石家庄地区貉源大肠杆菌分离鉴定及毒力与耐药性分析

LI Wei1, LI Xin1, LIU Jinjun1, WANG Pengran1, YANG Feixia2, HAN Xueliang1, LIU Jie1 ※, REN Erjun1※
(1. Shijiazhuang Academy of Agriculture and Forestry Sciences/Hebei Innovation Center of Fur Animal Breeding, Shijia-
of lung tissue of diseased raccoon dogs was isolated and identified. Five strains of
were isolated and named DC1, DC2,
DC3, DC4 and DC5 respectively. The drug resistance, drug resistance gene, pathogenicity and virulence gene of the isolated bacteria were
耐药基因的 PCR 检测 参照文献[5]中报道合
成 20 对引物，对分离菌的耐药基因[ -内酰胺类：
，
，
；喹诺酮类： ， ，
， ， ， ；氨基糖苷类： ， ，
，， ，
，
，
；四环素类： ， ， ]进行检测。PCR 扩增体
系如下：总体积 20 L，模板 1 L，上下游引物各 0.5 L，
2 Taq PCR MasterMix II 10 L，ddH2O 8 L。充分混匀
庄地区分离到的貉大肠杆菌具有很强的耐药性和致病力，且携带有多种耐药基因和毒力基因。
关键词：肺炎；大肠杆菌；药敏试验；毒力基因；耐药基因
中图分类号：S858.92
文献标识码：A
文章编号：1001-4721（2023）04-0001-08
Isolation and Identification of Raccoon Dog-In derived Escherichia coli in Shijiazhuang and Analysis of Its Virulence and Drug Resistance
0.5 L，ddH2O 8 L。扩增程序如下：94 ℃ 3 min；94 ℃
30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共 35 个循环；72 ℃ 5 min。
扩增片段预期大小 1 500 bp左右，并送测序公司测序，
测序结果在 GenBank 中 BLAST 搜索比对。
药敏试验 采用 K-B 纸片法开展药敏试验，
主要试剂 胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）、MuellerHinton（MHA）、麦康凯（MAC）、SS、伊红美兰（EMB） 琼脂培养基，均购自青岛海博生物；细菌 DNA 提取试 剂盒、DL-2 000 Marker，均购自宝生物工程（大连）有 限公司；大肠杆菌 ATCC2592 菌株（质控菌株），购自 中国兽药监察所；药敏纸片，肠杆菌科细菌生化鉴定 管，均购自杭州天和微生物试剂有限公司；2 Taq PCR MasterMix II 和琼脂糖凝胶，均购自天根生化科技（北 京）有限公司；50 TAE，购自北京索莱宝科技有限公 司；核酸染料 SuperStain，购自北京全式金生物科技有 限公司。 1.2 方法
isolated from Shijiazhuang has strong drug resistance and pathogenicity,
and carries a variety of drug resistance genes and virulence genes.
Keywords: pneumonia;
; The 16S rRNA sequences were more than 99% homologous to the known
sequences;The resistance rate of 5 isolated bacteria
to penicillin, amoxicillin, tetracycline, metronidazole and lincomycin was 100%; The detection rate of
and was 100%, and the
detection rate of was 80%; The results of mouse pathogenicity test showed that the 5 strains of isolated bacteria could cause death of
1 材料与方法 1.1 材料
病料来源 河北省石家庄地区 5 个貉养殖场 分窝的 5 只仔貉发生鼻镜干燥、腹式呼吸和咳嗽等特 征的疾病。无菌采集貉的肺脏，对病原菌分离、培养和 鉴定。
试验动物 SPF 级健康 KM 小鼠 30 只，6~8 周龄，体重为 18~ 22 g，购自北京维通利华实验动物技 术有限公司。
rRNA 测序结果与大肠杆菌序列的同源性超过 99%；5 株分离菌对青霉素、阿莫西林、四环素、甲硝唑和林可霉素的耐药率为 100%；
和 耐药基因检出率均为 100%， 检出率为 80%；小鼠致病性试验结果显示，5 株分离菌均可导致小鼠死亡，但小鼠
死亡时间和只数范围存在差异；
和
毒力基因检出率为 100%， 和 检出率为 80%。研究表明，本次从石家
摘要：为了探明河北石家庄地区 5 个貉养殖场发生肺炎死亡的原因，对病貉肺脏组织进行病原菌分离鉴定，共分离到 5 株大肠杆菌
（DC1、DC2、DC3、DC4 和 DC5），并对分离菌的耐药性、耐药基因、致病性和毒力基因等进行研究。分离菌在 MAC、SS 和 EMB 培养
基上长出菌落颜色分别为粉红色、红色和绿色金属光泽，革兰氏染色为革兰氏阴性短杆菌；生化试验结果符合大肠杆菌特性；16S
zhuang 050041, China; 2. Beijing Tonghe Litai Biotechnology Co,. Ltd, Beijing 102600, China)
Absrtact: In order to find out the cause of death from pneumonia in five raccoon dog farms in Shijiazhuang, Hebei Province. The pathogen
后，放入 PCR 仪中。扩增程序如下：94 ℃ 3 min；94 ℃
30 s；退火温度根据不同引物设置（48~60 ℃），30 s，72 ℃
延伸（根据目的片段长度设置）30~60 s，共 35 个循环；
72 ℃终延伸 5 min。扩增产物取 3 L用核酸电泳检测。
收稿日期：2022-12-03 基金项目：河北省重点研发计划项目（21326357D）；石家庄市财政专项项目（2022-03） 作者简介：李伟（1990-），男，河北石家庄人，硕士，兽医师，从事毛皮动物疾病防治研究。 ※通讯作者：刘洁（1983-），女，河北定州人，博士，高级畜牧师，从事毛皮动物饲养研究；任二军（1972-），女，河北任丘人，博士，研究
studied. The results showed that the colony color of the isolated bacteria on MAC, SS and EMB medium was pink, red and green metallic
luster respectively; Gram staining showed it was red negative bacilli; The biochemical test results were consistent with the char出单克隆菌落，在
鉴定管内接种，用密封膜密封好；培养箱中培养 24 h
后观察生化管两端有无气泡和颜色变化；根据编码
值查找肠杆菌科细菌的生化编码书，确定菌株的种属
特性。
16S rRNA 扩增与序列分析 分离菌株接种于
3 mL TSB 培养基中，在 37 ℃和 220 r/min 下摇菌 12 h
; drug susceptibility test; virulence gene; drug resistance gene
貉最早是由中国农业科学院特产研究所对野生乌 苏里貉进行驯化和繁殖，已有 60 多年的历史。貉皮以
轻盈、柔软、美丽和保暖而闻名，尤其是近些年派克服 的流行，导致市场对貉皮的需求急剧增加。
按照临床及实验室协会标准要求进行操作。判断药物
是否敏感的标准如下：抑菌圈直径在 15.1~20 mm 范
围为高度敏感；10.1~15 mm 为中度敏感；≤ 10 mm 为
耐药[2,3]。
毒力基因的 PCR 检测 参照文献[4]中报道合
成 20 对引物。PCR 扩增体系如下：总体积 20 L，模板
1 L，上下游引物各 0.5 L，2 Taq PCR MasterMix II
左右，提取分离菌的基因组用作PCR扩增的模板。16S
rRNA 通用引物序列为：P1: 5'-AGAGTTTGATCMTG-
GCTCAG-3'，P2: 5'-GGTTA CCTTGTTACGACTT-3'，
由生工生物合成。扩增体系如下：总体积 20 L，模板
1 L，2 Taq PCR MasterMix II 10 L，上、下游引物各
细菌分离培养及染色镜检 无菌采集病死貉肺 脏，接种针穿破肺脏划线于 TSA 培养基，倒置放于 37 ℃ 培养箱过夜。挑单克隆菌分别接种于MAC、SS和EMB 平板，37 ℃培养过夜。纯化后菌落滴一滴于载玻片，革 兰氏染色后置于油镜下观察。
生化试验 用肠杆菌科细菌的生化鉴定管鉴
研
究
2023 年第 45 卷第 4 期
大肠杆菌是引起貉肺炎的主要病原之一，临床上 以抗生素为主进行治疗。然而，由于养殖户不能科学用 药，导致很多耐药毒株出现。毒株可通过多种途径传 播，对公众健康造成威胁。本研究于 2021 年从河北省 石家庄地区病死貉肺组织中分离到 5 株致病性大肠 杆菌，并对其致病力、毒力基因、耐药性及耐药基因等 进行研究，对预防和控制石家庄地区貉大肠杆菌肺炎 以及耐药性和致病性机制研究具有重要意义。
员，从事毛皮动物饲养研究。
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2
特
产
近些年，由于养殖密度增加、环境恶劣以及养殖户 滥用抗生素，貉肺炎频发，主要危害呼吸系统。主要症 状是咳嗽和气喘等，剖检后肺脏出血淤血，给养殖户造 成严重的经济损失。据统计，每年由于肺炎导致貉死亡 率在 5%~50%，河北省貉养殖总量约 700 万只，以每 张皮平均销售价格 300 元计算，每年因为肺炎造成的 经济损失至少在 1 亿元以上[1]。
10 L，ddH2O 8 L。充分混匀后，放入 PCR 仪中。扩增 程序如下：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s；退火温度根据不同
引物设置（55~66 ℃），30 s，72 ℃延伸（根据目的片段长
度设置）30~60 s，共 35 个循环；72 ℃终延伸 5 min。扩
增产物取 3 L 用核酸电泳检测。
特产研究
Special Wild Economic Animal and Plant Research
1
DOI：10.16720/ki.tcyj.2023.114
石家庄地区貉源大肠杆菌分离鉴定及毒力与耐药性分析
李伟1，李鑫1，刘进军1，王朋然1，杨飞霞2，韩学良1，刘洁1※，任二军1※
（1. 石家庄市农林科学研究院/河北省毛皮动物养殖技术创新中心，河北 石家庄 050041； 2. 北京通和立泰生物科技有限公司，北京 102600）
mice, but the time and number of mice died were different; The detection rate of
and
genes was 100%, and the detection
rate of and genes was 80%. This shows that the