盐酸奥普力农注射液细菌内毒素检查方法的研究

盐酸奥普力农注射液细菌内毒素检查方法的研究
焉媛媛 赵志龙 林　鹏 王秀英
辽宁省药品检验检测院，辽宁沈阳 110036
[摘要] 目的 建立盐酸奥普力农注射液的细菌内毒素检查方法，以控制产品质量，确保临床用药安全。

方法 按照《中华人民共和国药典》2015年版四部通则“9301”里规定的注射剂安全性检查法应用指导原则和“1143”里规定的细菌内毒素检查方法进行实验，分别用湛江博康海洋生物有限公司和湛江安度斯生物有限公司两个不同厂家生产的鲎试剂对1批盐酸奥普力农注射液进行了干扰实验和细菌内毒素检查。

结果 盐酸奥普力农注射液浓度稀释至0.04 mg/ml,使用灵敏度为0.125 EU/ml的鲎试剂,本品对鲎试剂和细菌内毒素反应无干扰作用,并对盐酸奥普力农注射液进行细菌内毒素检查，结果符合规定。

结论 盐酸奥普力农注射液的细菌内毒素检查方法可行，能控制产品质量，保证临床用药安全。

[关键词] 盐酸奥普力农；细菌内毒素；鲎试剂；灵敏度；干扰实验
[中图分类号] R927.1 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2021）05-0064-04
Research on the bacterial endotoxins test of olprinone hydrochloride injection
YAN　Yuanyuan ZHAO　Zhilong LIN　Peng WANG　Xiuying
Liaoning Institute for Drug Control, Examination and Certification Centre, Liaoning, Shenyang 110036, China
[Abstract] Objective To establish bacterial endotoxins test method for olprinone hydrochloride injection, so as to control the product quality and ensure the safety of clinical medication. Methods The experiment was carried out according to the application guiding principle of injection safety test method specified in "9301" and bacterial endotoxins test method specified in "1143" of General Principles in PartⅣof Chinese Pharmacopoeia (2015 Edition).
The interference test and bacterial endotoxins test were carried out on a batch of olprinone hydrochloride injections with limulus reagent produced by Zhanjiang Bokang Marine Biology Co., Ltd. and Zhanjiang A&C Biological Co.,Ltd.
Results The concentration of olprinone hydrochloride injection was diluted to 0.04 mg/ml, and limulus reagent with sensitivity of 0.125 EU/ml was used. This product had no interference on the reaction between limulus reagent and bacterial endotoxin. The bacterial endotoxins test of olprinone hydrochloride injection was carried out, and the results met the requirements. Conclusion The bacterial endotoxins test for olprinone hydrochloride injection is feasible, which can control the product quality and ensure the safety of clinical medication.
[Key words] Olprinone hydrochloride; Bacterial endotoxins; Limulus reagent; Sensitivity; Interference experiment
急性心力衰竭又称急性心功能不全，是由于心
排血量短期内急剧下降所导致的疾病。

多见于血
压突然升高时、急性心肌炎、急性心肌梗死等急性
心肌弥漫性损害时；瓣膜严重狭窄、心室流出道梗
阻导致急性机械性阻塞心脏排血受阻时；心室颤
动、显著心动过速等导致致命性心律失常时；由于
上述原因引起急性心力衰竭的发生。

盐酸奥普力
农是日本株式会社开发研制的用于治疗急性心力
衰竭的药物，化学名为1，2-二氢-5-咪唑并[1，2-a]
吡啶-6-基-6-甲基-2-氧代-3-吡啶碳氰盐酸
盐一水合物，分子式C
14H
10
N
40
·HCl·H
20
，盐酸奥普
力农选择性地阻碍环磷腺苷的特异的磷酸二酯酶（PDE），具有增强心收缩力和扩张血管的作用。

盐酸奥普力农于1982年开始研究，1986年开始临床，1996年在日本正式上市，证明对急性心力衰竭有明显治疗效果。

盐酸奥普力农不仅可以增加心肌的耗氧量，还增加心肌输出量，比儿茶酚胺改善心肌能量有效率高，主要应用于其他药物疗效不佳的急性心力衰竭的短期静脉治疗，临床上广泛应用。

鉴于盐酸奥普力农注射液的这些优势，本文对此进行研究，以控制产品质量。

1　材料
1.1　受试物
盐酸奥普力农注射液（沈阳双鼎制药有限公司，批号S181101，规格：5 ml∶5 mg）。

1.2　鲎试剂
湛江博康海洋生物有限公司，批号1801082，规格：0.1 ml/支，灵敏度0.125 EU/ml；湛江安度斯生
物有限公司，批号1809032，规格：0.1 ml/支，灵敏度
0.125 EU/ml。

1.3　细菌内毒素检查用水
厦门鲎试剂生物科技股份有限公司，批号18016003，规格：5 ml/支。

1.4　细菌内毒素工作标准品
批号150601-201885，效价80 EU/支，中国食品药品检定研究院。

1.5　仪器设备
电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，型号XSE204，设备编号B64940782；内毒素凝胶法测定仪，天津市天大天发科技有限公司，型号ET-96，出厂编号05-23-17。

1.6　实验条件
保温温度（37±1） ℃。

2　方法与结果
2.1　鲎试剂灵敏度（λ）复核
按照《中华人民共和国药典》2015年版四部通则1143“细菌内毒素检查法”进行检查。

在规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即鲎试剂的标示灵敏度。

当新购的鲎试剂使用新批号时或条件发生变化而影响到实验结果时，都应进行鲎试剂灵敏度复核[3-4，6，9-10]，以确保产品质量符合实验要求。

具体操作先将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水稀释至2λ、λ、0.5λ、0.25λ4个浓度，每个浓度做4管，加样后用封口膜封好，轻轻混匀，（37±1）℃保温1 h。

结果见表1。

表1 鲎试剂灵敏度标定结果
批号
灵敏度
（EU/ml）
内毒素浓度阴性
对照
标定结果
（EU/ml）2λ λ 0.5λ 0.25λ
18010820.125++++++++----------0.125 18090320.125++++++------------0.18
结果表明，最大浓度2λ各管均为阳性，最低浓度0.25λ各管均为阴性，阴性对照是阴性，本次实验成立。

所选用两个厂家的鲎试剂标示灵敏度均在0.5λ~2λ之间，表明鲎试剂灵敏度符合规定，可以用于实验。

2.2　细菌内毒素限值的确定
根据本品的临床用法用量，参照《中华人民共和国药典》2015年版四部[2]通则9301“注射剂安全性检查法应用指导原则”进行细菌内毒素限值的确定，并求得最大无干扰浓度。

限值计算公式[7-8，11]为：L=K/M，M为人用每千克体重每小时最大剂量，本品临床用量为：0.01 mg/kg+ 0.0004 mg/（kg·h）×55=0.032 mg/（kg·h）。

K为人用每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂为5EU/（kg·h）。

计算本品限值为：L=K/M= 5 EU/（kg·h）/0.032 mg/（kg·h）=156 EU/mg。

经计算本品理论限值为156 EU/mg，本品拟定申报限值为50 EU/mg，约为计算限值的1/3，限值设置合理。

拟定本品内毒素限值为每1 mg盐酸奥普力农中含内毒素的量应小于50 EU。

2.3　干扰实验预实验
本次进行干扰实验预实验的目的是，找出供试品溶液中未检出内毒素并且不超过最大有效稀释倍数的溶液，以确定本次供试品溶液的浓度。

本次选择供试品溶液为0.0025～0.0800 mg/ml 6个系列浓度，阴性对照为细菌内毒素检查用水，阳性对照为2λ内毒素溶液，供试品阳性对照为供试品溶液稀释的2λ内毒素溶液，加完样品后操作同鲎试剂灵敏度复核。

见表2。

结果表明，盐酸奥普力农注射液0.04 mg/ml浓度以下对细菌内毒素检查符合规定，0.04 mg/ml浓度以下对样品无干扰。

2.4　正式干扰实验
根据干扰实验预实验的结果，确定使用供试品溶液的最终浓度为0.04 mg/ml。

所用的鲎试剂同鲎试剂灵敏度复核，灵敏度均为0.125 EU/ml。

本实验分为两组：一是检查用水组将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水稀释至2λ、λ、0.5λ、0.25λ4个浓度，二是供试品组用盐酸奥普力农注射液0.04 mg/ml浓度的溶液将细菌内毒素工作标准品也稀释至相同的4个浓度，加完样品后操作同
表2 盐酸奥普力农注射液干扰实验预实验结果
供试品批号供试品浓度（mg/ml）
供试品供试品阳性对照阴性对照阳性对照
安度斯海洋安度斯海洋安度斯海洋安度斯海洋
S1811010.08- -- -+ -+ +- -- -+ ++ +
0.04- -- -+ ++ +- -- -+ ++ +
0.02- -- -+ ++ +- -- -+ ++ +
0.01- -- -+ ++ +- -- -+ ++ +
0.005- -- -+ ++ +- -- -+ ++ +
0.0025- -- -+ ++ +- -- -+ ++ +
鲎试剂灵敏度复核。

见表3。

表3 盐酸奥普力农注射液干扰实验结果
鲎试剂供试品批号
内毒素浓度
阴性对照2λλ0.5λ0.25λ
海洋检查用水+ + + +- -- -- -
S181101+ + + +- - - -- - - -- - - -- -
安度斯检查用水+ + + -- - - -- -
S181101+ + + +- - - -- - - -- - - -- -
结果表明，用两个厂家生产的鲎试剂进行干扰实验，盐酸奥普力农注射液0.04 mg/ml浓度以下对细菌内毒素检查无干扰。

2.5　细菌内毒素检查实验[1，15]
根据拟定限值计算：C=λ/L=0.125 EU/ml/ 50 EU/mg=0.0025 mg/ml
按照《中华人民共和国药典》2015年版四部[1]通则1143“细菌内毒素检查法”进行。

所用的鲎试剂同鲎试剂灵敏度复核，供试品浓度为0.0025 mg/ml 溶液，阴性对照为细菌内毒素检查用水，阳性对照为2λ内毒素溶液，供试品阳性对照为供试液溶液稀释的2λ内毒素溶液。

见表4。

结果表明，按照拟定标准检验，对1批盐酸奥普力农注射液进行细菌内毒素检查，结果符合规定。

3　结论
在本实验室条件下，盐酸奥普力农注射液0.04 mg/ml浓度以下对细菌内毒素检查无干扰，并对1批样品按拟定的细菌内毒素限值进行检查，结果符合规定。

4　讨论
4.1　盐酸奥普力农注射液结果确定
从实验结果看，盐酸奥普力农注射液对鲎试剂与细菌内毒素之间的反应无干扰作用，限值设置合理，其细菌内毒素检查法可行，可以控制产品质量，以确保临床用药安全。

4.2　两种实验方法的比较
细菌内毒素检查法和传统热原检查法的比较[5，12，16-17]，细菌内毒素检查法是用鲎试剂做实验，其灵敏度高，准确性强，操作方便，受客观影响因素较少；热原检查法，需要用家兔做实验，动物成本高，误差大，受客观影响因素较多。

现在已经有越来越多的药品施行细菌内毒素检查法。

4.3　盐酸奥普力农注射液药理作用及临床禁忌证
盐酸奥普力农注射液药理和毒理作用[13-14]是：盐酸奥普力农是一种PDE的Ⅲ抑制剂，具有正性肌力作用和血管扩张作用，主要通过抑制PDE，使心肌细胞内环境的磷酸腺苷（cAMP）浓度提高，细胞内钙数量增多，心肌收缩力增强，心肌排血量增加。

在临床上起到很好的治疗效果。

其药理作用还有：
①奥普力农可以保护心脏，健康成年人静脉给予
1.25～50.00 μg/kg盐酸奥普力农药动学呈线性变化，给药剂量与血药浓度之间基本上成比例关系，能起到很好地保护心脏的作用。

②扩张血管，给予盐酸奥普力农后脑血流、心输出量明显增加，提示盐酸奥普力农具有明显扩张脑血管的作用。

可见该药物还具有增加脑代谢的作用，未来可以作为新药研究用于治疗脑血管痉挛引起的偏头痛等症状。

③对于呼吸系统的影响，能扩张支气管，增加cAMP 产生支气管扩张作用，缓解支气管平滑肌痉挛，起到治疗支气管哮喘的作用。

④抗炎作用，冠状动脉搭桥术后给予盐酸奥普力农，具有促炎作用，使抗炎作用经体外循环后达到高峰，说明该药物具有一定的抗炎作用。

⑤器官保护作用，减轻或消除缺血-再灌注损伤（IRI）是近些年来临床面临的重大研究课题之一。

通过减少细胞因子表达，减轻炎症程度，从而起到对损伤器官的保护作用。

然而事物都具有相对的两个方面，有好的方面，同样也有不利因素存在。

盐酸奥普力农注射液对于肥厚型梗阻性心肌病患者禁用，使用后会加重狭窄影响心肌输出量，使病情进一步加重。

下列情况疾病也要谨慎使用，如严重的快速型心律失常患者、肾功能受损患者和严重的低血压患者，使用本品后会引起原有的疾病加重，提示上述这些疾病临床上慎重使用。

4.4　盐酸奥普力农注射液今后的发展前景
随着心、脑血管病诊疗技术的不断提高，许多在急性期死亡率极高的疾病如急性心肌梗塞，由于采用了扩张血容量和溶栓等治疗手段，使死亡率明显降低，可是由此引起心力衰竭的发病率确在逐年增多。

还有随着人类寿命不断地延长，心肌老化也已经成为引起心力衰竭发生的重要原因。

心衰已成为21世纪人类面临的最难以攻克的顽固性疾病之一。

当临床上出现心力衰竭症状时，必将是冠心
表4 细菌内毒素检查结果
鲎试剂供试品批号供试品浓度（mg/ml）供试品供试品阳性对照阴性对照阳性对照海洋S1811010.0025- -+ +- -+ +
安度斯S1811010.0025- -+ +- -+ +
病、高血压、脑梗引起死亡的最后致命症状，随时都有生命危险，心衰的死亡率非常之高，有统计结果[14]表明，重度心衰患者死亡率高达50%，心衰患者得病2年后死亡率高达30%～40%，患病时间越长，复发的几率就越高，就需要反复住院治疗，这样周而复始，严重影响患者的生命质量和生活质量。

根据2000—2001年亚洲心血管病国际合作研究中国部分的研究结果显示我国心力衰竭患者已高达400万。

而国内药品能治疗心力衰竭的品种尤其甚少，只有鲁南制药厂生产的米力农注射液一个品种，远远满足不了市场的需求，这也是本文着手研究制定注射剂安全性标准的目的所在，早研究早出结果，早点解除患者的痛苦。

由此可见盐酸奥普力农注射液上市后，能缓解市场供需紧张的问题，会有很好的市场前景和发展空间。

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