C的效应机制提供了研究依据㊂
参考文献
[1]V A N U V,O U B O T E R L F,L I N,e ta l.I d e n t i f i c a t i o no fa
d i s
e a s e-a s s o c i a t e dn e t w o r ko
f i n t e s t i n a l i m m u n ec e l l s i nt r e a t-m e n t-n aïv e i n f l a m m a t o r y b o w e ld i s e a s e[J].F r o n tI m m u n o l, 2022,13:893803.
[2]高颖,庞钧译,潘越宁,等.免疫组织化学检测技术共识[J].中华病理学杂志,2019,48(2):87-91.
[3]M I K A M IY,T S U N O D AJ,S U Z U K I S H,e t a l.S i g n i f i c a n c e o f 5-a m i n o s a l i c y l i c a c i di n t o l e r a n c e i nt h ec l i n i c a lm a n a g e m e n to f
u l c e r a t i v e c o l i t i s[J].D i g e s t i o n,2022,104(1):1-8.
[4]H U A N G C L,H U A N G Z H,D I N G L,e ta l.F e c a lm i c r o b i o t a t r a n s p l a n t a t i o n v e r s u s g l u c o c o r t i c o i d s f o r t h e i n d u c t i o n o f r e m i s s i o n i nm i l d t om o d e r a t e u l c e r a t i v e c o l i t i s[J].JT r a n s lM e d, 2022,20(1):354.
[5]H E NM IY,K A K I MO T O K,I N O U ET,e t a l.C y t o m e g a-l o v i r u s i n f e c t i o n i nu l c e r a t i v e c o l i t i s a s s e s s e db yq u a n t i t a t i v e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n:r i s k f a c t o r s a n d e f f e c t s o f i mm u-n o s u p p r e s s a n t s[J].J C l i n B i o c h e m N u t r,2018,63(3): 246-251.
[6]L A U R OR,M A N N I N OF,I R R E R AN,e t a l.P h a r m a c o g e n e t i c s o f b i o l o g i c a l a g e n t s u s e d i n i n f l a m m a t o r y b o w e l d i s e a s e:a s y s-t e m a t i c r e v i e w[J].B i o m e d i c i n e s,2021,23,9(12):1748.
[7]K A M I N S K YL W,A LSR,M A T Y.I L-1βa n d t h e i n t e s t i n a l
e p i t h e l i a lt i g h t j u n c t i o n b a r r i e r[J].F r o n tI m m u n o l,2021, 12:767456.
[8]K O F L A-DłU B A C Z A,A K U T K O K,K R Z E S I E K E,e ta l. S e l e c t i v e f o r m s o f t h e r a p y i n t h e t r e a t m e n t o f i n f l a mm a t o r y
b o w e l d i s e a s e s[J].JC l i n M e d,2022,14,11(4):994.
[9]中国中西医结合学会消化系统疾病专业委员会.溃疡性结肠炎中西医结合诊疗共识意见(2017年)[J].中国中西医结合消化杂志,2018,26(2):105-111.
(收稿日期:2022-12-21)
[编辑:白晓晖]
011中国民间疗法2024年4月第32卷第8期
‘从 扶正祛邪 角度探讨升阳益胃汤加减方治疗溃疡性结肠炎大鼠的效应机制“
正文见本期第96-98及110页
图14组大鼠结肠黏膜病理苏木精-伊红染色图片比较(ˑ100)
图24组大鼠结肠黏膜蛋白o c c l u d i n的表达(ˑ100)
图34组大鼠结肠黏膜蛋白闭锁小带蛋白1的表达(ˑ100)
图44组大鼠结肠黏膜肿瘤坏死因子α的表达(ˑ100)
图54组大鼠结肠黏膜白细胞介素-6的表达(ˑ100)
中国民间疗法2024年4月第32卷第8期
921。