高效液相色谱法的种类 液相色谱操作规程

高效液相色谱法的种类液相色谱操作规程
高效液相色谱法按分别机制的不同分为液固吸附色谱法、液液调配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。

1．液固色谱法使用固体吸附剂，被分别组分在色谱柱上分别原理是依据固
高效液相色谱法按分别机制的不同分为液固吸附色谱法、液液调配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。

1．液固色谱法使用固体吸附剂，被分别组分在色谱柱上分别原理是依据固定相对组分吸附力大小不同而分别。

分别过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。

常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5～10μM。

适用于分别分子量200～1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。

常用于分别同分异构体。

2．液液色谱法使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分别原理是依据被分别的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分别。

分别过程是一个调配平衡过程。

涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必需预先用固定相饱和，以削减固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区分常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分别和收集多而杂化。

由于涂布式固定相很难避开固定液流失，现在已很少接受。

现在多接受的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。

液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法（NPC）和反相色谱法（RPC）。

正相色谱法接受极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调整组分的保留时间。

常用于分别中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。

反相色谱法一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调整保留时间。

适用于分别非极性和极性较弱的化合物。

RPC在现代液相色谱中应用较为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。

随着柱填料的快速进展，反相色谱法的应用范围渐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。

为掌控样品在分析过程的解离，常用缓冲液掌控流动相的PH值。

但需要注意的是，C18和C8使用的PH值通常为2.5～7.5（2～8），太高的PH值会使硅胶溶解，太低的PH值会使键合的烷基脱落。

有报告新商品柱可在PH 1.5～10范围操作。

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液相色谱仪自动进样器故障排出方法
自动进样器的故障简单被发觉，有时液相色谱仪系统出了故障而不能确定是否是进样器故障，可以用手动进样几次，或用一台好的自动进样器代替，如排出了故障，说明自动进样器有了问题。

不同厂商的自动进样器差异很大，除一些共性故障外，较好查阅操作手册或与供应商联系。

除自动进样器机械、掌控系统可能显现故障外，在操作及方法学方面也可能显现相应的问题，这里紧要依据自动进样器的设计特点，对试验过程中可能显现的问题进行说明。

一、滞后体积
高效液相色谱仪中滞后体积是指流动相混合器到柱头的体积，包括溶剂混合器和混合器到柱头之间连接管的体积，对于低压混合系统，也包括泵体积。

滞后体积较大可能导致试验的重复性差、方法移植困难。

通常的HPLC系统中，滞后体积一般在0.2mL～5mL之间，紧要取决于装置的设计。

滞后体积中较紧要的部分为自动进样器的定量环体积。

只有定量环体积小于100μL时，其对滞后体积的影响才可以貌似不计。

当定量环体积较大时，这种影响将表现出来。

例如，接受50μL的定量环时滞后体积为300μL，假如改用1mL定量环，滞后体积将变成1250μL，这种变化直接影响到色谱分别结果。

在实际分别过程中，接受的色谱柱较细时，必需考虑滞后体积的影响，解决的方法为更换较小的定量环，减小滞后体积。

二、样品瓶过满
假如样品瓶过满，在瓶盖较紧、进样量较大的情况下，可能会导致进样重复性变差。

其起因于样品瓶中的样品被抽出时，盖紧的瓶盖不能使空气适时进入，造成部分真空。

由于这种真空作用，注射器不能够吸取充重量的样品体积。

在极端的情况下，对于挥发性稀溶液样品，针内甚至会显现气泡，影响分析工作的正常进行。

有些自动进样器接受加排空针的方法克服这一问题，但这种方法并不常用。

较简单的解决方法为不要使样品瓶过满。

一般装样量在样品瓶的1／2到3／4之间较为适合。

三、进针深度的调整
样品量充分多时，不必考虑这一问题。

但对于痕量分析而言，进针深度的调整问题将较为突出。

理想的情况下可以使进针深入到接近样品瓶底部，这样可以较大限度地利用样品。

当可用的样品体积有限时，可以接受微量样品瓶以加添给定体积样品的相对深度。

假如进针过深，可能插入样品瓶的底部，甚至导致针尖堵塞。

假如进针深度不足，样品只及针尖部分，针将不能抽取充重量的样品，部分空气取而代之。

对于进针深度的调整，一般接受机械或电动的方法，目前大部分厂商可以在液相色谱仪色谱工作站上设置。

无论接受哪种方法，试验之前都必需认真调整，更换样品瓶类型时还需要重新调整。