不同日龄略阳乌鸡肌肉中肌苷酸含量的变化规律

路宏朝，张　涛，王　令．不同日龄略阳乌鸡肌肉中肌苷酸含量的变化规律［Ｊ］．江苏农业科学，２０１６，４４（１２）：２７７－２８０．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１６．１２．０８５
不同日龄略阳乌鸡肌肉中肌苷酸含量的变化规律
路宏朝，张　涛，王　令
（陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西汉中７２３００１）
摘要：以１８日胚龄及６、１８０日龄黄羽鸡和略阳乌鸡为研究对象，探讨不同发育时期肌肉中风味物质的形成规律。

采用高效液相色谱仪测定腿肌和胸肌中的肌苷酸含量，利用荧光定量ＰＣＲ方法检测肌苷酸合成关键酶腺苷琥珀酸裂解酶（ＡＤＳＬ）基因的ｍＲＮＡ表达情况。

结果显示：黄羽鸡和略阳乌鸡腿肌中ＡＤＳＬ基因的表达、肌苷酸的含量均在６日龄时最高，胸肌中肌苷酸在１８０日龄时含量最高，表达趋势基本一致；略阳乌鸡腿肌和胸肌的肌苷酸含量在１８０日龄时明显高于黄羽鸡。

同时，
ＡＤＳＬ基因的表达量在不同时期均明显高于黄羽鸡，表明成年略阳乌鸡的肉品质优于黄羽鸡。

关键词：略阳乌鸡；肉品质；肌苷酸；腺苷琥珀酸裂解酶（ＡＤＳＬ）
中图分类号：Ｓ８３１．１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０１６）１２－０２７７－０３
收稿日期：２０１５－１０－１２
基金项目：陕西省科技厅农业攻关项目（编号：２０１３Ｋ０２－２６－０２）；陕西省教育厅项目（编号：１２ＪＳ０２８）。

作者简介：路宏朝（１９８０—），女，陕西勉县人，硕士，副教授，主要从事动物生理学研究。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｌ７８０８２３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ。

多年来，肉用家禽的选育主要侧重于生长速度和肌肉产量２个方面，随着家禽育种技术的发展和应用，饲养１羽体质量为１
．８ｋｇ的肉鸡仅需５周的生产时间。

然而，家禽快速生长的同时也引发了骨骼形态异常、胴体品质下降等一系列问题，且深加工后的肉品质正随着生产性能的提高而逐步下
降［
１］。

大量研究表明，鲜味是评价肉品质的重要指标之一，而肌苷酸（ｉｎｏｓｉｎｉｃａｃｉｄ，ＩＭＰ）是决定畜禽肉质鲜味的主要物
质［
２－３］。

ＩＭＰ和糖蛋白在水和脂肪中加热会产生明显的肉鲜味，与谷氨酸钠具有协同鲜味作用。

肌苷酸已成为肉质评定的重要指标，被广泛应用于各种动物肉类产品的品质评定，其
含量高低间接反映出肉类食品风味的优劣［４－５］。

腺苷琥珀酸
裂解酶（
ａｄｅｎｙｌｏｓｕｃｃｉｎａｔｅｙａｓｅ，ＡＤＳＬ）是肌苷酸合成过程中的关键酶之一。

张学余等研究发现，ＡＤＳＬ基因对鸡的肌肉肌苷
酸含量可产生一定影响［６］。

略阳乌鸡是陕西省的优良地方鸡种之一，产于略阳县黑河流域。

略阳乌鸡的体型大小位居全国四大乌鸡之首，具有“六端乌”（乌皮、乌喙、乌腿、乌趾、乌舌、乌冠）、屠宰率高、蛋大微绿、肉用性能较好、兼具药用价值等优点，被誉为“禽中明珠”［７］。

本研究采用高效液相色谱法，测定不同发育时期略阳乌鸡和黄羽鸡肌肉样中的肌苷酸含量，并运用实时荧光定量ＰＣＲ技术分析肌苷酸的关键合成酶———腺苷琥珀酸裂解酶（
ＡＤＳＬ）的基因相对表达情况，初步探讨略阳乌鸡在不同发育时期ＡＤＳＬ和肌苷酸的分布规律，为鸡肌肉肌苷酸含量与肌苷酸合成关键酶之间关系的进一步研究奠定基础，并为从分子水平阐明略阳乌鸡的特异鲜味机理提供基础数据。

１　材料与方法１．１　试验动物
将数枚黄羽鸡和略阳乌鸡种蛋置于全自动孵化机中孵化，分别取８、１８日胚龄及６、１８０日龄黄羽鸡和略阳乌鸡的腿肌、胸肌，于－８０℃下冻存备用。

１．２　试剂
肌苷酸标准品（上海倍卓生物科技有限公司，纯度为９８％），甲醇（色谱纯），甲酸铵（分析纯），高氯酸（分析纯，含量为７０％～７２％）。

其他试剂均为国产分析纯。

１．３　主要仪器
微电脑全自动孵化机，超纯水机，电热鼓风干燥箱，高速离心机，数显分散均质机，Ｗａｔｅｒｓ２６９５Ａｌｌｉａｎｃｅ型高效液相色谱仪，Ｗａｔｅｒｓ２４８７型紫外检测仪，核酸定量仪（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ公司），荧光定量ＰＣＲ仪（ＡＢＩ公司）。

１．４　试验方法
１．４．１　５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值６．５甲酸铵缓冲溶液（流动相）的配制　称取３．１５ｇ甲酸铵于１０００ｍＬ大烧杯中，加入５００ｍＬ超纯水，采用０．５ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液将其ｐＨ值调至６．５，定容至１０
００ｍＬ。

使用前采用０．４５μｍ滤膜过滤。

１．４．２　０．１ｍｇ／ｍＬ肌苷酸标准储备液　准确称取１ｍｇ肌苷酸标准品，采用５％甲醇水溶液定容至１０ｍＬ，摇匀。

分别取上述储备液１０、２０、３０、４０μＬ配制浓度为１０、２０、３０、４０ｎｇ／ｍＬ的肌苷酸标准工作液，采用５％甲醇水溶液定容至１ｍＬ，摇匀。

于使用前配制。

１．４．３　样品处理　分别称取５ｇ胸肌、腿肌肌肉样品，置于干净器皿中并捣碎，加入２０ｍＬ６％高氯酸，采用分散均质机匀浆。

以４０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，收集上清；沉淀物再次加入１５ｍＬ６％高氯酸，匀浆并离心，合并２次上清液即为提取液。

提取液再经离心，弃去沉淀物，采用配置好的ＮａＯＨ溶液将提取液的ｐＨ值调整至６．５，采用水定容至１００ｍＬ，摇匀。

测定前采用０
．４５μｍ滤膜过滤，色谱经流动相平衡３０ｍｉｎ后，取标准液及样品提取液利用色谱仪进行分析。

１．４．４　色谱条件　色谱柱：ＷａｔｅｒｓＡｔｌａｎｔｉｓＴＭ
ｄＣ１８柱
（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ，５μｍ）。

流动相：５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值６．５甲酸铵缓冲溶液（含５％甲醇）。

流速１ｍＬ／ｍｉｎ、进样量２ｍＬ、紫外检测波长２５４ｎｍ，柱温为室温。

标准工作液、样品
提取液的运行时间均为５ｍｉｎ。

１．４．５　ＲＮＡ提取与Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ荧光定量ＰＣＲ检测　取不同日龄略阳乌鸡的腿肌组织样５
０～１００ｍｇ，在液氮预冷的研钵中研磨至粉末状，期间须不断补充液氮；加入５００μＬＴｒｉｚｏｌＲｅａｇｅｎｔ，摇匀后静置５ｍｉｎ，于４℃、１２０００ｒ／ｍｉｎ下离心１０ｍｉｎ，取上清；加入０．１ｍＬ氯仿，剧烈振荡１５ｓ，静置５ｍｉｎ，于４℃、１２０００ｒ／ｍｉｎ下离心１５ｍｉｎ，取上清；加入等体积异丙醇，轻轻摇匀后静置１０ｍｉｎ，于４℃、１２０００ｒ／ｍｉｎ下离心１０ｍｉｎ，弃上清；采用１ｍＬ７５％乙醇洗涤ＲＮＡ沉淀，于４℃、１２０００ｒ／ｍｉｎ下离心１０ｍｉｎ，弃上清；室温干燥，加入５０μＬ无ＲＮａｓｅ水，使ＲＮＡ充分溶解，并检测其浓度。

按照ＲＴ－ＰＣＲＳｙｓｔｅｍ反应体系试剂盒（ＴａＫａＲａ公司）的要求，将所提取的ＲＮＡ样品反转录为ｃＤＮＡ。

采用普通Ｐ
ＣＲ检测ｃＤＮＡ纯度，反应程序为：９５℃预变性５ｍｉｎ；９５℃变性３０ｓ，５８℃退火３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ，共３０个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ。

取５μＬ产物进行１％琼脂凝胶电泳，并于凝胶成像系统下观察结果。

采用Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ荧光定量ＰＣＲ检测ＡＤＳＬ基因的表达情况。

以鸡的β－ａｃｔｉｎ为内参基因，２０μＬ扩增体系为：ＳＹＢＲⅡ（ＴａＫａＲａ公司）１０μＬ、ＰｒｉｍｅｒＦ／Ｒ３．２μＬ、ｃＤＮＡ２μＬ、Ｈ２Ｏ４．８μＬ，引物序列见表１。

反应程序为：９５℃预变性５ｍｉｎ；９５℃变性１０ｓ，５８℃退火２０ｓ，７２℃延伸１５ｓ，共４０个循环。

表１　引物序列
基因引物
（
５’－３’）β－ａｃｔｉｎＦ：ＣＴＣＡＡＣＡＧＴＣＴＴＴＣＡＡＣＡＣＡＡＲ：ＧＣＡＧＣＡＴＴＣＡＴＣＣＡＣＴＡＴＴＣＡＤＳＬ
Ｆ：ＧＣＣＴＡＣＣＴＴＧＧＧＣＴＴＣＡＣＴＣＡＲ：ＣＴＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＧＣＡＣＡＡＧＴＣ
２　结果与分析
２．１　标准曲线及线性范围
将０．１ｍｇ／ｍＬ肌苷酸标准储备液分别配制为１、２、３、４μｇ／ｍＬ肌苷酸标准工作液，按“１．４．４”节设定色谱条件进行色谱分析，以肌苷酸浓度为自变量（ｘ），以相应的色谱峰面积响应值为因变量（ｙ）建立标准曲线方程。

结果表明，在２～４μ
ｇ／ｍＬ浓度范围内，肌苷酸浓度与峰面积响应值之间具有良好的线性关系。

回归方程为ｙ＝４３．８１６９ｘ－３０４．２９２，相关
系数ｒ
＝０．９９９６７１，ｒ２
＝０．９９９３４２。

标准曲线分布见图１。

２．２　肌苷酸标准品与样品的色谱对比分析
与以往研究不同，本试验采用甲酸铵缓冲液作为流动相测定了样品中肌苷酸的含量。

由标准样品的高效液相色谱（图２）可知，肌苷酸标准品的出峰时间为０．７５ｍｉｎ，各肌肉组织样品与其他组分的色谱峰之间达到了较好的分离，其中与标准品出峰时间较为接近的是０．７５ｍｉｎ的峰形。

检测所有样品发现，色谱峰保留时间均为０．７５～０．７７ｍｉｎ，因此可确定为肌苷酸的峰形（图３、图４）。

２．３　不同样品肌苷酸的含量
分别取黄羽鸡和略阳乌鸡１８日胚龄、６日龄、１８０日龄的胸肌和腿肌样品，制备样品溶液，采用“１．４．４”节的色谱条件进行分析，以峰面积套用图１的回归方程计算样品中肌苷酸的含量（表２）。

结果表明：与１８０日胚龄相比，黄羽鸡６日龄的腿肌中肌苷酸含量最高（Ｐ＜０．０１），１８０日龄时下降至最低（Ｐ＜０．０１）；略阳乌鸡６日龄的腿肌中肌苷酸含量最高，１８０日龄时有所降低，但仍明显高于１８日胚龄。

２个鸡种胸肌中的肌苷酸含量均在１８０日龄达到最高。

略阳乌鸡１８日胚龄、６日龄时腿肌和胸肌中的肌苷酸含量与黄羽鸡均没有显著差
表２　样品中肌苷酸的含量
年龄黄羽鸡肌苷酸含量（ｍｇ／１００ｇ）略阳乌鸡肌苷酸含量（ｍｇ／１００ｇ）腿肌胸肌腿肌胸肌１８日胚龄５１９．８２±８８．１６５８９．６７±６３．３０
６日龄９３４．６０±１１５．９４
ａａ
４６７．８８±１１０．３９１０５７．０４±１３６．６２ａａ
３９６．００±５５．２３
１８０日龄
３１５．１５±６９．５５
ａａ
１０１７．２２±６２．９１
９２１．７１±１００．１８
ａａｂｂ１４８１．７６±７９．８８
ｂｂ
注：与各组１８日胚龄相比较，“ａ”“ａａ”分别表示在０．０５、０．０１水平下差异显著；与黄羽鸡组中不同日龄的腿肌和胸肌相比较，“ｂ”“ｂｂ”分别表示在０．０５、０．０１水平下差异显著。

异；略阳乌鸡１８０日龄时腿肌和胸肌中的肌苷酸含量明显高于黄羽鸡，差异极显著（
Ｐ＜０．０１）。

２．４　不同日龄黄羽鸡和略阳乌鸡腿肌组织中ＡＤＳＬ基因的ｍＲＮＡ表达水平
分别取８日胚龄、１８日胚龄、６日龄、１８０日龄黄羽鸡和略阳乌鸡的腿肌组织提取Ｒ
ＮＡ，采用Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ荧光定量ＰＣＲ检测ＡＤＳＬ基因的ｍＲＮＡ表达情况。

结果表明：ＡＤＳＬ基因的表达随着日龄的增加呈上升趋势，
２个鸡种腿肌中ＡＤＳＬ基因的表达水平均在６日龄达到最高，然后逐渐下降；在１８日胚龄、６日龄、１８０日龄阶段，略阳乌鸡腿肌中ＡＤＳＬ基因的表达均明显高于黄羽鸡（图５
）。

３　结论与讨论
肌苷酸（ＩＭＰ）与畜禽肉类食品鲜味的产生密切相关
［３，８］
，
国内外学者对鸡、猪、鱼等动物肌肉中的ＩＭＰ开展了大量研究，目前世界上大多数国家均以肌苷酸含量作为评价肉类新鲜程度的指标之一。

乌骨鸡具有乌皮、乌肉、乌骨等特征，是我国传统的药食兼用鸡种。

陈国宏等对相同地方鸡种肌肉中的肌苷酸含量进行比较研究，发现泰和乌骨鸡的肌苷酸含量很高，此结论从客观上提示了乌骨鸡鲜味优于其他鸡种［９］。

王翠丽等研究发现，川南乌骨鸡中肌苷酸等风味物质含量丰
富
［１０］。

目前，对于陕西略阳乌鸡不同发育期肌肉中的肌苷酸含量尚无系统报道。

大量研究表明，肌苷酸的测定方法较多，但均存在一定缺陷。

紫外分光光度法仅用于粗略定量；毛细管电泳法的分离度偏低，导致肌苷和腺苷单磷酸等相似物质引起干扰；薄层层析法的操作步骤复杂，整个过程耗时多且回收率低。

高效液相色谱法是一种高效、快速、高选择性、高灵敏度的新型分离分析技术，样品分析程序简单快速，测定结果精确
［１１］。

本研
究采用高效液相法进行检测，结果发现样品的色谱峰保留时间大多为０．７５～０．７７ｍｉｎ，与标准品出峰时间基本一致，同时样品中其他组分的色谱峰之间也达到了较好的分离效果。

本
试验采用甲酸铵为流动相，作为水溶性弱酸盐，其有利于延长色谱柱的使用寿命，从而可用于大量样品的测定。

本研究检测了黄羽鸡和略阳乌鸡发育期３个时间点的肌苷酸含量。

结果表明，黄羽鸡和略阳乌鸡的腿肌均在６日龄时肌苷酸含量最高，胸肌则在１８０日龄时肌苷酸含量最高。

随着日龄的增加，腿肌中的风味物质在幼年时达到最高，然后逐渐降低；而胸肌中的风味物质却逐渐增多，表明胸肌中肌苷酸的合成主要发生在成年后。

比较２个鸡种发现，略阳乌鸡１８０日龄时腿肌和胸肌的肌苷酸含量均明显高于黄羽鸡，但其余时间段差异不显著。

对于不同鸡种，肌肉发育早期肌苷酸的合成没有显著差异，但成年后略阳乌鸡肌肉中肌苷酸的合成量明显多于黄羽鸡，因此成年略阳乌鸡的肉品质优于黄羽鸡。

肌苷酸在体内的合成代谢过程十分复杂，从头合成涉及１０步反应，腺苷琥珀酸裂解酶（ＡＤＳＬ）是催化第８步反应的酶，也是ＩＭＰ合成酶系中催化合成嘌呤核苷酸起始合成与循
环的唯一双功能酶［
６，１２］。

该酶催化２个重要的反应，由氨基咪唑琥珀基氨甲酰核苷酸生成氨基咪唑氨甲酰核苷酸的反应（由ＳＡＣＩＡＲ生成ＡＩＣＡＲ的反应），以及由腺苷酸琥珀酸生成腺苷酸单磷酸的反应，这２个反应对于肌肉中肌苷酸的最终含量具有重要影响，因此Ａ
ＤＳＬ基因也成为畜禽肉品鲜味研究的候选基因［１２］。

本研究对不同发育时期黄羽鸡和略阳乌
鸡腿肌中ＡＤＳＬ基因的表达进行了检测，结果表明：对于不同鸡种ＡＤＳＬ基因的表达趋势基本一致，表达量均在６日龄时最高；进一步比较不同日龄黄羽鸡和略阳乌鸡发现，略阳乌鸡腿肌中Ａ
ＤＳＬ基因的表达量在不同时期均明显高于黄羽鸡。

这与高效液相色谱检测肌苷酸含量的结果基本一致，表明ＡＤＳＬ基因的表达促进了肌苷酸的合成。

但也存在一定区别，略阳乌鸡腿肌中ＡＤＳＬ基因的表达量在不同发育时期均明显高于黄羽鸡，经高效液相检测，仅１８０日龄时腿肌中的肌苷酸含量明显高于黄羽鸡。

这是由于肌苷酸的合成涉及１０种关键酶，ＡＤＳＬ是关键酶之一但不是唯一酶。

对于不同鸡种，不同发育时期参与肌苷酸合成的关键酶表达的时空性也不同，从而导致肌苷酸的合成量表现出明显差异。

成年略阳乌鸡肌肉中的肌苷酸含量显著高于黄羽鸡，但不同鸡种间参与肌苷酸合成的其他酶的关键作用尚有待进一步研究。

参考文献：
［１］朱晓萍．家禽生长与肉质［Ｊ］．中国家禽，２０００（８）：３４－３５．［２］李慧芳，陈国宏，吴信生，等．动物肌肉肌苷酸研究进展［Ｊ］．动
物科学与动物医学，１９９９（４）：９－１０．
［３］罗桂芬，孙世铎，陈继兰，等．肉类风味物质：肌苷酸［Ｊ］．中国家
禽，２００４，２６（３）：４１－４３．
櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄
［４］苏一军，李慧芳，沈晓鹏，等．不同类型鸡肌肉肌苷酸含量分析和
比较［
Ｊ］．中国家禽，２００２，２４（２３）：９－１０．［５］李　燕，周培根，戚晓玉．肌苷酸和肌苷作为评价虾鲜度质量指
标的研究［Ｊ］．上海水产大学学报，２００２，１１（３）：２６４－２６７．［６］张学余，季从亮，陈国宏，等．鸡腺苷琥珀酸裂解酶（Ａｄｓｌ）基因多
态性及其与肌苷酸含量相关研究［Ｊ］．云南农业大学学报，２００６（２）：２３１－２３４．
［７］刘自华，胡庆荣，刘金笔，等．略阳鸡养殖概况与产业化经营思考
［Ｊ］．家禽科学，２００５（９）：３６－３８．
［８］张学余，李慧芳，耿拓宇，等．乌骨鸡肌肉肌苷酸含量［Ｊ］．中国
兽医学报，２００３，２３（３）：２６１－２６２．
［９］陈国宏，李慧芳，吴信生，等．泰和乌骨鸡肌肉肌苷酸含量变化规
律及其遗传力估测［
Ｊ］．扬州大学学报，２００２，２３（２）：２９－３２．［１０］王翠丽，柏　雪，邱　翔，等．乌骨鸡肉中氨基酸组成和肌苷酸
含量的分析［Ｊ］．西南民族大学学报：自然科学版，２０１１，３７（１）：９０－９２．
［１１］王欢欢，张　乐，李庆海，等．高效液相色谱法同时测定乌骨鸡
肌肉中的黑色素与肌苷酸［Ｊ］．中国家禽，２０１４，３６（２１）：１２－１６．　
［１２］徐善金，虞德兵，汪　峰，等．鸭腺苷琥珀酸裂解酶基因序列特
征及表达与肌肉肌苷酸含量的相关性分析［Ｊ］．中国农业科学，２０１２，４５（４）：７７４－７８５．
黄　攀，陆瀚文，周峥嵘，等．Ｋｅａｐ１、Ｎｒｆ２和ＨＯ－１在大鼠应激性胃溃疡中的表达［Ｊ］．江苏农业科学，２０１６，４４（１２）：２８０－２８２．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１６．１２．０８６
Ｋｅａｐ１、Ｎｒｆ２和ＨＯ－１在大鼠应激性胃溃疡中的表达
黄　攀１，陆瀚文１，周峥嵘１，宋广浩１，安　珂１，张　庄１，丁　威２
（１．江苏大学医学院，江苏镇江２１２０１３；２．江苏农林职业技术学院，江苏句容２１２４００）
摘要：探讨Ｋｅｌｃｈ样环氧氯丙烷相关蛋白－１（Ｋｅｌｃｈ－ｌｉｋｅｅｐｉｃｈｌｏｒｏｈｙｄｒｉｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ１，Ｋｅａｐ１）／核因子Ｅ２相关因子２（ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ－Ｅ２－ｒｅｌａｔｅｄｆａｃｔｏｒ２，Ｎｒｆ２）／血红素氧合酶－１（ｈｅｍｅｏｘｙｇｅｎａｓｅ１，ＨＯ－１）信号通路在应激性胃溃疡发生及发展中的作用。

建立大鼠水浸束缚应激性（ｗａｔｅｒｉｍｍｅｒｓｉｏｎａｎｄｒｅｓｔｒａｉｎｔｓｔｒｅｓｓ，ＷＲＳ）胃溃疡模型，按Ｇｕｔｈ标准计算溃疡指数（ｕｌｃｅｒｉｎｄｅｘ，ＵＩ），应用免疫组织化学检测Ｋｅａｐ１、Ｎｒｆ２、ＨＯ－１在胃黏膜组织中的定位和表达情况。

结果表明，
ＷＲＳ处理７ｈ后，大鼠胃黏膜出现明显的点线状出血；ＷＲＳ处理前后，Ｋｅａｐ１、Ｎｒｆ２、ＨＯ－１蛋白均主要定位于大鼠胃底腺细胞胞质中，其中Ｎｒｆ２在溃疡周围胃底腺细胞胞核中也有表达；ＷＲＳ处理７ｈ后，Ｋｅａｐ１表达量显著降低（Ｐ＜０．０５），于７ｄ后恢复至正常水平，而ＨＯ－１表达量显著升高（Ｐ＜０．０５），于３ｄ后恢复至正常水平；Ｎｒｆ２恢复３ｄ后表达量显著升高（Ｐ＜０．０５），随后出现下降。

ＷＲＳ处理后，Ｋｅａｐ１、Ｎｒｆ２、ＨＯ－１在大鼠胃黏膜中的定位和表达量均出现变化，提示Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２／ＨＯ－１信号通路可能在应激性胃溃疡的发生及发展过程中发挥了一定抗应激作用。

关键词：应激性胃溃疡；Ｋｅａｐ－１；Ｎｒｆ２；ＨＯ－１；大鼠
中图分类号：Ｓ８５８．９１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０１６）１２－０２８０－０３
收稿日期：２０１５－１１－０２
基金项目：国家自然科学基金（编号：８１３００２８７）；江苏省自然科学基金（编号：ＢＫ２０１１４９９、ＢＫ２０１４０５４１）；江苏大学高级人才项目（编号：１２ＪＤＧ０８４）。

作者简介：黄　攀（１９８４—），男，安徽安庆人，博士，讲师，主要从事消化道溃疡病研究。

Ｅ－
ｍａｉｌ：ｐｈｕａｎｇ＠ｕｊｓ．ｅｄｕ．ｃｎ。

通信作者：丁　威，博士，副教授，主要从事动物繁殖育种研究。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｉｓｈｉ６５９８＠１２６．ｃｏｍ。

应激性胃溃疡是动物受到环境应激后，交感神经系统（
ＳＮＳ）兴奋性升高，血管收缩，引起胃黏膜缺血、缺氧、抵抗力下降，从而产生的急性出血性损伤［１］。

应激性胃溃疡的发生
及发展与细胞氧化应激密切相关，应激后下丘脑－垂体－肾上腺轴（ＨＰＡ）敏感性升高，引起胃酸、胃蛋白酶、胃泌素分泌
增加［２－３］
；同时，皮质醇与儿茶酚胺的释放可诱导氧自由基的
产生，导致细胞膜内脂质过氧化物的生成，从而引起氧化应
激［
４］。

Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２／ＨＯ－１信号通路在细胞抗氧化损伤和炎症损伤过程中发挥重要作用［５］。

生理状态下，Ｎｒｆ２与胞浆伴
侣分子蛋白Ｋｅａｐ１偶联并被锚定在胞浆中，Ｎｒｆ２处于相对失活状态；当细胞暴露于氧自由基时，Ｋｅａｐ１的构象发生改变，
Ｎｒｆ２从二聚体上解离并转移进入细胞核，与核内抗氧化应答元件（
ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ，ＡＲＥ）结合，启动ＡＲＥ调控的下游抗氧化基因ＨＯ－１等的表达，清除多余的氧自由
基，从而发挥抗应激作用［６］。

王菲等研究发现，Ｋｅａｐ１和Ｎｒｆ２在热应激造成的大鼠肝脏损伤中发挥抗应激作用［７］。

沈锡
中研究发现，ＨＯ－１在乙酸诱导的大鼠胃溃疡中表达明显增
强，对胃黏膜具有一定保护作用［
８］。

在胃溃疡的发生及发展过程中，ＨＯ－１是否受上游Ｋｅａｐ１／Ｎｒｆ２／ＡＲＥ信号通路的调控有待验证。

通过研究Ｋ
ｅａｐ１／Ｎｒｆ２／ＨＯ－１信号通路相关蛋白在大鼠应激型胃溃疡中的表达情况，初步探讨其在应激性胃溃疡中可能发挥的作用。

１　材料与方法１．１　试剂
Ｋｅａｐ１抗体、Ｎｒｆ２抗体、ＨＯ－１抗体均购自大连宝生物公司，
ＡＢＣ试剂盒购自武汉博士德生物公司，ＤＡＢ购自Ｓｉｇｍａ公司（美国），动物切片石蜡（熔点为６０～６２℃）、多聚甲醛购自上海凌锋化学试剂有限公司。

其他试剂均为国产分析纯。