调节性T细胞与同种异体反应性细胞 在移植耐受中的作用探讨

学 校 代 码 10459 学号或申请号 201212443289 密 级 公 开 硕 士 学 位 论 文 调节性T 细胞与同种异体反应性细胞 在移植耐受中的作用探讨 国家自然科学基金项目（81172835） 作 者 姓 名：马雪涵 导 师 姓 名：贺付成 教授 指 导 老 师：明 亮 教授 郑配国 博士 学 科 门 类：医 学 专 业 名 称：临床检验诊断学 培 养 院 系：郑州大学第一附属医院 完 成 时 间：2015年5月
A thesis submitted to
Zhengzhou University
for the degree of Master
Role of regulatory T cells in transplant tolerance and alloreactive T cell in clonal deletion
By Xuehan Ma
Supervisor：Prof. Fucheng He
Prof.Liang Ming
Doctor.Peiguo Zheng Department of Clinical Laboratory Diagnostics The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University
May 2015
II
原创性声明
本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。

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学位论文作者：日期：年月日
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保密论文在解密后应遵守此规定。

学位论文作者：日期：年月日
III
摘要
调节性T细胞与同种异体反应性细胞在移植
耐受中的作用探讨
硕士研究生：马雪涵
导师：贺付成明亮郑配国
郑州大学第一附属医院检验科
河南郑州450052
摘要
背景与目的
器官移植中，能够诱导和维持特定组织耐受的免疫抑制方案最终将会取代免疫抑制治疗。

使用共刺激和辅助受体阻滞的短期治疗方式会实现耐受诱导和长期耐受，运用一系列机制可以实现对外周免疫系统的重新编码。

胸腺和外周免疫系统中的Foxp3+Tregs可以形成稳定的T细胞谱系，Treg 脱甲基区域的去甲基化能够对此进行识别，从而提供了新的治疗方向。

对Foxp3+Treg的表达调控，可以进行针对性的治疗。

外周免疫系统中，CD4+ T 细胞诱导的Foxp3表达理论上能够在活体中产生稳定的Foxp3+Treg。

通过辅助受体和阻断协同刺激信号来实现移植耐受取决于活体的Foxp3+ Tregs诱导以及诱导的持续存在。

但是这些抗体在临床上仍未广泛运用。

动物模型中，移植耐受可以通过几种不同的方式中现，其共同的主题都是实现体内Foxp3+ Tregs的诱导。

随着药物复合物的出现，动物实验结果应用于临床将成为可能。

材料与方法
1．雌性BALB/c小鼠与雄性C57BL/6小鼠杂交一代，获得F1小鼠，高低不同剂量的F1小鼠脾脏细胞经眶底静脉输注到新生24 h C57BL/6小鼠体内，诱
I
摘要
导不同程度的耐受。

2．诱导的新生耐受小鼠六周后移植F1小鼠来源的皮肤，建立不同耐受程度的小鼠移植耐受模型。

3．耐受小鼠脾脏细胞经CFSE标记后注射到F1小鼠体内，分析耐受小鼠来源的T细胞在体内对F1抗原的增殖能力。

4．通过流式细胞学、过继转移实验分析CD4+Foxp3+调节性T细胞在移植耐受和移植排斥过程中的表达。

结果
1．C57BL/6小鼠在新生期输注F1小鼠脾脏细胞可诱导移植耐受，耐受程度与输注的脾脏细胞剂量有关，3×107个F1小鼠脾脏细胞可诱导C57BL/76小鼠长期皮肤移植耐受，1×107个细胞诱导可使移植皮肤生存时间显著延长，但在50天内完全排斥。

2．体内混合淋巴细胞反应实验证明，长期耐受小鼠体内的同种异体反应性T细胞被完全克隆清除，但低剂量组小鼠体内仍存在一定数量的反应性T细胞。

3．流式细胞学分析发现，高剂量和低剂量组小鼠体内的CD4+Foxp3+调节性T细胞表达与初始小鼠相比没有显著差异
4．耐受小鼠过继转移同种异体反应性T细胞，移植耐受的皮肤发生排斥反应，小鼠体内的调节性T细胞表达升高。

结论
1．小鼠的移植耐受程度与小鼠体内的同种异体反应性T细胞的克隆清除程度有关。

2．小鼠的移植耐受程度与小鼠体内CD4+Foxp3+调节性T细胞的表达没有直接关系。

3．调节细胞在移植排斥过程中表达升高，可能作为一种反馈机制参与耐受的形成。

关键词：同种异体反应性T细胞调节性T细胞移植耐受克隆清除
II
Abstract
Role of regulatory T cells in transplant tolerance and
alloreactive T cell in clonal deletion
Postgraduate:Xuehan Ma
Supervisor：Fucheng He; Liang Ming;Peiguo Zheng
Department of Clinical Laboratory Diagnostics
The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University
Zhengzhou Henan 450052
Abstract
Background and objective
Immunosuppressive regimens capable of inducing and maintaining tissue- specific tolerance will eventually replace life-long immunosuppressive treatment in organ transplantation.Short-term treatment with costimulation and coreceptor blockade induces robust and lasting tolerance, and exposes mechanisms that can be exploited to reprogram the peripheral immune system.
Committed Foxp3+ Tregs derived from the thymus or peripheral immune system form a largely stable T-cell lineage, can be identified by demethylation of the Treg-specific demethylated region and have therapeutic potential.Regulation of Foxp3 expression and Foxp3+ Treg lineage commitment is under epigenetic control and can be targeted therapeutically.
In the peripheral immune system, Foxp3 expression induced in naive CD4+ T cells in the presence of antigen can, in principle, generate stable and committed Foxp3+ Treg generation in vivo.Transplantation tolerance via coreceptor and costimulation blockade depends on the in vivo induction of Foxp3+ Tregs and their continuous presence. However, these antibodies are not currently available for routine clinical use.
Transplantation tolerance can now be achieved in several animal models
III
Abstract
following different approaches, with the common theme being induction of Foxp3+ Tregs in vivo. Clinical translation of these animal studies may be facilitated by the emergence of pharmacological compounds potentiating regulation. Establishing the rules for enhancing Foxp3+ Tregs from within the patient is therefore likely to yield attractive and novel approaches to minimize immunosuppression in graft recipients.
Methods
F1 mice were bred by crossing female BALB/c mice and male C57BL/6 mice. Within 24 h, newborn C57BL/6 mice were inoculated with F1 spleen cells via the orbital branch of the anterior facial vein. Six weeks later, the mice were subjected to F1 skin grafting to evaluate their tolerance. Proliferation, flow cytometry and adoptive transfer assay were used to analyze clonal deletion of alloreactive T cells and the expression of CD4+Foxp3+ T cells in neonatal treated mice.
Results
Newborn C57BL/6 mice injected with F1 splenic cells could induce transplantation tolerance, the level of tolerance was associated with the dose of splenic cells. 3×107splenic cells from F1 mice could induce long-term skin graft acceptance in C57BL/6 mice, 1×107splenic cells significantly prolonged the survival of F1 skin grafts, but the grafts completely rejected within 50 days. The mixed lymphocyte reaction (MLR) experiment in vivo showed that alloreactive T cell in long-term tolerant mice was deleted completely, but a certain amount of reactive T cells existed in the low-dose group mice. Flow cytometry (FCM) analysis showed that the expression of CD4+Foxp3+ T cell in the high-dose group and low-dose group mice had no obvious difference compared with the naive mice. When alloreactive T-cells were injected into tolerant mice, the skin graft rejection was observed, and Treg cells upregulated in graft-rejected mice.
IV
Abstract
Conclusions
The degree of transplantation tolerance depended on the clonal deletion of alloreactive T cells, instead of on the expression of CD4+Foxp3+Treg cells. CD4+Foxp3+regulatory T cells upregulated in graft rejected mice, which may be served as a negative feedback mechanism to control the intensity of rejection.
Key words：Alloreactive T cell，Regulatory T cell，transplantation tolerance，clonal deletion
V
目录
目录
中英文缩略词表 (I)
调节性T细胞与同种异体反应性细胞在移植耐受中的作用探讨 (1)
引言 (1)
材料与方法 (3)
1 实验动物 (3)
2 主要试剂和仪器 (3)
3 试剂配制 (4)
4 试验方法 (4)
5 统计学处理 (7)
结果 (8)
1 皮肤移植模型的建立 (8)
2 新生期诱导小鼠移植耐受 (8)
3 同种异体反应性T细胞的克隆清除与移植耐受的关系 (11)
4 CD4+ Foxp3+ T细胞在移植耐受及免疫应答中的作用 (13)
5 CD4+Foxp3+ T细胞在移植排斥中的作用 (13)
讨论 (16)
结论 (18)
参考文献 (19)
综述 (20)
调节性T细胞与移植耐受的关系 (20)
1 外周调节 (21)
2 CD4+ Tregs的稳定性和可塑性 (22)
3 Treg的分化 (23)
4 Foxp3+ Treg的种类 (25)
5 Foxp3 + Treg在移植耐受中的作用 (27)
6 临床应用 (29)
VI
目录
7 发展前景 (31)
个人简历、在读期间发表的论文 (39)
致谢 ........................................................................................... 错误!未定义书签。

VII
中英文缩略词表
I
中英文缩略词表
英文缩写 英文全称 中文全称 Ab antibody 抗体 APC antigen-presenting cells 抗原递呈细胞 CD CM DC FBS Ig IL PBS TGF Treg FCM CTLA-4 MHC cluster of differentiation complete medium dentritic cells fetal bovine serum immunoglobulin interleukin phosphate buffered saline transforming growth factor regulatory T cell Flowcytometry tytotoxin T lymphocyte antigen-4 major histocompability complex 分化抗原簇 完全培养液 树突状细胞 胎牛血清 免疫球蛋白 白介素 磷酸盐缓冲液 转录生长因子 调节性T 细胞 流式细胞术 细胞毒性T 细胞相关抗原-4 主要组织相容性抗原复合物
引言
调节性T细胞与同种异体反应性细胞在移植
耐受中的作用探讨
硕士研究生：马雪涵
导师：贺付成明亮郑配国
郑州大学第一附属医院检验科
河南郑州450052
引言
目前，器官移植已逐渐成为终末器官功能衰竭患者的常规治疗选择。

多种免疫抑制剂的发现对器官移植具有划时代的意义，心、肝、肾等移植器官的存活时间明显延长。

排斥反应是器官移植失败的重要原因，抑制排斥反应，诱导机体针对供体移植物抗原特异性耐受是解决移植排斥反应，是器官移植研究的热点[1, 2]。

免疫抑制剂可使移植物的短期生存时间明显延长，然而长期疗效并不显著，且有明显的毒副作用，恶性肿瘤及机会性感染的发病率明显等增多，且其对移植物的长期生存疗效较差[3]。

目前，移植耐受机制仍不完全清楚，嵌合体、同种异体反应性T细胞克隆清除[4]、调节性T细胞[5]等机制均可能参与移植耐受的形成。

近年来，调节性T细胞在诱导耐受和维持受体对移植物的耐受中的作用受到越来越高的关注。

移植耐受机制的研究已有近70年的历史，这些研究对器官移植在临床的应用起到绝对的推动作用，特别是新一代免疫抑制剂如环孢他克莫司Tacrolimus(FK506)、菌素CsA类、雷帕霉素Rapamycin(RPM)及其衍生物SDZ RAD、Mizoribine(MZ)等于19世纪七十年代不断问世，器官移植的成功率得到很大的提高。

然而直到目前，肾移植5年存活率为60％，10年存活率仅为1% ，如何进一步提高移植器官的长期存活率已成为当务之急。

诱导器官特异性耐受，是解决当前长期存活率低的理想方法，可以预防慢性排斥反应和急性排斥反应，避免长期服用免疫抑制剂从而减少了药物的毒副作用[6]，这也是近年来器官移植研究的热点。

Taylor等[7]发现，CD4+Foxp3+调节性T细胞（CD4+Treg）参与抗CD40L抗体诱导的移植耐受，清除体内的CD4+Treg，则T 细胞对移植抗原的反应性恢复，移植耐受状态破坏。

CD4+Treg已成为免疫学研
1
引言
究的热点，但其在移植耐受中的作用尚需进一步研究[15]。

2
材料与方法
材料与方法
1 实验动物
BALB/c、C57BL/6、GFP-C57BL/6品系小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司；雄性C57BL/6与雌性BALB/c小鼠杂交获得F1小鼠；雄性GFP-C57BL/6与雌性BALB/c小鼠杂交获得GFP-F1小鼠；动物饲养于河南省实验动物中心独立通风饲养环境中（individual ventilated cages, IVC）。

2 主要试剂和仪器
2.1 试剂
RPMI 1640培养基，Hyclone公司；大鼠抗小鼠流式抗体CD4-FITC（GK1.5）、CD8-PE（53-6.7）、Foxp3-eFluor 660购自eBioscience公司；流式细胞仪FACS caliber（Becton Dickinson,USA）。

2.2 仪器
倒置显微镜，Nikon公司；荧光显微镜，Carl Zeiss Germany；Milli-Q超纯水制造系统，四川宜科纯水设备有限公司；超净台，苏州京虹实验设备有限公司；恒温电热鼓风干燥箱，苏州安泰空气技术公司；恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；高压蒸汽灭菌锅，南京华安医疗器械厂；快速混匀器，金坛市万华实验仪器厂；电子分析天平AE200S，上海特梅勒-托利多；电子移液器（Eppendorf）;-80℃超低温冰箱，日本三洋公司；普通4℃冰箱，日本三洋公司；
2.3 耗材
1 ml无菌注射器；15ml、50ml离心管，BD Falcon公司；眼科剪刀；眼科镊子；0.22μm 一次性滤器（Millipore）；5ml吸头，EP管，PCR管，北京康为世纪生物科技有限公司；
3
材料与方法
3 试剂配制
3.1 磷酸缓冲盐溶液（PBS）
800ml双蒸水溶解0.2g KCl，8g NaCl,0.24g KH2PO4和3.63 g Na2HPO4 12H2O。

盐酸调PH至7.4，加水定容至1L。

125o C高压灭菌30分钟，或0.22μm 过滤除菌后使用。

3.2 2%戊巴比妥钠溶液
生理盐水溶解戊巴比妥钠，配制成2%的戊巴比妥钠溶液，0.22μm滤器过滤，分装4o C保存。

3.3 4% 多聚甲醛溶液
将4 g多聚甲醛溶于PBS中，定容至100 ml，在密闭容器中于65o C水浴中溶解，4o C保存（两周后使用）。

3.4 红细胞裂解液
0.1mM Na2EDTA、10mM KHCO3、0.15M NH4C l、PH 7.2-7.4，0.22μm 过滤，分装4o C保存。

4 试验方法
4.1 小鼠脾脏细胞制备
1)6-8周龄F1小鼠,脊椎脱臼处死，放入75%的酒精5分钟。

2）无菌取出小鼠脾脏后，置于装有无菌磷酸盐缓冲液的平皿内，用 1 ml 一次性无菌注射器针蕊充分研磨，使之成为单细胞悬液。

3）将细胞收集到15 ml离心管中，1500 r/min 离心5 min，弃去上清液，用干燥洁净的吸管反复吹打细胞，加入红细胞裂解液，室温下作用1 min。

4）加入3倍体积PBS终止反应，用玻璃吸管去除细胞悬液中的絮状物或将脾脏悬液倒入70 μm的细胞研磨滤网中过滤，除去组织团块。

5）1500 r/min离心5min，弃上清，加入10 ml PBS，混匀后计数。

6）根据诱导细胞剂量定容。

4
材料与方法
4.2 体内增殖实验
用F1小鼠脾脏细胞诱导的不同耐受程度的新生小鼠，待其成年后，取脾脏细胞，经CFSE标记后注射到新生耐受小鼠体内研究同种异体反应性T细胞在体内的增殖情况。

操作步骤：
1）新生耐受小鼠成年后，取脾脏，制备制备高、低剂量组脾脏细胞混悬液；
2）调整细胞浓度为2×107/ml;
3）荧光染料2-羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）终浓度为2ug/ml，细胞和染色剂1:1混合，室温染色8分钟;
4）用含5%FBS的冷PBS洗涤细胞三次，将细胞浓度调整为1×108/ml，静脉注射入F1小鼠体内；
5）将naive C57BL/6小鼠和F1小鼠的脾脏细胞进行CFSE标记，作为增殖阳性对照和同系对照。

6）第6天，取F1小鼠脾脏细胞，CD4-PE抗体标记后流式细胞仪分析细胞增殖情况。

4.3 耐受破坏实验
1）Naive C57BL/6小鼠脾脏细胞经尾静脉注射到移植耐受小鼠体内，4×107个/只，共5只；
2）Naive C57BL/6小鼠的脾脏细胞静脉注射到Naive C57BL/6小鼠体内作为对照;
3）第5天，取脾脏细胞制备脾脏细胞悬液，CD4-PE抗体标记，需破膜固定，Foxp3-APC抗体染色，流式细胞仪分析结果。

4.4 流式细胞术分析Treg的数量
4.4.1 细胞表面染色
1）脾脏来源的单个核细胞1×106每管（体积约100ul），加入FITC anti-CD4 或PE anti-CD4 0.3μl，APC anti-CD44 或APC anti-CD62L 1μl，置于4o C避光结合30分钟，期间混匀一次。

2）加PBS1-2 ml洗涤，与4o C 450g离心5分钟，弃上清。

5
材料与方法
3）加PBS1-2 ml再次洗涤，弃上清。

4）加300-500μl 2%多聚甲醛固定，上机检测。

4.4.2 CD4+Foxp3+ T细胞染色
1）取1×106细胞，每管加FITC anti-CD4 或PE anti-CD4 0.3ul，置于4o C 避光结合30分钟，期间混匀一次。

2）加1-2 ml预冷PBS洗涤，于4o C 450g离心5分钟，弃上清。

3）重悬细胞，每管加1 ml新鲜配制的Fixation/Permeabilization（临用前配制，Fixation/Permeabilization Concentrate：Fixation/Permeabilization Diluent 1：3）工作液，再次混匀。

4）4o C冰箱中固定30分钟。

5）每管加2ml新鲜配制的1× Permeabilization Buffer，4o C 450g离心5分钟，弃上清。

6）每管再次加2ml 1×Permeabilization Buffer洗涤，4o C 450g离心5分钟，弃上清（剩余体积约100μl）。

7）每管加APC anti-Foxp3 抗体1μl，置4o C冰箱中结合30分钟。

8）每管加2ml 1× Permeabilization Buffer，离心，弃上清。

9）重复步骤8。

10）上机检测。

4.5 新生小鼠眼底静脉注射
1）取6-8周龄F1雌性小鼠，取其脾脏，制备脾脏单个核细胞悬液；
2）根据诱导耐受所用细胞量配制相应浓度细胞悬液；
3）用加样枪分别吸取100 μl和150 μl PBS置15 ml离心管盖上；
4）用0.45mm棕色静脉输液针分别吸取上述体积液体，记号笔在液管外围标记液面所在位置；两液面之差即为50 μl体积所占静脉输液针长度；
5）从静脉输液针起始处标定静脉输液针（50/100/150/200μl）；
6）将静脉输液针安装在1 ml注射器上；
7）吸取细胞悬液致静脉输液针内，用止血钳在液面前部固定，起到精确定量的作用。

8）左手固定新生小鼠，使眶静脉暴露；
6
材料与方法
9）将静脉输液针针头刺入静脉内后松开止血钳，缓慢注射入50 μl细胞悬液；
10）止血钳在液面前部固定，拔出针头；
11）棉球按压止血。

4.6 皮肤移植模型
1）新生24 h内的C57BL/6小鼠分成高、低剂量组；
2）将F1小鼠脾脏细胞悬液经眶静脉注射到C57BL/6小鼠体内（高剂量组：3×107个细胞/只，低剂量组：1×107个细胞/只，每组10只小鼠）；
3）小鼠诱导耐受后第六周进行皮肤移植手术；
4）腹腔注射戊巴比妥钠（70mg/kg）麻醉受体小鼠，F1小鼠6-8周龄，作为皮肤移植供体；
5）将供体小鼠背部毛发剃除，暴露背部皮肤，手术剪刀裁取1.5cm左右大小的皮片；
6）用镊子去背部皮片下的筋膜；
7）剃除新生耐受小鼠背部毛发，暴露背部；
8）酒精擦拭，用手术剪刀将其裁剪开稍大于批片的四方创口；
9）处理过的皮片置创口处，供体皮片毛发与受体背部毛发方向相反；
10）缝合皮片，四角各一针，中部至少三针，剪去剩余的缝合线；
11）将青霉素粉末涂于创面处；
12）将直径为1.5-2cm大小的方块的，浸有凡士林的纱布覆盖于创面上；
13）凡士林纱布上放适当大小的消毒棉球，棉球上再次放置双层纱布；
14）用缝合线将小鼠皮肤与纱布四角固定;
15）用医用胶布环绕缝合包四周（防止小鼠将纱布咬脱）；
16）将F1小鼠背部皮肤移植到10只naive C57BL/6小鼠的背部，作为对照组。

17）手术后第七天拆线，绘制皮肤移植物生长曲线。

5 统计学处理
依据随机分组原则进行实验设计，将研究对象随机分到不同处理组，采用t 检验分析两组间差异，应用SPSS13.0软件进行统计学分析，检验水准为0.05。

7
结 果
8 结 果
1 皮肤移植模型的建立
移植耐受的研究模型广泛选用小鼠的皮肤移植。

皮肤移植具有经济、简易、结果判断直观等诸多优势。

根据移植部位，小鼠皮肤移植可分为背部、胸部、尾部法。

其中，背部移植由于移植片较大、易于观察等优势被广泛应用。

根据手术步骤，小鼠皮肤移植又可分为皮片缝合和包扎两部分。

皮片缝合可有效防止移植片的脱落和移位，然而，仍然可看到一些学者仅仅将移植片附于创面上而未进行缝合。

小鼠皮片的固定是移植手术中的难题，这也是导致成功率不高的重要原因。

在实验过程中我们尝试了不同方法。

如用纱布环绕小鼠腰部包扎的方法，人皮肤移植的方法，背部皮肤移植法，尾部皮片移植套管固定法等，但均存在各种各样的问题。

最终我们选定背部皮肤背部移植法作为皮肤移植的最佳方案。

该方法具有操作时间短（熟练后可达30分钟一只），小鼠活动不受限制，手术成功率高，结果易于判断等优点。

图 1 背部皮肤背部移植法（新生耐受小鼠）
2 新生期诱导小鼠移植耐受
哺乳动物在新生期输注供体来源的脾脏细胞或组织可诱导针对供体移植物的特异性耐受[12, 13, 14]，与之相对应，同样的诱导方法却不能使成年动物形成耐受。

目前认为新生耐受产生的机理是：胚胎期和新生期小鼠的免疫系统尚未发
结 果
9 育健全，即处于“null”状态，此时接触的任何抗原机体免疫系统都将识别为“自我”，成年后耐受小鼠对而对第三方抗原有正常的免疫应答供体来源的器官移植物耐受。

我们用60Co 照射处理的脾脏细胞进行耐受诱导实验。

BALB/c 雌性小鼠，6-8周龄，制备小鼠脾脏细胞悬液。

60Co 照射，照射剂量为3000 rd 。

将50 μl 体积含1.5×107 个BABL/c 脾脏细胞的悬液经眶静脉注射到新生24小时内的C57BL/6小鼠体内。

六周后，将BALB/c 雌性小鼠（6-8周龄）的尾部皮肤移植到新生期处理过的C57BL/6小鼠背部，naïve C57BL/6小鼠作为对照，每组大于5只，如图所示（表-1）。

新生期处理过的C57BL/6小鼠耐受皮肤移植物的时间是10±2.0天，对照组皮肤移植物存活时间为11±2.4天。

t 检验统计分析，(t=1.06,P >0.05)，两组间差异没有统计学意义。

照射处理的BALB/c 小鼠脾脏细胞不能诱导C57BL/6小鼠形成耐受。

将BALB/c 雌性小鼠和C57BL/6雄性小鼠交配获得子一代（F1）小鼠。

6-8周龄的F1小鼠，雌性，将1.5×107照射处理的F1脾脏细胞注射到新生24小时内的C57BL/6小鼠体内。

六周后，将F1雌性小鼠（6-8周龄）的尾部皮肤移植到新生期处理过的C57BL/6小鼠背部，naïve C57BL/6小鼠作为对照，每组大于5只。

新生期处理的C57BL/6小鼠耐受皮肤移植物的时间是9±2.5天，对照组皮肤移植物存活时间为11±2.4天（表-1）。

照射处理的F1脾脏细胞也不能诱导耐受，反而使耐受时间有一定缩短。

t 检验统计分析，(t=1.46,P >0.05)，未发现两组间差异有统计学意义。

我们用活的BALB/c 小鼠脾脏细胞诱导耐受，方法同上。

BALB/c 活细胞静脉输注的新生小鼠多数在处理3天内死亡，少量存活的新生小鼠均发生侏儒症，小鼠不能正常发育。

BALB/c 小鼠脾脏细胞中含抗C57BL/6小鼠抗原的T 淋巴细胞，结合文献报道，我们认为形成侏儒症的原因在于GVHD 的发生。

F1小鼠不含抗BALB/c 小鼠抗原和C57BL/6小鼠抗原的T 淋巴细胞，不会发生GVHD 反应。

因此，我们改用F1小鼠的脾脏细胞作为耐受诱导细胞。

将50 μl 含1.5×107 个F1雌性小鼠（6-8周龄）脾脏细胞输注到新生24小时 C57BL/6小鼠体内。

六周后，将F1雌性小鼠（6-8周龄）尾部皮肤移植到新生期处理的C57BL/6小鼠背部，每组大于10只。

新生期输注F1细胞的小鼠耐受F1小鼠皮肤移植物的时间明显延长，有80%的小鼠耐受F1皮肤大于30天，移植后100天时仍有20%的小鼠耐受皮肤移植物。

实验结果证明，只有具有增殖zkq 20150910
结果
活性的F1小鼠脾脏细胞才具有诱导新生移植耐受的能力。

分别用细胞浓度为1.4×108/ml，6.0×108/ml的雌性F1小鼠脾脏细胞悬液诱导C57BL/6小鼠新生耐受，每只输注体积为50 μl，即分别用0.7×107（low），3.0×107（high）的细胞数量诱导耐受。

6周后，进行F1小鼠皮肤移植，naïve C57BL/6小鼠作为对照，结果见图3。

低剂量F1细胞诱导的小鼠仅使F1皮肤移植物轻度延长，平均存活时间为14天，少数可耐受移植物达30天以上，没有小鼠长期耐受皮肤移植物；高剂量F1细胞可诱导小鼠长期耐受，耐受时间大于100天，仅少量小鼠在60天后出现排斥现象。

我们的实验结果完全证明了我们的假设。

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图2 不同剂量F1小鼠脾脏细胞诱导新生C57BL/6小鼠移植耐受，成年后皮肤移植物生长曲线。

新生24小时内C57BL/6小鼠静脉输注不同剂量F1雌性小鼠脾脏细胞。

low：0.7×107每只小鼠；high：3.0×107。

6-8周后，新生耐受小鼠移植F1小鼠皮肤，观察小鼠耐受情况。

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结 果
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图3 小鼠在新生期输注F1小鼠脾脏细胞可诱导移植耐受，耐受程度与输注的脾脏细胞剂量有关。

Tolerance ：高剂量组小鼠耐受F1小鼠移植皮肤；Rejection ：Naive C57BL/6小鼠迅速排斥移植的F1小鼠皮肤。

3 同种异体反应性T 细胞的克隆清除与移植耐受的关系
移植排斥是T 细胞介导的细胞免疫应答，CD4+CD25-T 细胞是排斥反应的主要效应细胞。

那么，效应性T 细胞的克隆清除是否是耐受形成的主要原因呢？0.7×107（low ），1.5×107（middle ），3.0×107（high ）F1细胞诱导的新生耐受小鼠，六周后取脾脏，制备脾脏细胞悬液，经CFSE 染色后静脉注射入F1小鼠体内，第6天，取F1小鼠脾脏细胞，CD4-PE 抗体标记，流式细胞术检测分析细胞增殖情况。

高剂量F1小鼠脾脏细胞诱导的长期耐受小鼠，体内的同种异体反应性T 细胞被完全克隆清除，效应性T 细胞在F1小鼠体内增殖3.18%，低剂量F1小鼠脾脏细胞诱导的耐受小鼠，体内仍然存在一定数量的同种异体反应性T 细胞，效应性T 细胞在F1小鼠体内增殖18.7%，统计分析两组间差异具有显著性，t 检验统计分析（t=3.98,P <0.05）图4。

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结果
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图4 不同剂量F1小鼠脾脏细胞诱导的新生C57BL/6小鼠成年后的脾脏，经CFSE染色后，尾静脉注入F1小鼠体内后的增殖情况。

Naive：naive C57BL/6小鼠脾脏悬液静脉注入F1小鼠体内；Control：高剂量F1小鼠脾脏细胞静脉注入F1小鼠体内；High：高剂量组小鼠脾脏静脉注入F1小鼠体内；Low: 低剂量组小鼠脾脏细胞静脉注入F1小鼠体内。

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结果
4 CD4+ Foxp3+ T细胞在移植耐受及免疫应答中的作用
取高（3.0×107 F1小鼠脾脏细胞诱导的小鼠）、低（1.0×107 F1小鼠脾脏细胞诱导的小鼠）剂量组小鼠脾脏，制备脾脏细胞悬液。

脾脏细胞用CD4-PE抗体标记，破膜固定后Foxp3-APC抗体标记，流式细胞仪分析，结果见图5。

不同耐受程度小鼠间CD4+Treg 的表达没有统计学差异t检验统计分析（t=1.16,P>0.05）。

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图5 不同耐受程度小鼠间CD4+ Treg 的表达。

5 CD4+Foxp3+ T细胞在移植排斥中的作用
我们对CD4+Foxp3+T细胞在移植耐受中的作用进一步研究，将Naive C57BL/6小鼠的脾脏细胞经尾静脉注射到移植耐受小鼠体内。

耐受破坏实验常用来判断外周调节和克隆清除机制在耐受中的作用。

过继转移的效应性T细胞不能破坏已耐受的皮肤移植物，常常作为外周调节机制存在的重要证据[8]。

体内存在的同种异体反应性T细胞的数量与受体小鼠的不同耐受状态有关，低剂量的
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