香菇尿嘧啶营养缺陷型菌株的筛选与分子验证

香菇尿嘧啶营养缺陷型菌株的筛选与分子验证
王连会;茅文俊;鲍大鹏
【摘要】筛选出对5’-FOA 敏感性较高的香菇‘L26’菌株，采用原生质体紫外诱变技术，获得‘L26’菌株18株尿嘧啶营养缺陷型突变菌株。

分子验证表明：
其中8株菌株的尿嘧啶合成代谢路径发生了基因突变。

6个菌株的 pyrF 基因发生突变，2个菌株的 pyrG 基因发生突变。

%The ‘L26’strain of L .edodes with higher sensitivity of 5 ’-FOA was selected,and 18 uracil auxotrophic mutant strains were obtained by UV mutagenesis of protoplast.Molecular verification showed that 8 mutant strains had genetic mutations in uracil synthetic metabolic pathways;there were pyrF gene mutations in 6 strains and pyrG gene mutations in 2 strains.
【期刊名称】《上海农业学报》
【年(卷),期】2014(000)003
【总页数】4页(P6-9)
【关键词】香菇;尿嘧啶营养缺陷型;5’-氟乳清酸
【作者】王连会;茅文俊;鲍大鹏
【作者单位】上海市农业科学院食用菌研究所，农业部南方食用菌资源利用重点实验室，国家食用菌工程技术研究中心，上海市农业遗传育种重点开放实验室，上海201403; 上海海洋大学食品学院，上海201306;上海市农业科学院食用菌研究所，农业部南方食用菌资源利用重点实验室，国家食用菌工程技术研究中心，上海市农业遗传育种重点开放实验室，上海 201403;上海市农业科学院食用菌研究所，农
业部南方食用菌资源利用重点实验室，国家食用菌工程技术研究中心，上海市农业遗传育种重点开放实验室，上海 201403
【正文语种】中文
【中图分类】S646;Q78
香菇（Lentinula edodes）是我国重要的栽培食用菌之一，2010年中国香菇总产量为427.6万t，占食用菌总产量的19.4%。

香菇栽培业的发展促进了香菇资源［1］、育种［2］、栽培［3］、遗传［4］等方面的研究。

目前，香菇全基因组测序工作正在开展［5］，该工作的完成将为香菇分子遗传学的研究提供基础。

但在香菇的遗传学研究中，还缺少成熟高效的遗传转化体系，这大大限制了分子遗传学相关研究工作的深入。

丝状真菌的遗传转化体系构建中，有多种技术可供选择，如PE G介导转化法、农杆菌介导转化法、基因枪法等等。

其中PE G介导的转化方法虽然转化率略低，但不需要昂贵的仪器和限制性内切酶，是一种经济、简便的转化方法。

PE G介导的转化方法已应用于香菇［6］、双孢
蘑菇［7］、平菇和草菇［8］等食用菌的转化；在PE G介导的转化技术体系中，需要使用遗传标记，遗传标记有多种方法，如营养缺陷型标记、抗生素抗性标记、代谢产物抗性标记等。

香菇作为一种深受消费者欢迎的食用菌品种，在遗传转化研究过程中，采用营养缺陷型标记具有更高的安全性。

常见的营养缺陷型菌株的筛选标记有腺嘌呤、蛋氨酸、尿嘧啶、色氨酸、核菌素、精氨酸、亮氨酸、脯氨酸、肌醇等［9］。

营养缺陷型标记基因Ural（二氢乳清酸）、Pabl（p-氨基苯甲酸）、trp3（色氨酸）等已被报道应用于杨树菇［10］、灰盖鬼伞［11］、双孢蘑菇［12］的遗传转化。

尿嘧啶营养缺陷型标记在细菌、丝状真菌、酵母菌中已成功获得营养缺陷性菌株，如超嗜热古菌（Sulfolobus tokodaii）［13］、里氏木霉（Trichoderma reesei）
［14］、海洋红酵母（Rhodotorula benthica）［15］，但在食用菌中尚未有获得尿嘧啶营养缺陷性菌株的报道。

在香菇的遗传研究中，尿嘧啶合成的两种关键酶基因pyrF与pyrG已被成功克隆，这为香菇尿嘧啶营养缺陷性的研究提供了一定
的理论基础。

本试验拟采用香菇为材料，通过紫外诱变方法获得尿嘧啶营养缺陷型菌株，并从基因水平对突变株尿嘧啶合成的关键基因pyrF与pyrG进行分析鉴定，为进一步建立香菇遗传转化体系提供材料。

1.1 材料
试验所使用的香菇菌株：‘135’、‘苏香’、‘S603’、‘L26’、‘L54’均
由上海市农业科学院食用菌研究所菌种保藏中心提供。

1.2 方法
1.2.1 培养基配制和配方
马铃薯培养基（P D A）：土豆200g（去皮），水煮、过滤，滤液加葡萄糖20g、琼脂粉20g，加水至1 L，灭菌，倒平板，供菌丝活化与菌丝培养使用。

马铃薯液体培养基（P D）：即P D A培养基不加琼脂粉，定容后分装在250 m L 的三角瓶中，100 mL/瓶，灭菌，供液体培养菌丝。

基本培养基（M M）：K H2P O31.0g、（N H4）2H P O31.5g、MgSO4·7
H2O 0.3g、Thia mine H Cl 500μg、琼脂粉15g，加水至1 L，灭菌。

原生质体再生培养基（PDMS）：土豆200g（去皮）煮后过滤，在滤液中加蔗糖205.3g、麦芽糖1g、葡萄糖20g、琼脂粉20g，加水至1 L，灭菌后倒平板备用。

1.2.2 原生质体制备及再生
过滤收集菌丝，用2%的溶壁酶在摇床上酶解2～3 h，在31℃、65 r/min条件下用砂芯漏斗过滤酶解液，滤液在4℃下3 000 r/min离心10 min，弃上清；0.6 mol/L甘露醇重悬；4℃、3 000 r/min离心10 min后弃上清，此步骤重复1～2次；最后在原生质体细胞沉淀加入适量的0.6 mol/L甘露醇混匀，计算原生质体密
度（个/mL）。

稀释后的原生质体细胞溶液涂布在PDMS平板再生培养基上，25℃培养7 d后观察萌发情况。

1.2.3 香菇不同菌株对5’-氟-乳清酸的敏感性与抗性试验
将‘135’、‘苏香’、‘S603’、‘L26’、‘L54’5个菌株的菌丝分别接到
含有不同体积浓度5’-氟-乳清酸（5’-F O A）（0g/L、0.01g/L、0.03g/L、
0.05g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.5g/L）的P D A平板上，25℃培养2周后观察并测量菌落在平板上的生长半径，3次重复。

1.2.4 ‘L26’菌株原生质细胞的紫外致死试验
将原生质体细胞溶液稀释到104个/mL，取100μL均匀涂布到再生平板培养基（PDMS）上，以功率为62.5 mJ的紫外光垂直照射（距离15 c m）平板表面，
照射时间分别为0 s、5 s、10 s、15 s、20 s、25 s；3次重复。

25℃下避光培养
2周后，观察原生质体细胞再生情况，记录再生菌落数目。

1.2.5 原生质体诱变与营养缺陷型突变株的筛选验证
原生质体细胞溶液分别涂布到再生培养基（PDMS）、添加尿嘧啶（0.05 mmol/L）的再生培养基（PDMS U）、添加尿嘧啶（0.05 mmol/L）及5’-氟-乳清酸（0.5g/L）的再生筛选平板培养基（PDMSUF）上，每个平板涂100μL；紫外光
照射涂布后的PDMSUF平板，其余两种不照射作为对照；25℃避光培养2周后，观察萌发情况。

挑取筛选再生培养基（PDMSUF）上萌发的单菌落，转接到添加
尿嘧啶（0.5 mmol/L）和5’-F O A（0.5g/L）的P D A平板培养基上。

25℃培养1周后，挑取菌块分别接种到基本培养基（M M）、添加尿嘧啶的基本培养基（M M U）、添加尿嘧啶和5’-F O A的基本培养基（MMUF）上，进行表型的验证培养，同时以正常菌株作对照，重复2次。

25℃培养1周后观察生长情况。

1.2.6 突变菌株基因组D N A的提取与PCR克隆相关基因
提取突变菌株基因组D N A（C T A B法）［16］。

设计pyrF和pyrG两个基因
的引物（表1）。

PCR扩增体系为50μL，包含：Ta Ka RaEx Taq（5 U/μL）0.5μL，10×Ex TaqBuffer（Mg2＋Plus）5μL，d N T P Mixture（2.5 mmol/L）4μL，模板D
N A（100 ng/μL）1μL，引物各1μL，双蒸水（dd H2O）37.5μL。

PCR反应程序：94℃5 min；94℃30 s，55℃30 s，30～35个循环；72℃10 min；4℃保藏。

2.1 香菇菌丝体对5’-F O A的敏感性试验
随着培养基中5’-F O A体积浓度的逐渐增加，各菌株的菌落半径逐渐变小，表
明菌丝生长受到5’-F O A的抑制，菌丝生长速度明显降低（图1）。

与其他4
株出发菌株相比，‘L26’菌株对5’-F O A最敏感。

对照组（5’-F O A体积浓度为0g/L）菌落半径平均为4 c m，生长速度明显大于其他菌株。

随着浓度的增大，其生长速度下降明显，当5’-F O A体积浓度为0.1g/L时，菌株生长受到明显抑制。

因此，本研究以‘L26’作为出发菌株，进而筛选尿嘧啶缺陷型香菇菌株。

2.2 ‘L26’菌株原生质体紫外致死试验
香菇‘L26’原生质体细胞在再生平板培养基（PDMS）上的再生率（萌发菌落个数/涂布细胞个数）为1.1604%，随着紫外照射时间的逐渐增加，原生质体的存活率逐渐降低，紫外照射25 s的原生质体存活率为0。

根据香菇‘L26’原生质体紫外致死曲线（图2），计算出原生质体存活率为50%时的半致死紫外照射时间为8.8 s。

2.3 香菇尿嘧啶营养缺陷型菌株的筛选和验证
对大量的香菇‘L26’原生质体采用8.8 s的紫外照射后，经过2次再生筛选平板
培养基筛选，以排除假阳性或易回复突变菌株后，最终共获得18株表型上符合营养突变型的菌株。

突变菌株与出发菌株在不同基本培养基上的生长情况比较如图3所示。

2.4 香菇尿嘧啶营养缺陷型菌株的分子鉴定
对18株香菇‘L26’尿嘧啶营养缺陷型菌株的pyrF和pyrG基因进行测序分析后，发现其中8株菌株发生了pyrF或pyrG基因的突变（表2）。

突变可以分为3种
情况，碱基变换、插入以及缺失。

通过香菇尿嘧啶营养缺陷型菌株筛选与验证试验，基本确定了筛选条件。

本试验选择了生长较快、对5’-氟-乳清酸敏感性较高的香菇‘L26’为出发菌株；筛选再
生培养基上5’-氟-乳清酸的体积浓度为0.5g/L；紫外诱变的条件：紫外辐照强度为62.5 mJ，距离为15 c m，照射时间为8.8 s。

本试验通过两次表型筛选后获得的8株香菇尿嘧啶营养缺陷性菌株，经连续传代培养5次以上，未出现回复突变
现象。

分子验证表明，突变发生在基因水平上，多为点突变和缺失导致的突变。

突变菌株的筛选与验证试验表明，香菇营养缺陷性菌株的获得率较低，导致这种情况的原因可能是：（1）双核率的高低，紫外诱变虽然导致了一个核基因发生突变，但由于双核情况下发生营养的互补导致菌株仍能正常生长。

（2）原生质体再生率低，往往需要大量制备原生质体，以提高萌发的基数。

（3）突变回复现象的存在，尽管经过两次表型筛选验证的菌株遗传稳定，但是两次表型验证间出现过菌株表型恢复野生型的现象。

（4）染色体的结构，相对于真菌或细菌，食用菌的染色体结构相对复杂一些，所以改变基因形态可能会困难一些。

【相关文献】
［1］王佳国，曹红.香菇多糖的研究进展［J］.解放军药学学报，2011，27（5）：451－455. ［2］陈英南，姜涛，张忠伟.香菇单孢子杂交育种［J］.特种经济动植物，2008，11（7）：15－16.
［3］张锋.香菇栽培技术研究进展［J］.食品工程，2008（2）：28－31.
［4］胡乐琴，潘迎捷.食用菌分子转化研究状况［J］.中国食用菌，2006，25（4）：97－104. ［5］关海山.香菇基因组测序及其结构解析［R］.食用菌基因组与基因工程学术研究讨论会，2010. ［6］孙丽，许伟宏，蔡华清，等.PEG介导下香菇的转化［J］.植物学报，2001，43（10）：1089－1092.
［7］V an de R hee M D，Mendes O，Werten MW T，et al.Highly efficient homologous integration via tandem exo-β-1，3-glucanasa genes in the common mushroom，Agaricus bisporus［J］.Current Genetics，1996，30（2）：166－173.
［8］］De Groot M J A，Bundock P，Hooykaas P J ，et al.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi［J］.Nature Biotechnology，１９９８，１６（９）：８３９－８４２.
［9］王丕武，王东昌，李玉.食用菌基因工程研究进展［J］.吉林农业大学学报，2001，23（3）：23－27.
［10］Noёl T，Labarère J. Homologous transformation of the edible basidiomycete Agrocybe aegerita with the URA１gene：characterization of integrative events and of rearranged free plasmids in transformation［J］.Current Genetics，１９９４，２５（５）：４３２－４３７.
［11］Granado J D，Kertesz-Chaloupková K，Aebi M，et al.Restriction enzyme-mediated D N A integration in Coprinus cinereus［J］. Molecular and General Genetics，1997，256（1）：28－36.
［12］Miranda D，Vande Rhee M D，Paula MA Graca，et al.Transformation of the cultivated mushroo m，Agaricus bisporus，to hygromycin B resistance［J］.Molecular
and General Genetics，1996，250（3）：252－258.
［13］黄奇洪，申玉龙，倪金凤.超嗜热古菌Sulfolobus tokodaii尿嘧啶营养缺陷型筛选条件的最适化及初步筛选［J］.山东大学学报：理学版，2008，43（9）：6－10.
［14］闫作梅，张旭，李杰.农杆菌介导法构建里氏木霉ura3基因突变体的研究［J］.东北农业
大学学报，2011，42（7）：147－153.
［15］王宇光，雷禄旺，孙建波，等.紫外诱变筛选海洋红酵母S8的尿嘧啶缺陷型菌株［J］.基因
组学与应用生物学，2010，29（5）：838－842.
［16］张红，秦莲花，谭琦.用改进的C T A B法提取香菇基因组D N A［J］.上海大学学报：自
然科学版，2006，12（5）：547－550.。