AT1受体拮抗剂和ACEI对大鼠心肌肥厚时AT1 mRNA表达的影响
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AT1受体拮抗剂和ACEI对大鼠心肌肥厚时AT1 mRNA表达的影响目的探讨血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)及其受体AT1在心肌肥厚中的作用,
研究DMP811(AT1受体拮抗剂)、培哚普利(ACEI)对AngⅡ诱导的心肌肥厚大鼠心肌AT1 mRNA表达水平的影响。
方法24只6周龄的SD雄性大鼠随机分为4组:正常对照组、AngⅡ组、AngⅡ+DMP811组、AngⅡ+培哚普利组,每组6只。
分别皮下埋藏装有生理盐水或AngⅡ的渗透微泵。
1周后观察心脏质量、心脏质量/体质量的变化,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测心肌AT1mRNA表达情况,并进行比较。
结果①输注AngⅡ7 d不会明显影响大鼠的体质量,但可使大鼠的心脏质量、心脏质量/体质量显著增加。
AngⅡ组较正常对照组心脏质量、心脏质量/体质重明显增加(P<0.05);与AngⅡ+DMP811组、AngⅡ+培哚普利组相比,AngⅡ组心脏质量、心脏质量/体质量也明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05),而AngⅡ+DMP811组、AngⅡ+培哚普利组的心脏质量、心脏质量/体质量差异无统计学意义(P>0.05)。
②AngⅡ组的AT1 mRNA 水平较对照组上调(84.5±3.0)%(P<0.01),DMP811、培哚普利药物干预,可使AngⅡ诱导的AT1 mRNA的转录上调有效阻断。
而AngⅡ+DMP811组、Ang Ⅱ+培哚普利组的AT1 mRNA水平差异无统计学意义(P>0.05)。
结论心肌肥厚时AT1 mRNA的表达水平明显增加,且AngⅡ诱导了AT1 mRNA的转录上调。
而AngⅡ导致的上述改变能被DMP811、培哚普利有效阻断,为以后防治心肌肥厚提供了重要依据。
标签:AT1受体拮抗剂;培哚普利;心肌肥厚
心肌肥厚指心脏大小、形状、质量及细胞水平的各种变化。
长期的心肌肥厚很容易导致心力衰竭或猝死[1]。
心肌肥厚时,尤其是室间隔的非对称性肥厚、心律失常、运动耐量受损及猝死,是一种原发于心肌的疾病[2]。
分子遗传学研究表明,心肌肥厚是心肌标志蛋白表达水平升高,心肌细胞体积增大,同时伴随心脏质量增加的过程[3]。
肾素-血管紧张素系统(renin angiotensin system,RAS)在引起心肌肥厚的诸因素中具有重要的作用[4],它可以维持血压、机体内环境的稳定平衡,也调节细胞的生长、分化,尤其调控多种慢性疾病的组织改建和器官重构[5]。
RAS属于循环系统激素,其中关键物质是血管紧张素Ⅱ(AngⅡ),它是重要的促心肌肥厚因子,具有强烈的收缩血管作用[6],其亚型血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1)的活化参与了AngⅡ的大部分生物学效应。
因此研究AT1发挥作用的机制及其受体拮抗剂的作用,对于了解心肌肥厚的形成,制订合理的预防和逆转措施,有着极其深远的意义。
1 材料与方法
1.1实验动物与材料
雄性SD大鼠24只,体重150~170 g,6~8周龄,购自重庆腾鑫生物技术有限公司,所有动物均自由饮水和摄食,并给予人性化管理。
AngⅡ购自美国SIGMA公司,DMP811由美国SIGMA公司赠送,2001型微量渗透泵购自美国
健康医疗仪器国际公司。
1.2 实验方法
1.2.1 动物模型的建立及分组将24只雄性SD大鼠随机分为4组,每组6只,适应性喂养1周后,水合氯醛腹腔注射麻醉,皮下分别给予装有生理盐水或AngⅡ的渗透微泵。
①正常对照组:输注生理盐水(1 μl/h);②AngⅡ组:输注AngⅡ[200 ng/(kg·d)];③AngⅡ+DMP811组:输注AngⅡ+DMP811管饲[3 mg/(kg·d)];④AngⅡ+培哚普利组:AngⅡ输注+培哚普利管饲[10 mg/(kg·d)],直至术后1周处死。
1.2.2 血流动力学检测分别于手术当天、第3天、第7天测量动物的体质量(body weight,BW),术后1周断头处死大鼠,取其心脏,去掉心房及残余组织,只留下心室。
并用PBS缓冲液洗净心腔残存血液之后用滤纸吸干,称重,并计算心室质量(cardioc weight,CW)与大鼠体质量之比(cardioc weight/body weight,CW/BW)。
立即液氮速冻,之后存于-70℃冰箱备用。
1.2.2 心肌AT1 mRNA检测实时荧光定量反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测大鼠心肌组织AT1 mRNA:标本解冻后,立即超声破碎细胞,装于EP管并置于冰上,于4℃条件下12 000 r/min离心10 min。
取上清液转移至DEPC预处理的EP管中,室温放置5 min 使样本充分裂解。
采用Trizol法提取心脏组织RNA,在测量仪上定量,之后于-70℃保存。
电泳结果显示三条RNA条带,分别为28S、18S、5S依次清晰递减,泳道上无明显弥散痕迹,说明总RNA提取完整无明显降解,满足后续实验要求。
将组织中提取的总RNA以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物反转录成cDNA,根据目的基因序列设计探针和引物,在PCR仪上进行扩增。
内参对照选定管家基因GAPDH,引物由TaKaRa公司合成并经质量检测。
反应体系在FTC2000型荧光定量PCR仪上进行,反应条件:94℃预变性2 min,然后94℃变性20 s,55℃退火30 s,72℃延伸40 s,进行45个循环。
在PCR反应过程中,设定无cDNA样品的空白管作为阴性对照。
AT1上游引物:5′-CACCTATGTAAGATCGCTT-3′;下游引物:5′-GATGATGATGCAGGTGACT-3′;扩增片段长度:162 bp;GADPH上游引物:5′-TGACATCAAGAAGGTGGTGA-3′;下游引物:5′-TCATACCAGGAAATGAGCTT-3′;扩增片段长度:177 bp。
1.2.3 荧光定量PCR 按10倍梯度将一待测cDNA样品稀释,在相同条件下进行PCR扩增,横坐标为样品拷贝数的对数,纵坐标为CT值,拟合A T1 mRNA及GAPDH的荧光定量PCR标准曲线。
在目的基因和管家基因扩增效率一致的基础上,以2-ΔΔCT表示目的基因的相对表达量,CT值代表每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所进行的循环数。
以各样本的CT值减去其对应的内参照基因GAPDH的CT值得到ΔCT值,取一个参照组的ΔCT值的平均值作为对照基准,用每个标本的ΔCT 值减去参照组的ΔCT值,得到ΔΔCT。
计算2-ΔΔCT值,并统计各组之间的差异性。
2-ΔΔCT值的意义:每个样本的基因的表达是参照组的基因表达平均值的多少倍。
1.2.4 统计学处理使用SPSS 13.0统计学软件,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,两组间比较用t检验,多组间比较采用方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组心脏质量比较
输注AngⅡ7 d,AngⅡ组较对照组CW及CW/BW明显增加(P<0.05);与AngⅡ+DMP811组、AngⅡ+培哚普利组相比CW及CW/BW也显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05),而AngⅡ+DMP811组、AngⅡ+培哚普利组的CW 及CW/BW差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。
2.2 各组心肌组织AT1 mRNA表达
输注AngⅡ7 d,对照组AT1 mRNA水平为8.680±9.53,AngⅡ组AT1 mRNA 水平为16.033±13.71,AngⅡ+DMP811组AT1 mRNA水平为5.410±4.75,AngⅡ+培哚普利组AT1 mRNA水平为5.685±0.30,较对照组上调(84.5±3.0)%(P<0.01),DMP811、培哚普利与AngⅡ合用有效阻断AngⅡ诱导的AT1 mRNA的转录上调。
3讨论
RAS是体内重要的分泌系统,除循环RAS外,在心血管、肾脏、脑等组织中,还存在局部RAS。
局部RAS主要通过自分泌或旁分泌参与机体功能调节[7]。
RAS中的AngⅡ与心肌肥厚的发生关系极为密切。
AngⅡ能促进细胞合成增生蛋白,此作用在心肌增生的早期信号传导过程中非常重要,它可以使血管强烈收缩,且在外周组织局部如肾上腺、心脏、肾脏和血管等均可自动产生AngⅡ,且Ang Ⅱ通过其特异的AT1受体介导完成大部分心血管效应[8]。
AT1受体及其下游的信号分子参与细胞增殖、迁移,最终导致血管壁及心肌增生肥厚[9]。
本研究大鼠心肌肥厚机制也证实了这一点。
心肌肥厚大鼠心室中AngⅡ及AT1 mRNA 的表达明显高于对照组。
输注AngⅡ7 d可使大鼠CW、CW/BW增加,说明在整体动物内经AngⅡ短期作用后,AngⅡ可以直接诱导心肌重塑,进一步证实了除血压外其他的因素也可以引起心肌重塑。
曾有报道在体外培养发现AngⅡ可以促心肌细胞生长和心脏间质细胞增生[10],与本文结果相似。
本实验结果提示,活体动物AngⅡ使AT1基因表达上调,而这又进一步加强了AngⅡ引起的心肌重塑效应,两者有相互促进的作用。
临床发现心肌重塑是一个持续进展的过程,因而通过探讨AT1的表达调控机制,可为如何阻断由AT1基因表达上调所引起的心肌重塑及最终的心肌肥厚提供指导。
DMP811是一种新型的AT1受体拮抗剂。
它可以阻断靶组织上的AT1受体,从而消除AngⅡ引起的种种不良作用,如心肌、血管重构、血管收缩和血压增高等[11]。
它通过增加细胞间的缝隙连接,减低纤维化从而改善心力衰竭的冲动传导[12]。
DMP811之所以能够阻止受体与AngⅡ结合,是由于其占据了AT1受体上的7个跨膜空间。
本实验结果提示:AT1拮抗剂可延长和逆转心肌肥厚的发生,在逆转心肌肥厚同时也降低了心肌中的AngⅡ含量。
培哚普利是ACEI类药物,有研究报道[13],ACEI类药物通过两方面的共同作用,预防并减轻心肌肥厚的发生:①直接抑制作用,即ACEI类药物抑制心脏局部自行生成AngⅡ;②间接抑制作用,即ACEI 类药物抑制心脏交感神经末梢释放儿茶酚胺,进一步使儿茶酚胺递质对α或β受体激活作用减弱。
综合上述作用,ACEI类药物可改善心肌细胞的重塑,降低因心脏扩大引起的心力衰竭的发生率。
本实验结果提示ACEI和AT1受体拮抗剂通过阻断RAS,抑制AngⅡ引起的AT1 mRNA表达上调,两者通过干预RAS,达到相同的目的——阻断心肌肥厚的发生。
从本研究结果可见,AngⅡ引起的生物学效应是由AT1介导的,它可以直接造成心肌肥厚。
本实验结果提示:AT1表达水平的高低与AngⅡ所致的心脏质量的变化密切相关,提示在整体水平上,AngⅡ上调AT1的表达,从而进一步加剧心肌细胞的重塑作用。
由此可见,在整体水平上研究如何调控AngⅡ及其受体AT1的基因表达机制对于防治心肌肥厚具有重要的理论和现实意义。
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