甲基睾酮免疫胶体金试纸条的研制及在水产品中的应用

甲基睾酮免疫胶体金试纸条的研制及在水产品中的应用
夏武强;胡叶军;孙琛;张美珍;王伟萍;桑丽雅
【摘要】通过研究胶体金免疫层析技术，建立了一种快速检测水产品中甲基睾酮含量的方法。

将待测样品中的甲基睾酮和试纸条检测线上包被的人工抗原（ MT-BSA）竞争性结合金标结合垫上包被的胶体金-甲基睾酮单抗聚合物，根据检测线呈现的红色线条深浅来判定样品的阴阳性。

结果显示：试纸条上MT-BSA抗原工作浓度为1.0 mg／mL，羊抗鼠二抗工作浓度为1.5 mg／mL，试纸条的最低检测限达到10μg／kg，与甲基睾酮类似物的交叉反应率低；使用甲醇提取，4倍PBST稀释，整个检测所需时间仅10～15 min，适用于大规模样品筛选。

%A rapid coloidal gold immunochromatographic assay for methyltestosterone ( MT) residue in aquatic products was developed.The coloidal gold-MT-McAb conjugate coated on the colloidal gold conjugate pad would combine with the MT in the samples and the MT-BSA on the detective line competitively, thus indicated the result of test.The results of this article showed that working concentration of MT-BSA was 1.0 mg/mL and goat anti-mouse IgG was 1.5 mg/mL, the detec-tion limit of the strip could be 10 μg/kg, and the cross-reactivity was low, MT was extracted by methanol, and then the extract was diluted by 4 times PBST solution, the result could be obtained in 10~15 min.Therefore the strip was suitable for the sample screening and qualitative determination.
【期刊名称】《淡水渔业》
【年(卷),期】2016(046)001
【总页数】6页(P93-98)
【关键词】甲基睾酮;胶体金;水产品;快速检测;试纸条
【作者】夏武强;胡叶军;孙琛;张美珍;王伟萍;桑丽雅
【作者单位】象山县海洋与渔业质量技术检测中心，浙江宁波 315700;杭州南开日新生物技术有限公司，杭州 310051;象山县海洋与渔业质量技术检测中心，浙江宁波 315700;象山县海洋与渔业质量技术检测中心，浙江宁波 315700;杭州南开日新生物技术有限公司，杭州 310051;杭州南开日新生物技术有限公司，杭州310051
【正文语种】中文
【中图分类】TS207.7
甲基睾酮(Mehthy1testosterone，MT)是一种人工合成的代谢类固醇，具有增强雄性体性和蛋白同化双重作用[1]。

MT不仅能够促进生长，提高饲料转化率，而且在育苗期间能够促进某些鱼类(如罗非鱼、青鳉等)的性别转变[2-3]，因此广泛用于水产养殖[2-5]。

但高剂量甲基睾酮的摄入可产生高血压，男性前列腺肥大、脱发，女性多毛、声音变粗、乳腺退化等男性化现象[6-7]。

欧盟自1988年已禁止使用雄性激素兽药[8]，美国也规定与其同类的丙酸睾酮在肌肉中的最高残留限量(MRL)为0.64 μg/mL[9]。

我国农业部2001年实施的行业标准《无公害食品水产品中渔药残留限量》(NY5070-2001)将甲基睾酮列为禁用药物，2003年发布的第235号文件《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定丙酸睾酮、苯丙酸诺龙、甲基睾酮、群勃龙等为禁止使用的兽药，在所有食用动物的所有可食组织中不得检出。

目前检测甲基睾酮的方法有高效液相色谱法(HPLC)[10-11]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[12]、液相色谱-质谱法(LC-MS)[13]及酶联免疫吸附法(ELISA)[14]。

但上述方法前处理复杂，均需要配备昂贵的仪器，对检测人员的技术要求也较高，因此在基层大规模筛选工作中很难有应用价值。

本实验运用胶体金免疫层析检测法(GICA)建立一种灵敏度高、操作简单的甲基睾酮快速检测试纸条。

1.1 材料
1.1.1 试剂
硝酸纤维素膜(NC膜)、玻璃纤维：Millipore公司；甲基睾酮标准品、睾酮标准品、丙酸睾酮标准品、19-去甲睾酮标准品、1-去氢睾酮标准品、氯金酸
(HAuCl4·4H2O)、羊抗鼠IgG、牛血清白蛋白(BSA)、海藻糖、Tween-20：美国Sigma；聚乙二醇20 000、柠檬酸三钠、甲醇、乙醇、乙腈、氯化钠、氯化钾、
磷酸氢钠、磷酸二氢钾、叠氮钠均为分析纯：华东医药有限公司；甲基睾酮ELISA 试剂盒：美国Reagen。

1.1.2 仪器
BioJet XYZ3000型点膜仪(美国BioDot)、UV-752紫外-可见光分光光度计(美国UNICO公司)、Avanti J-26XP高速冷冻离心机(美国Beckman公司)、恒温鼓风
干燥箱(上海精宏实业设备有限公司)、切割机(杭州市恒通设备有限公司)、胶体金
读数仪(杭州南开日新生物技术有限公司)、78HW-1恒温磁力搅拌器(杭州仪表电
机有限公司)。

1.1.3 试剂配制
PBS溶液(即0.01 mol/L PBS)：取8 g NaCl、0.2 g KCl、1.14 g Na2HPO4和0.27 g KH2PO4溶于800 mL去离子水中。

用4 mol/L HCl调节溶液的pH值至7.4，加去离子水定容至1 L，在高温高压下蒸气灭菌后保存于室温。

PBST溶液：PBS溶液中加入0.05%Tween-20试剂。

标准品：使用甲醇溶解甲基睾酮干粉，
稀释成浓度100 mg/L作为标准储备液，使用ddH2O稀释成实际所需浓度。

1.2 方法
1.2.1 甲基睾酮人工抗原制备
参照高军等人[15]的方法制得包被抗原MT-BSA及免疫抗原MT-OVA。

1.2.2 甲基睾酮单克隆抗体的制备
参照姜金庆等[16]的方法制得甲基睾酮单克隆抗体，腹水效价为1∶25 600，IC50为3.24 μg/L。

1.2.3 胶体金溶液配制
取0.01%氯金酸水溶液100 mL加热2 min至沸腾，边搅拌边加入1%柠檬酸三
钠水溶液 1 mL，继续煮沸10 min至溶液呈酒红色后冷却，加蒸馏水恢复到原体积，4 ℃保存备用。

此方法制备的胶体金颗粒直径40 nm左右，可见光最高吸收
峰为525 nm[17-18]。

1.2.4 金标抗体配制
标记pH的确定：使用K2CO3及HCl调整胶体金溶液pH为3~11，分别取100 μL加入到酶标板微孔中，然后加入5 μg MT 单抗，室温静止10 min后加入20
μL 10%NaCl溶液后室温反应10 min离心，取上清测定525 nm的OD值，选
择OD值最高的溶液pH为标记pH。

最佳标记浓度的确定：取酶标板8孔每孔加入100 μL胶体金溶液，分别加入
0~50 μg MT 单抗，室温静止10 min后加入20 μL 10%NaCl溶液反应10 min。

MT单抗过低会使胶体金聚沉，而导致颜色由红变蓝，当MT单抗达到所需量后溶液保持红色不变，选择最低的MT单抗量作为最佳标记浓度。

标记过程：取1 L胶体金溶液调整至最佳pH后加入最佳标记浓度单抗，过夜稳定后加入5%BSA至BSA最终质量分数为1%，离心纯化后沉淀用0.01 mol/L PB
溶液(含1%BSA和0.05%NaN3)重悬，4℃保存备用[19-20]。

1.2.5 T线和C线包被浓度的调试
使用PBS溶液(含3%甲醇)稀释MT-BSA至0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0
mg/mL，稀释二抗(羊抗鼠IgG)至1.0、1.5、2.0 mg/mL，分别包被到NC膜上，与金标结合垫(喷量3.0 μL/cm)组装成试纸条后，使用PBST溶液滴板后观察显色
并使用胶体金读数仪读取T/C值。

选择T/C值为1~2且显色适中时的浓度作为工作浓度。

1.2.6 试纸条干燥时间的优化
NC膜上MT-BSA及二抗包被完成后放入37 ℃烘箱干燥，每隔一段时间后取出，使用PBST溶液滴定，观察并记录结果。

1.2.7 试纸条的组装
取稀释好后的MT-BSA和羊抗鼠IgG通过点膜仪喷于NC膜上，分别形成相距
0.5 cm的检测线(T线)和质控线(C线)，37 ℃烘箱干燥30 min；将金标抗体溶液
按3 μL/cm喷至玻璃纤维上作为金标结合垫，置于37 ℃烘箱干燥45 min；分别将样品垫、金标结合垫、NC膜、吸水垫黏于PVC板上，使用切割机切成3.84 mm宽度的试纸条，装入塑料模板中压成试剂板(结构图如图1所示)。

1.2.8 样本处理方法优化
样本处理过程：取样本组织均浆2 g于5 mL离心管中，加入2 mL提取剂后震荡
5 min，离心取上清200 μL，加入PBST溶液稀释后取100 μL溶液检测。

提取剂优化：分别使用甲醇、乙醇、乙腈、酸化乙腈、石油醚作为提取剂提取阴性样本及阳性添标样本(10 μg/kg)，观察显色。

稀释比例优化：取样本组织匀浆添标至最终质量分数分别为0、5、10、20 μg/kg，每个样本提取后取上清分别使用PBST溶液1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、
1∶6稀释后检测，观察并读取T/C值。

1.2.9 试纸条操作方法及结果判定
操作方法：将已压好的试剂板水平放置于观察者正面；用滴管吸取待检样品溶液，垂直滴加3滴(约100 μL)于加样孔中，加样后开始计时；结果应在3～5 min读取，
其他时间判读无效。

结果判定：本试纸条采用对比法判定，若检测线(T线)显色浅于控制线(C线)显色，则判定为阳性；若检测线(T线)显色深于控制线(C线)显色，或者显色一样深，则
判定为阴性；若控制线(C线)没有显色，检测线(T线)无论有无显色，均判定为无
效板。

1.2.10 试纸条性能测定
1.2.10.1 试纸条灵敏度及检测限
取阴性样本组织匀浆添标至MT最终质量分数分别为0、5、10、15、20、40
μg/kg，按照优化后的处理方法进行样本处理及检测，每个浓度设6个重复，滴板检测并记录实验结果；分别使用PBST溶液稀释标准品溶液至0、0.5、1、2、5、10 μg/L，每个浓度设6个重复，滴板检测并记录实验结果。

1.2.10.2 试纸条特异性
取MT、睾酮、丙酸睾酮、19-去甲睾酮及1-去氢睾酮标准品制成系列浓度的标准品溶液，用甲基睾酮试纸条进行检测，计算交叉反应率。

1.2.10.3 试纸条精密度
随机抽取3个不同批次的试纸条各30条，使用PBST溶液滴板读数并计算变异系数。

1.2.10.4 试纸条检测与ELISA的符合率
取不同来源的鱼样、虾样各10份，分别使用ELISA试剂盒及本试纸条检测MT含量比较两者的符合率。

1.2.10.5 稳定性实验
取3个不同批次的试纸条在20~25 ℃条件下连续放置12个月，期间，于生产当天、1、2、3、6、9、12个月分别从3个批次产品中抽取检测卡，测定检测限、
假阳性率和假阴性率。

2.1 人工抗原紫外特征
在200～350 nm紫外光区分别对MT、BSA和MT-BSA进行紫外扫描，结果如
图2所示。

MT的最大吸收峰在249 nm，BSA的最大吸收峰在271 nm，而
MT-BSA人工抗原的特征吸收峰发生了明显的偏移，证明偶联成功。

2.2 抗原和二抗工作浓度
本试纸条选用对比法进行结果判定，根据经验，当阴性溶液滴定时T/C值在1.5
左右，且线条显色适中，线条粗细0.8 mm左右，此时不仅肉眼观察明显可减少
误判，并且能够减少不同样本本底值差异造成的假阳性和假阴性率。

本试纸条T、C线上包被的MT-BSA抗原和羊抗鼠二抗浓度调试结果见表1。

根据结果可知，当MT-BSA抗原浓度为1.0 mg/mL，羊抗鼠二抗浓度为1.5 mg/mL 时，显色效果最佳。

2.3 试纸条干燥时间的优化结果
由图3表明，试纸条显色在干燥0~8 h内变化较为剧烈，而后T线显色趋于平稳，C线显色缓慢上升，导致T/C值下降，24 h后趋于平稳。

结果表明MT-BSA在干燥8 h后趋于稳定，而羊抗鼠IgG则在24 h后趋于稳定。

故大卡干燥时间定为
24 h。

2.4 样本提取优化
提取剂优化：乙醇的提取效率略差于其他提取剂；甲醇、乙腈、酸化乙腈及石油醚的提取效率较高，且石油醚、甲醇的显色效果略好于其他两种；石油醚的毒性较其他试剂大，故最终选择甲醇作为提取剂。

稀释比例优化：由图2表明，当稀释倍数在4时阴阳性样本的检测结果梯度最大。

当稀释倍数较小时，提取液及样本杂质的含量较高，导致出现检测液跑板缓慢、T 线显色较细的异常情况，从而影响到T/C值及梯度大小。

当稀释倍数为4倍以上时，显色和跑板才趋于正常。

但随着抗原被稀释的越多，必然会导致检测灵敏度减
小。

故选择稀释倍数为4时最佳。

2.5 试纸条灵敏度及检测限
根据表2和表3可知，本试纸条灵敏度为MT标准品液2 μg/L，检测限为水产样品中MT含量10 μg/kg。

2.6 特异性试验
本试纸条对甲基睾酮类似物睾酮、丙酸睾酮、19-去甲睾酮及1-去氢睾酮的交叉反应率见表4。

2.7 精密度
根据3批次试纸条实验结果(表5)，试纸条每批次变异系数分别为6%，4.1%，
1.9%，试纸条批次间变异系数为5.5%。

总变异系数为1
2.6%，总标准偏差为0.2，对检测结果影响较小。

2.8 与ELISA法的检测符合率
实验结果表明，试纸条法与ELISA法的检测符合率在90%以上(表6)。

2.9 稳定性实验
实验结果(表7)表明，在常温条件下(20~25 ℃)，1年内试纸条的检测限不变，假
阳性率和假阴性率均小于5%，可见试纸条保质期可达1年。

3.1 提取方式
相对于色谱法，胶体金免疫层析检测法对于提取的要求较低，所需的步骤也较为简单。

提取方法一般可分为浓缩法、稀释法以及两者混合使用法。

浓缩法一般步骤包括提取、吹干、复溶、滴板，通过吹干复溶提高了甲基睾酮的浓度，从而提高了检测限；稀释法一般步骤包括提取、稀释、滴板，方法简单快捷。

甲基睾酮易溶于乙醇、丙酮及三氯甲烷，略溶于乙醚，微溶于植物油，不溶于水中[21]。

试验过程中，通过对浓缩法和稀释法的比较，发现浓缩法的显色较浅，且阴阳性梯度和稀释法相差不大。

故选择稀释法，并使用一些常规的水溶性提取剂进行
样本提取优化。

3.2 T、C线稀释液及NC膜选择
影响蛋白质结合到NC膜上的因素主要有溶解捕获蛋白的稀释液、NC膜、捕获蛋白本身性质、点样系统及点样环境湿度。

本研究主要涉及的可调节因素是稀释液及NC膜。

本试纸条采用常规的PBS溶液(含3%甲醇)，PBS溶液主要作用是溶解捕获蛋白及缓冲捕获蛋白的pH，3%甲醇作为共沉淀剂提高蛋白质的疏水性而提高与NC膜的结合能力[22]。

胶体金免疫层析法所使用的NC膜的孔径一般在5~12 μm，NC膜孔径越小，有效表面积越大，反应时间越长，有利于蛋白质的结合及灵敏度的提高[23]。

实际情况下NC膜孔径过小会影响跑板速度，甚至出现跑不完的现象。

本试纸条选用8 μm的NC膜，跑板时间在1 min左右，灵敏度满足检测要求。

本研究产品甲基睾酮胶体金试纸条运用目前发展迅速的胶体金免疫层析方法，其检测限达到10 μg/kg，和行业标准相当，符合现阶段检测灵敏度的要求；前处理简单，对实验操作人员的要求较低；检测成本较低，所用试剂对人体基本无害，比较符合现阶段我国水产品质量监控要求，具有推广价值。

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