Goldengate高通量耳聋基因芯片在大前庭水管综合征中的有效性验证及应用分析

•138 •屮华耳鼻咽喉头颈外科杂志202丨年 2 月第56 #第2 期（:丨丨in J ()t»>rhim>lar>ng»l Head Neck Surg, M>mar> 2021. V»l. 56, V>. 2
•新技术新材料-
Goldengate尚通量耳聋基因芯片在大如庭
水管综合征中的有效性验证及应用分析
吴宏蒋璐刘畅刘亚兰龙梦琦梅凌云贺楚峰蔡鑫章陈红胜冯永
中南大学湘雅医院耳鼻咽喉头颈外科耳鼻咽喉科重大疾病研究湖南省重点实验室，长
沙 410008
冯永现在南华大学附属长沙中心医院耳鼻咽喉科410004
通信作者：冯永，Email:***********************oni
【摘要】目的将Goldengale高通量耳聋基因芯片应用于大前庭水管综合征患者，验证芯片的
准确性及有效性，为制定更加详细的大前庭水管综合征遗传检测策略提供参考方法2016年8月
至2018年2月利用本研究团队研发的Goldmgate高通迓耳聋检测芯片，检测丨5例确诊为大前庭水管
综合征耳浮患者及60例健康人对照样本，并•利用S anyr测序法验证芯片检测结果所有大前庭水管
综合征患者均进行57X26,44基因测序，并与芯片结果进行对比分析结果12/15患者通过芯片检测
出.S’LC26,44椹W突变，通过芯片检测和SAC26.料基因直接测序共检出9种突变，其中7种突变被两种
方法均检出，该芯片可检测出基W1*£接测序法所提供的等位基因信息的93.33%( 28/30)除
•S/X26.44基因以外，丨5例大前庭水管综合征患者通过芯片还同时检测出、PC’/)///5、m C7、
M V Y沁以及线粒体基丨大丨的突变，并均经过S anyr测序法得到验证结论Goldengate*高通量耳聋基W
芯片具有检测潰盖广、准确性高等特点，可作为大前庭水管综合征患者的初步检测手段
【关键词】大前庭水管综合征；基因芯片
基金项目：湖南f t「丨然科学基•金（20丨7JJ3476)
Validation and analysis of Goldengate high-throughput deafness gene chip in detecting the
patients with enlarged vestibular aq u e d u ct syndrom e
Wu Hong, Jiang Lu, Liu Chang, Liu Yalan, Long Mengqi, Mei Lingyun, He Chufeng, Cai Xinzhang,
Chen Hongsheng, Feng Yong
Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery, Xiangya Hospital, Central South
University, Key Laboratory of Otorhinolaryngology, Hunan Province, Changsha 410008, China
Feng Yong is now in the Department o f Otorhinolaryngology, Changsha Central Hospital, University of
South China, Changsha 410004, China
Corresponding author: Feng Yong, Email: ***********************
【A bstract 】Objective To verify the accuracy and effectiveness of Goldengate
high-throughput deafness gene chip in detecting the patients with enlarged vestibular aqueduct
syndrome(EVAS), and to provide a reference for genetic detection strategy of EVAS. Methods From
August 2016 to February 2018, 15 patients with EVAS and 60 normal controls were detected by
Goldengate high-throughput deafness detection chip developed by our team, and the results were
verified by Sanger sequencing. SLC26A4gene sequencing was carried out in all the patients with
EVAS. Results 12/15 of patients with EVAS were detected mutations of SLC26A4gene. Nine
m utations were detected by chip detection and SLC26A4gene direct sequencing, seven of which
D O I： 10.3760/l 15330-20200302-00150
收稿日期2020-03-02 本文编辑金昕
引用本文：吴宏，蒋璐.刘畅，等.Goldengate高通量耳聋基W芯片在大前庭水管综合征中的有效性验证及
应用分析I J1.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2021. 56(2): 138-143.丨)()丨：10.3760/(ma. j.
cn115330-20200302-00150.
中 $丨〔鼻咽喉头颈外f’l H、202 I<丨'2 ).j 第 56 卷第2 期(Ihin .1()t«>rhi!i〇Unyng()l Head N<-ck Smg. I rhruary 2021, \Ol. 56. No. 2•139 •
were detected by both methods. The chip could detect 93.33%(28/30) of the allele information
provided by SLC26A4gene direct sequencing. In addition to SLC26A4gene, m utations of G]B2,
PCDH15, TMC1, MY06and mitochondrial genes were detected in 15 patients with EVAS. These
results were verified by Sanger sequencing. Conclusion Goldengate high-throughput deafness
gene chip possesses the traits of wide coverage and high accuracy, which can be used as a
preliminary detection method for patients with EVA S.
【
K e y w o r d s】Vestibular aqueduct enlargement syndrome; Gene chip
Fund program:Hunan Natural Science Foundation Project(2017)J3476)
耳聋是最常见的感觉神经性疾病:|,据报道，全球有2.5亿人患有中度以上听力损失2 :中国每 年约有3万先天性听力损失患儿出生:3]。

大前庭水 管综合征（enlarged vestibular aqueduct syn(ln>m t*，EVAS)是导致耳聋的疾病之一，1978年由 Valvassori等4首次报道EVAS是最常见的内耳畸 形，发病率为1%至1.3% 5 ,占儿童和青少年感音神 经性聋的1%〜12% M，我国尚无明确的发病率统 计:：EVAS可通过影像学确诊，现已明确为常染色 体隐性遗传性疾病，与位于染色体7q31的从C2(M4基因突变密切相关目前我国对E V AS的研究主要集中在从C26/W基因热点突变、热点突变 区域分析，及制定耳聋人群从C26/14基因热点突变 R域的筛查策略…主要米取的方式为Sanger测 序、基因芯片、区域性外显子测序等^，较少包含 除57^26.44以外的其他耳聋基因筛查，故E V AS是 否需要同时检测其他耳聋基因突变尚不可知即使全外显子测序的成本逐渐降低，测序时间缩短，但数据庞大、分析闲难，对于EVAS患者缺乏针对 性，故不建议将全外S子测序作为首要的筛查手 段。

基于以上原因，本课题组设计研发了Goldengate高通量耳聋基因芯片，着眼于中国人群 常见耳聋致病基因的突变位点，涵盖4 6个基W共 240个已知的常见耳聋突变位点，包括E V A S的常 见突变位点。

我们于2016年8月至2018年2月将 该芯片应用于EVAS患者，并与SLC26.44基因测序 结果进行比对，验证芯片对EVAS患者基因筛查的 有效性，为制定更加详细的KVAS遗传筛查策略及 产前诊断提供参考
材料与方法
一、研究对象
研究对象为15例听力下降、颞骨高分辨率C T 确诊为EVAS的患者，同时排除其他综合征型耳聋 或同时伴有其他内耳畸形的患者EVAS的诊断标准：高分辨率轴位CT层面从半规管总脚到前庭水
管外口的1/2处直径大于或等于1.5m m所有入
选EVAS患者均采集详细病史并绘制家系图谱
另外选取60名健康人作为对照组（无血缘关系，无
听力下降及其他遗传性疾病家族史）：
所有研究对象均来自中南大学湘雅医院耳鼻
咽喉科门诊，研究对象本人或其监护人均签署知情
同意书，该研究经中南大学湘雅医院伦理委员会审
批通过(编号201612808)
二、方法
1.Goldengate高通M耳聋基因芯片位点研发设 计：在人类基W突变数据库（hiima丨1genes mutation databases,HGMD) (http://www.hgnK /a c7 imiex.php)中分别查询每个非综合征型耳聋致病基
因的基本信息，然后统计每个基因已报道的各种类
型致病突变的氨基酸改变、致病类型，根据基w的
标准序列编号在UCSC Genome Browser(http:// genome,ucw.«hi/)中查询该基因的标准序列，并将
突变位点在序列中标记出来；查询CNKI和万方数
据库、Pubmed数据库中所有中国及国外耳聋基因
筛查相关文献，统计每个位点在国内外报道的次
数将所查询到的所有耳聋基因突变位点前后60
卟的序列提交给lllumina公司进行探针评分本
芯片的筛查位点包含常见的耳聋综合征，即Waardenburg综合征、Pendred综合征、Usher综合
征，其致病基因的位点统计与非综合征型耳聋步骤
相同考虑芯片的临床应用性，筛选检测位点的首
要原则为：世界范围内突变位点报道次数大于
2次，同时以中国人群报道次数较多的位点为主
筛选位点的其他原则为：（1 )相邻两个位点至少间
隔60个碱基以上，避免探针的重复；（2)选择探针
评分大于0.6的位点，热点突变位点探针评分在
0.5~0.6之间也纳入芯片；（3)点突变优先于长缺失
或插人突变：
2.DNA提取：抽取EVAS患者及对照组每人
5 nil外周血，应川传统氯仿法人工提取基W组DNA
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后备用。

3.Gokiengate高通量芯片检测及Sanger测序验 证、SLC26/14基因测序：Goldengate尚迪量耳聋筛查
芯片的操作流程按照美国Illumina公司提供的操作
手册严格执行，步骤简述如下：每个样本准备10 W
的DNA样本（浓度为50 ng/|xl),并与激活的Biotin
结合，洗去多余的Biotin,将寡核苷酸混合物、磁珠
和DNA-Biotin结合体混合，将DNA附着于磁珠表
面，特定的引物Oligo将与DNA杂交，清洗磁珠后
加人M aster mix进行延伸、链接并合成特异的短片
段，加入荧光标记好的通用PCR引物并使其结合，
进行PCR循环，同时使PCR产物与磁珠结合，过滤
并清洗磁珠，加人NaOH后离心收集解链的DNA，
在Illumina公司提供的Veracode板中进行杂交，去
除未杂交的DNA后，通过激光共聚焦微珠芯片扫
描仪用Illumina BeadScan软件进行芯片扫描，扫描
结果米用GenomeStudio软件分析。

芯片所获得的
突变结果均采用Sanger测序法进行验证并同时将
所有患者样本进行基因测序。

结 果
一、 Goldengate局通量耳聋基因芯片的特点
芯片设计后定制于美国Illumina公司，该芯片
在选点方面具有以下特点及优点：（1)240个耳聋
基因检测位点为中国人群常见的突变位点，适用人
群明确；（2)芯片覆盖46个基因，覆盖面广、实用性
强；（3)包含线粒体基因检测位点；（4)覆盖 SLC26/14的中国人群常见突变(表1)。

二、EVAS患者临床特征
15例EVAS患者中6例为女性、9例为男性，年
龄分布在I岁至23岁不等，语前聋占12/15,语后
聋占3/15,语前聋患儿中有2例在3个月前对声音
反应好；其中8/15为散发病例先证者，7/15为家系
先证者;2/15有头部外伤史，1/15的患者曾使用过庆
大霉素；1/15患者有水痘、麻疹病史。

全部患耳声导
抗均为A型曲线，耳声发射均未通过，均为极重度感
音神经性聋;颞骨高分辨率CT均显示为双侧前庭水
管扩大。

所有患者其他系统检查未发现异常。

三、EVAS患者基因检测结果
15例EVAS患者中，12例检测出SLC26/W基因突
变，其中2例为纯合突变，突变位点为C.IVS7-2A>G，
7例为复合杂合突变，3例为单纯杂合突变；3例未
检测出SLC26/14基因的突变，详见表2。

本研究共
表1Gokiengate高通量耳聋筛査芯片包含的SLC26/W基
因检测位点
基因名称定位氨基酸改变核苷酸变异表型
SLC26A47q31Ser57Term C>A NSR
(N M_
Ser90Leu C>T NSR
000441.1)
(0M I M：Prol 12Ser C>T E V A S 605646)Metl47Thr T>C E V A S
Glyl97Arg G>A E V A S
Ser252Pro T>C NSR
Met283Ile G>C E V A S
IVS7-2A>G PS/EVAS/NSR
IVS8+1G>A PS
Phe335Leu T>C PS
Ala372Val C>T NSR
Asn392Tyr A>T NSR
Thr416Pro A>C PS
IVS10-12T>A EVAS/NSR
Leu445Trp T>G PS
Ser448Term C>A NS R
Arg470His G>A NS R
Gly497Ser G>A NSR
IVS14+1G>A PS
IVS14-1G>A EV A S
Tyr556Cys A>G PS
Leu597Ser T>C PS
Val659Leu G>C NSR
His723Arg A>G PS/EVAS/NSR
Arg776Cys C>T E V A S 注：E V AS 为大前庭水管综合征；N S R(non-syndrome-recessive)为非综合征塑常染色体隐性遗传；PS(Pendred syndrome)为Pendred
综合征
检测到9种SLC2644基因突变类型，等位基因频率从高到低依次为C.IVS7-2A>G、c.IVS10-12T>A、c. 2168A>G、c. 1489G>A、c. 269C>T、c. 1174A>T、c.1343C>A、c.2T>C、c.2000T>C,前 7 种突变芯片及 直接测序法均有检出，详见表3。

除5/^2644基因以夕卜，15例EVAS患者应用 Goldengate 芯片还检测出、PCD//75、7WC7、m6以及线粒体基因的突变，突变位点依次为 G J B2c.235delC,G J B2c.571T>C,G J B2c.608T>C, P C D H15 c.785G>A, P C D H15c.400C>G ,T M C1
C.IVS21+5 g>a、MF06 c.647A>T、线粒体 12rsRNA 1555 A>G,其中线粒体12rS RNA 1555 A>G为均质 突变型，其余基因突变均为杂合突变。

以上结果均 通过Sanger测序法验证。

四、对照组基因检测结果
60名健康对照组中的1个样本检测出CJB 2
中华耳鼻咽喉头颈外科杂志2021 年 2 月第56 卷第 2 期Chin J Otorhinolaryngol Head Neck Surg，February 2021，Vol. 56, No. 2• 141 •表2 15例大前庭水管综合征患者基因芯片检测结果及SLC26/W基因测序结果
例序
SLC26.44(芯片结果）SZT26/W(测序结果）
等位基因1等位基因2等位基因1等位基因2
兵1t E垂囚liAM 禾
1 c.IVS7-2A>G c.IVS7-2A>G c.IVS7-2A>G c.IVS7-2A>G—
2 c.IVS7-2A>G c.IVS7-2A>G c.IVS7-2A>G c.IVS7-2A>G7WC7(.IVS21+5 g>a(杂合）
3c.1174A>T c.1343C>A c.1174A>T c.l343C>A c.571T>C(杂合)
4 c.IVS7-2A>G c.IVS10-12T>A c.IVS7-2A>G c.IVS10-12T>A—
5 c.IVS10-12T>A c.2168A>G c.IVS10-12T>A c.2168A>G线粒体12rsKNA 1555 A>G(均质型）
6 c.IVS7-2A>G c.IVS10-12T>A c.IVS7-2A>G c*.IVS10-12T>A G</52c.235delC(杂合)
7 c.IVS7-2A>G c.IVS10-12T>A c.IVS7-2A>G c:.IVS10-12T>A0/fi2(.235delC (杂合）
8c.1489G>A—c.14890A—PCD///5 r_400C>G(杂合）
9 c.269C>T— c.269C>T c_2T>C—
10 c.2168A>G— c.2168A>G——
11 c.IVS7-2A>G— c.IVS7-2A>G('2000T>C PCD///5 c..785G>A(杂合）
12 c.IVS7-2A>G— c.IVS7-2A>G——
13————PC D H I5c.785G>A( ^)M Y06c.647A>T( ^)
14 15—
__
—C^2c.608T>C (杂合）
注:一未检出
表3各突变位点等位基因频率统计
突变位点氨基酸改变等位
基因
数
等位基因
频率
SLC26A4c.IVS7-2A>G剪切区突变930.0% (9/30)
S[C26/Wc.rVS10-12T>A剪切区突变413.3%(4/30) SLC26A4c.2168A>G His723Arg2 6.7% (2/30) SLC26A4 c.\4S9G>A Gly497Ser1 3.3%(1/30) SLC26A4c.269C>T Ser90Leu1 3.3%(1/30) SLC26A4c.1174A>T Asn392Tyr1 3.3%(1/30) SLC26A4c.\343C>\Ser448Term1 3.3%(1/30) SLC26A4c.2T>C MetlThr1 3.3%(1/30) SLC26A4c.2000T>C Phe667Ser1 3.3% (1/30) GJB2c.235delC移码突变2 6.7% (2/30) GJB2c.571T>C Phel91Leu1 3.3%(1/30) GJB2c.608T>C Ile203Thr1 3.3%(1/30) PCDH15c.785G>A Gly262Asp2 6.7% (2/30) PCDH15c.400C>G Argl34Gly1 3.3%( 1/30)
M Y06c.647A>T Glu216Val1 3.3%(1/30) TMC1 C.IVS21+5 g>a剪切区突变1 3.3%(1/30)
c.235delC杂合突变，余未检出其他突变。

讨 论
一、Goldengate高通量耳聋基因芯片准确性验证
在本研究团队的前期工作中，设计并优化了 Goldengate高通量耳聋基因芯片。

该芯片包括46个基因的240个耳聋相关突变位点（扫描文章首 页右下角二维码，可浏览该芯片240个耳聋突变检 测位点），具有高通量、覆盖面广、针对性强的特点。

我们曾应用该高通量耳聋基因芯片对382例非综 合征型耳聋患者DNA模板进行检测，特异性和敏 感性分别为98.34%和98.73%,假阳性率和假阴性 率分别为丨.66%和1.27%, Youden系数（y)为0.97，+LR(positive likelihood rate)及-LR(negative likelihood rate)分别为59.49和0.01，证明该芯片在 非综合征型耳聋患者遗传学筛查中的实用性及准 确性[22]。

本研究EVAS患者的芯片检测结果均得 到了直接测序法的验证，再次证明了 Goldengate高 通量耳聋芯片的准确性。

二、Goldengate高通量耳聋基因芯片在EVAS 患者中的应用分析
该芯片中包含了 SLC26/W的25个中国人群常 见的已知致病位点。

SLC26/14基因突变率高达80.0% (12/15), 15例患者共检测出9种突变，按照 等位基因频率排序依次为c.IVS7-2A>G、c. 1VS10-12T>A、c_2168A>G、c.1489G>A、c_269C>T、c.l174A>T、c.1343C>A、c.2T>C、c.2000T>C，通过芯 片可测出前7种突变（芯片未包含后2个检测位 点）。

双等位基因突变频率为9/15,其中2/9为纯合 突变，7/9为复合杂合突变;单等位基因突变频率为 3/15。

芯片突变检测的准确率为100%,该芯片可 提供SLC26/W 基因直接测序法所提供的等位基因
•142 •11半再鼻咽喉头颈外科杂志 202 1年 2 月第56 卷第 2 期（:丨】in J 〇t»»rlii"<»lar>.iig(>l Hra<l、—e(.k Surg. Ft.hruar〉.2()21. \ 〇1. 56. \〇. 2
信息的93.3% (28/30),明确9/15 EVAS患者的病W,充分说明了芯片的实用有效性：
另外，n前对于KVAS患者的遗传检测主要集 中在SA C26，W基因，与其他研究不同，本研究通过 GoUlengate|W】通量基W芯片进行多基因多位点的f
谱检测，发现EVAS患者可同时携带C_/«2、pc/)///5、'n/c7、i m)6以及线粒体基因的突变，携 带的C州2、PCD///5、77W C/、M V06基因突变位点均 为常染色体隐性遗传线粒体基因为母系遗传，其 中1例患者为线粒体丨2rsRNA 1555 A>G的均质型 突变，链霉素和其他氨基苷类抗生素的使用可以使 其发生感音神经性聋,但该患者无氨基糖苷类抗生 素用药史，其耳聋可能与该突变关系不大。

本研究 筛查出的除从C26/14基因以外的其他基W突变，虽 然不支持其为致病原W，但对于患者后代的产前诊 断及用药指导具有重大意义同时,此结果提示进 行产前诊断或移植前诊断时，为了避免出现耳聋后 代，EVAS患者的遗传学检测不能局限于SLt：26/l 4基因。

二、Goldengate高通量耳聋基因芯片检测EVAS患者的优势与不足
EVAS的早期诊断格外重要，尤其对于尚未出 现听力下降的患者，可以给与预防耳聋的医学指 导另外，对于有家族史的家庭中进行产前诊断或 者植人前诊断，基因检测同样非常重要基因筛查作为一种快速、准确、低成本、无辐射的方式，可作 为一级预防的首选方式之一我们将Goldengate 高通量耳聋基因芯片与其他检测方式进行了总结 及比较（表4 )，目前常用的EV AS患者基W检测手 段为Sanger测序、基W芯片、二代测序平台、区域性 外®子测序等。

随着遗传检测方式的迅速发展，各 检测手段在效率及成本上相差不多，但GoW engate 高通i t耳聋基W芯片在突变检出率和确诊率、检测 范围上具有明显的优势，为产前诊断及移植前诊断 提供了更丰富的信息：本芯片的不足之处在于虽 然可提供绝大部分从C2&W直接测序法的结果，但 患者仍不能确诊时，建议复测一次.S/X'26/W测序：本研究中的(;〇l(lengate尚通M耳聋芯片准确、广谱、实用，可应用于EVAS患者的初步基因筛查，若患者同时携带从C26/14及其他基W的突变，nf考 虑进一步检测，必要时完善全外显子测序，以做到 早期发现、早期预防，为遗传咨询与婚育指导、产前 诊断、移植前诊断等提供参考依据
利益冲突所有作荇均卢明不存fr:利益冲突
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表4大前庭水管综合征患#遗传检测方式比较
检测方式检测范围突变检出率确诊率参考义献基丨与芯片、〇/幻、SLC2644、线粒体丨2SrRN' A基因突
变位点
65.38%30.77%[14]
基因芯片SLC26A4C.IVS7-2AX；,c.2168A>(；26.08%23.08%[15]
基于高通量测序的多重P C R试剂盒SLC26A4,F O X ll, KCMJ10%lc k59%[16]
堪T二代测序H标丨X:域检测试剂盒S Z X'26/^，fY A Y//，/JCVy/0及其余10 个与前庭
导水管扩大相关的基W
—72%[17]
多ifi: PC R联丨on Torren 1'M:代测序技水18个基因的100个突变位点仅1个家系仅1个家系[18] Sanger测序SLC26以编码外显子39%21.7%[19] Sanger测序.S7乂:26,44编码外g子仪1〜2个家系仅1~2个家系[20-21] Goldengate高通量耳聋基因芯片46个基因的240个突变位点12/159/15本文注:一未注明
中卞{.f 鼻咽喉头颈外科/丨2021 化 2 月第56 卷第2 期Chin J 0丨orhiiiolaryngol Head IN V rk Surg. February 2()2 丨.V()丨.56, No. 2•143 •
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下期要目
加速康复外科在耳鼻咽喉头颈外科的现状和发展（述评）
声带麻痹诊断及治疗专家共识（诊疗方案）
声带麻痹诊断及治疗专家共识解读（方案指南解读）
加速康复外科在下咽癌手术治疗中的应用研究（论著）
多学科协作下加速康复外科理念在喉癌手术中的应用（论著）
基于加速康复外科理念的围手术期气道管理对阿司匹林耐受不良三联征患者 术前肺功能改善的疗效分析(论著）
加速康复外科理念在阻塞性睡眠呼吸暂停外科中的应用（学术讨论）
多学科联合在耳鼻咽喉头颈外科围手术期加速康复外科中的应用（继续教育园地)。