一株裂解耐氨苄西林金黄色葡萄球菌的噬菌体及其生物学特性与全基因组分析

㊀山东农业科学㊀２０２４ꎬ５６(３):１３２~１３８ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ
㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２４.０３.０１８
收稿日期:２０２３－０４－２６
基金项目:国家现代农业产业技术体系项目(ＣＡＲＳ３６)ꎻ山东省重点研发计划(乡村振兴科技创新提振行动计划)项目 预制菜全链条智
慧生产技术创新与应用 (２０２２ＴＺＸＤ００２１)ꎻ山东省农业科学院农业科技创新工程项目(ＣＸＧＣ２０２２Ａ２８)
作者简介:张雪丽(１９９６ )ꎬ女ꎬ河南驻马店人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事奶牛疾病诊断与防控技术研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:１４６６８７９７６３＠ｑｑ.ｃｏｍ
通信作者:杨宏军(１９７６ )ꎬ男ꎬ山东曲阜人ꎬ博士ꎬ研究员ꎬ主要从事奶牛疾病诊断与防控技术研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｙａｎｇｈｏｎｇｊｕｎ１６６＠１６３.ｃｏｍ
张亮(１９８６ )ꎬ男ꎬ山东潍坊人ꎬ博士ꎬ副研究员ꎬ主要从事牛支原体研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｍｏｏｎ３３４４０１＠１６３.ｃｏｍ
一株裂解耐氨苄西林金黄色葡萄球菌的噬菌体
及其生物学特性与全基因组分析
张雪丽１ꎬ２ꎬ于浩淼２ꎬ闫振贵２ꎬ杨少华１ꎬ３ꎬ张亮１ꎬ３ꎬ杨宏军１ꎬ３
(１.山东省农业科学院畜牧兽医研究所/农业农村部畜禽生物组学重点实验室ꎬ山东济南㊀２５０１００ꎻ
２.山东农业大学动物科技学院ꎬ山东泰安㊀２７１０１８ꎻ３.山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室ꎬ山东济南㊀２５０１００)
㊀㊀摘要:本研究旨在分离能够高效裂解耐药金黄色葡萄球菌的噬菌体ꎬ为噬菌体生物制品的研制提供候选材料ꎮ以耐氨苄西林金黄色葡萄球菌为宿主菌ꎬ用双层平板法分离噬菌体ꎬ通过透射电子显微镜观察噬菌体形态ꎬ并对其进行生物学特性分析及全基因组测序分析ꎮ结果分离得到一株金黄色葡萄球菌噬菌体ꎬ效价达２.７５ˑ１０１０ＰＦＵ/ｍＬꎬ命名为ＳＰ６８８ꎮ该噬菌体具有长的不收缩尾巴ꎬ属长尾噬菌体科ꎬ对７株耐氨苄西林金葡菌均有裂解效果ꎬ最佳感染复数为１ꎬ可在１０ｈ内抑制细菌生长ꎬ在温度－２０~５４ħ范围和ｐＨ值３~１１之间活性稳定ꎬ对紫外线敏感ꎮ全基因组分析显示ꎬＳＰ６８８基因组为环状ＤＮＡꎬ全长４５４９９ｋｂꎬＧＣ含量为３４.１％ꎻ预测到６４个开放阅读框(ＯＲＦｓ)ꎬ其中１９个(２９.６９％)被预测功能ꎮ该噬菌体是一株新型裂解耐氨苄西林金黄色葡萄球菌的广谱噬菌体ꎬ可为噬菌体治疗提供材料ꎮ
关键词:金黄色葡萄球菌ꎻ噬菌体ꎻ形态ꎻ生物学特性分析ꎻ全基因组分析
中图分类号:Ｓ８５２.６㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２４)０３－０１３２－０７
ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎｄＣｏｍｐｌｅｔｅＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆ
ａｎＡｍｐｉｃｉｌｌｉｎ￣ＲｅｓｉｓｔａｎｔＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＰｈａｇｅ
ＺｈａｎｇＸｕｅｌｉ１ꎬ２ꎬＹｕＨａｏｍｉａｏ２ꎬＹａｎＺｈｅｎｇｕｉ２ꎬＹａｎｇＳｈａｏｈｕａ１ꎬ３ꎬＺｈａｎｇＬｉａｎｇ１ꎬ３ꎬＹａｎｇＨｏｎｇｊｕｎ１ꎬ３
(１.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ/ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆ
ＬｉｖｅｓｔｏｃｋａｎｄＰｏｕｌｔｒｙＢｉｏｏｍｉｃｓꎬＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＲｕｒａｌＡｆｆａｉｒｓꎬＪｉｎａｎ２５０１００ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＴａｉａｎ２７１０１８ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＳｈａｎｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＬｉｖｅｓｔｏｃｋａｎｄＰｏｕｌｔｒｙＤｉｓｅａｓｅＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄＢｒｅｅｄｉｎｇꎬＪｉｎａｎ２５０１００ꎬＣｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀Ｔｈｉｓｓｔｕｄｙａｉｍｅｄｔｏｉｓｏｌａｔｅｐｈａｇｅｓｗｉｔｈｈｉｇｈｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｆｏｒｌｙｓｉｎｇｄｒｕｇ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓꎬａｎｄｔｏｐｒｏｖｉｄｅｃａｎｄｉｄａｔｅｍａｔｅｒｉａｌｓｆｏｒｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｐｈａｇｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｄｕｃｔｓ.Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｕｓｉｎｇａｍｐｉ￣ｃｉｌｌｉｎ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔＳ.ａｕｒｅｕｓａｓｈｏｓｔｂａｃｔｅｒｉｕｍꎬｔｈｅｐｈａｇｅｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｂｙｄｏｕｂｌｅ￣ｌａｙｅｒｐｌａｔｅｍｅｔｈｏｄꎬａｎｄｔｈｅｎｉｔｓｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｂｙｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙꎬｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎｄｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎａｌｙｓｅｓ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔａＳ.ａｕｒｅｕｓｐｈａｇｅｗｉｔｈｔｈｅｔｉｔｅｒｏｆ２.７５ˑ１０１０ＰＦＵ/ｍＬｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄꎬｎａｍｅｄａｓＳＰ６８８.ＴｈｅｐｈａｇｅｈａｄａｌｏｎｇｕｎｃｏｎｔｒａｃｔｅｄｔａｉｌꎬｗｈｉｃｈｂｅｌｏｎｇｅｄｔｏＣａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓꎬｔｈｅｌｏｎｇｔａｉｌｐｈａｇｅｆａｍｉｌｙ.Ｉｔｗａｓｃａｐａｂｌｅｏｆｌｙｓｉｎｇ７ｓｔｒａｉｎｓｏｆａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔＳ.ａｕｒｅｕｓｗｉｔｈｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｍ￣ｐｌｅｘｎｕｍｂｅｒｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｓ１ꎻｉｔｃｏｕｌｄｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｌｇｒｏｗｔｈｗｉｔｈｉｎ１０ｈｏｕｒｓｗｉｔｈｓｔａｂｌｅａｃｔｉｖｉｔｙａｔ－２０ħｔｏ５４ħａｎｄｐＨ３~１１ꎻｉｔｗａｓｓｅｎｓｉｔｉｖｅｔｏＵＶ.ＴｈｅｌｅｎｇｔｈｏｆＳＰ６８８ｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅｗａｓ４５４９９ｋｂꎬｄｅｆｉｎｅｄａｓａｃｉｒｃｕｌａｒＤＮＡｗｉｔｈＧＣｃｏｎｔｅｎｔａｓ３４.１％.Ａｔｏｔａｌｏｆ６４ＯＲＦｓｗｅｒｅｆｏｕｎｄꎬａｎｄ１９ｏｎｅｓ(２９.６９％)
ｗｅｒｅｐｒｅｄｉｃｔｅｄｉｎｆｕｎｃｔｉｏｎ.Ｔｈｉｓｐｈａｇｅｗａｓａｎｏｖｅｌｂｒｏａｄ￣ｓｐｅｃｔｒｕｍｏｎｅｌｙｓｉｎｇａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔＳ.ａｕｒｅｕｓꎬｗｈｉｃｈｍｉｇｈｔｐｒｏｖｉｄｅｒｅｓｅａｒｃｈｍａｔｅｒｉａｌｆｏｒｐｈａｇｅｔｈｅｒａｐｙ.
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓꎻＰｈａｇｅꎻＭｏｒｐｈｏｌｏｇｙꎻＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓꎻＷｈｏｌｅｇｅ￣ｎｏｍｅａｎａｌｙｓｉｓ
㊀㊀金黄色葡萄球菌是奶牛乳腺炎的主要致病菌之一[１]ꎮ随着抗生素的广泛应用ꎬ金黄色葡萄球菌的耐药性不断增加ꎬ致使抗生素治疗效果不理想ꎬ奶牛乳腺炎难以得到控制和根除[２－３]ꎮ同时ꎬ抗生素残留所引起的弃奶进一步加剧了养殖场的经济损失[４]ꎮ在国家提倡 减抗替抗 的政策引导下ꎬ需要有新的制剂用于奶牛乳腺炎的防治ꎮ噬菌体是一类侵袭细菌的病毒ꎬ具有独特的裂解机制和严格的宿主特异性ꎬ同时具有增殖速度快㊁研发时间短㊁高效裂解耐药细菌等优点[５－６]ꎮ随着对噬菌体研究的不断加深ꎬ一些可裂解多重耐药细菌的噬菌体被发现ꎬ如可裂解金黄色葡萄球菌㊁肺炎克雷伯杆菌等[７－８]ꎮ作为一种安全的生物制剂ꎬ噬菌体对于未来多重耐药性细菌感染的治疗具有重要意义ꎮ
本研究以从临床乳腺炎的奶牛乳汁中分离到的耐氨苄西林的金黄色葡萄球菌为宿主进行噬菌体的分离筛选ꎬ对筛选出的噬菌体进行生物学特性分析及基因组分析ꎬ以期为金黄色葡萄球菌噬菌体的研究及其对奶牛乳腺炎的治疗防控提供理论基础ꎮ
１㊀材料与方法
１.１㊀试验材料
１.１.１㊀试验菌株及污水㊀供试菌株均由山东省农业科学院草食家畜疫病防控创新团队分离保藏ꎬ金黄色葡萄球菌分离于临床乳房炎患牛乳汁样品ꎬ部分大肠杆菌分离于环境样品ꎮ污水来源于济南某规模化奶牛场粪污水混样ꎮ
１.１.２㊀主要试剂和仪器㊀ＬＢ肉汤培养基购自北京陆桥技术股份有限公司ꎻ噬菌体基因组提取试剂盒购自上海尚宝生物科技有限公司ꎻＤＮＡ酶Ⅰ(ＤＮａｓｅⅠ)㊁ＲＮＡ酶Ａ(ＲＮａｓｅＡ)及绿豆核酸酶(ＭｕｎｇＢｅａｎＮｕｃｌｅａｓｅ)购自北京阿匹斯生物科技有限公司ꎻ０.２２μｍ细菌滤器购自ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ公司ꎮ冷冻高速离心机㊁动态酶标仪购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司ꎻＪＥＭ－２１００Ｐｌｕｓ透射电子显微镜(ｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅꎬＥＭ)购自日本电子株式会社ꎮ
１.１.３㊀缓存液㊀参照文献[９]配制ＳＭ缓存液ꎬ配方略有调整ꎬ不加入明胶ꎮ１２１ħ高压灭菌１５ｍｉｎꎬ４ħ保存备用ꎮ
１.２㊀试验方法
１.２.１㊀噬菌体的富集㊀将污水混样１２０００ｒ/ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ除杂ꎬ收集上清液ꎮ使用０.２２μｍ滤器过滤上清液ꎬ４ħ保存备用ꎮ将处于对数生长期的宿主菌㊁污水上清液㊁无菌ＬＢ肉汤培养基按１ʒ５ʒ１０体积比充分混匀ꎬ于３７ħ㊁１８０ｒ/ｍｉｎ摇床培养２４ｈꎬ离心过滤ꎬ备用ꎮ
１.２.２㊀噬菌体的纯化㊀参照双层平板法分离噬菌体[１０]ꎬ用无菌针头挑取单个噬菌斑到２ｍＬ无菌离心管中ꎬ加入１ｍＬＳＭ缓存液充分混匀ꎬ４ħ过夜ꎮ次日离心过滤ꎬ将滤液连续１０倍梯度稀释至１０－１０ꎮ重复上述操作３~４次ꎬ直至得到大小均匀㊁边缘清晰㊁透亮的噬菌斑ꎮ
１.２.３㊀噬菌体效价测定㊀将纯化好的噬菌体连续１０倍梯度稀释ꎬ每个浓度取１００μＬꎬ用双层平板法培养得到噬菌斑ꎬ选择噬菌斑生长范围在２０~３００个的平板进行计数ꎮ每个浓度梯度做３个重复ꎬ取平均值计算噬菌体效价ꎮ噬菌体效价(ＰＦＵ/ｍＬ)＝噬菌斑平均数ˑ稀释倍数ˑ１０ꎮ１.２.４㊀噬菌体的电镜观察㊀取１００μＬ纯化后的噬菌体(１０６ＰＦＵ/ｍＬ)滴加到干净的膜上ꎬ将铜网放入噬菌体液中静置２０ｍｉｎ取出ꎬ自然吸收２０ｓ后吸去多余液体ꎮ用醋酸铀染液染色ꎬ２ｍｉｎ后取出并吸去残留的染液ꎬ洗涤干燥ꎮ接着放入另１滴醋酸铀染液中复染ꎬ２ｍｉｎ后取出ꎬ吸去残留染液ꎬ干燥后透射电镜观察噬菌体形态ꎮ１.２.５㊀噬菌体的最佳感染复数㊀参照Ｎｉｕ等[１１]的方法ꎬ将噬菌体浓缩液(１ˑ１０９ＰＦＵ/ｍＬ)连续１０倍稀释至１０３ＰＦＵ/ｍＬꎬ每个浓度噬菌体稀释液各取１００μＬ与宿主菌(１ˑ１０６ＣＦＵ/ｍＬ)１ʒ１共同接种到９６孔板中ꎬ每浓度设３个重复ꎮ３７ħ温箱中培养６~１０ｈꎮ以细菌组为阴性对照㊁ＳＭ
３３１
㊀第３期㊀张雪丽ꎬ等:一株裂解耐氨苄西林金黄色葡萄球菌的噬菌体及其生物学特性与全基因组分析
缓冲液组为空白对照ꎮ培养结束后ꎬ记录无细菌生长孔的最低噬菌体浓度ꎬ即微孔内培养液呈澄清透明ꎬ无弥散状浑浊或丝状沉淀ꎮ同时测波长
６００ｎｍ处吸光值(ＯＤ６００)ꎮ噬菌体－宿主试验的感染复数ＭＯＩ＝每孔噬菌体数/每孔细菌数ꎮ１.２.６㊀噬菌体裂解动力学㊀参照Ｎｉｕ等[１１]的方法ꎬ将噬菌体浓缩液(１ˑ１０９ＰＦＵ/ｍＬ)连续１０倍稀释ꎬ吸取每浓度噬菌体稀释液１００μＬ加入９６孔板中ꎬ每孔加入１００μＬ宿主菌(１０６ＣＦＵ/ｍＬ)混合均匀ꎬ每个浓度设３次重复ꎬ以细菌组为对照ꎮ３７ħ孵育１８~２０ｈꎬ并使用动态酶标仪每小时动态读取ＯＤ６００值ꎬ绘制曲线ꎮ
１.２.７㊀噬菌体的裂解谱测定㊀将除宿主菌外的１５株大肠杆菌和３９株金黄色葡萄球菌活化ꎬ培养至对数生长期ꎬ各取１００μＬ菌液制双层平板ꎬ使用点板的方法ꎬ取噬菌体液５~１０μＬ滴加到平板表面ꎮ３７ħ过夜培养ꎬ次日观察噬菌斑的形成情况ꎮ
１.２.８㊀噬菌体的抗逆性测定㊀热稳定性:将初始浓度为１０９ＰＦＵ/ｍＬ的噬菌体液分装到２ｍＬ的ＥＰ管中ꎬ分别置于－２０㊁４㊁２５㊁３７㊁４６㊁５４㊁６０㊁７０㊁９０ħ温度中处理１ｈꎮ以处理前噬菌体液为阴性对照ꎮ处理后的噬菌体液通过双层平板法测定效价ꎮ每处理组设３个重复ꎮ
紫外线稳定性:将初始浓度为１０９ＰＦＵ/ｍＬ的噬菌体液ꎬ分装到２ｍＬ的ＥＰ管中ꎮ分别在紫外线下照射１０㊁２０㊁３０ｍｉｎꎬ以未照射处理组为阴性对照ꎬ双层平板法测定效价ꎮ每处理组设３个重复ꎮ
ｐＨ稳定性:用Ｈ２ＳＯ４和ＮａＯＨ调节ＳＭ缓冲液至ｐＨ值为３㊁５㊁６㊁７㊁８㊁１１㊁１３ꎮ将噬菌体液(１０９ＰＦＵ/ｍＬ)分别与不同ｐＨ缓冲液等体积混合作为不同试验组ꎬ与ＳＭ缓冲液原液等体积混合作为阴性对照组ꎬ３７ħ静置孵育１ｈ后ꎬ采用双层平板法测定处理后噬菌体的效价ꎮ每处理组设３个重复ꎮ
１.２.９㊀噬菌体全基因组的测序与分析㊀利用噬菌体基因组ＤＮＡ提取试剂盒获得噬菌体ＤＮＡꎬ委托上海派森诺生物科技有限公司完成基因组测序ꎮ参照ＨＨＭＩＳＥＡ－ＰＨＡＧＥＳ噬菌体基因组学指南对噬菌体的基因组进行建库㊁测序㊁组装和基因注释(ｈｔｔｐｓ://ｓｅａｐｈａｇｅｓｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ.ｈｅｌｐｄｏｃｓｏｎｌｉｎｅ.ｃｏｍ/ｈｏｍｅ)ꎮ采用ＩｌｌｕｍｉｎａＴｒｕＳｅｑＮａｎｏＤＮＡＳａｍｐｌｅＰｒｅｐＫｉｔ方法构建文库ꎮ使用ＡＢｙＳＳ(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｂｃｇｓｃ.ｃａ/ｐｌａｔｆｏｒｍ/ｂｉｏｉｎｆｏ/ｓｏｆｔｗａｒｅ/ａｂｙｓｓ)拼接软件对优化序列进行多个Ｋｍｅｒ参数的拼接ꎬ得到最优组装结果ꎮ把ｒｅａｄｓ比对到组装好的基因组序列上ꎬ统计组装序列的ＧＣ含量和ｒｅａｄｓ覆盖深度ꎮ运用ＧａｐＣｌｏｓｅｒ(ｈｔｔｐｓ://ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ.ｎｅｔ/ｐｒｏｊｅｃｔｓ/ｓｏａｐｄｅｎｏｖｏ２/ｆｉｌｅｓ/Ｇａｐ￣Ｃｌｏｓｅｒ/)软件对组装结果进行局部内洞填充和碱基校正ꎮ使用ＧｅｎｅＭａｒｋＳ软件对测序的基因组进行编码基因预测ꎮ采用Ｒｃｉｒｃｌｉｚｅ包绘制基因组圈图ꎮ通过ＢＬＡＳＴ(ｂａｓｉｃｌｏｃａｌａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｅａｒｃｈｔｏｏｌ)与ＮＣＢＩ中已有的３３株金黄色葡萄球菌噬菌体进行基因组比较分析ꎮ
１.３㊀数据统计与分析
使用ＧｒａｐｈＰａｄ６软件进行单因素方差分析(Ｏｎｅ－ＷａｙＡＮＯＶＡ)ꎬ对试验数据进行多重比较ꎬＰ<０.０５表示差异显著ꎮ
２㊀结果与分析
２.１㊀噬菌体的分离
通过双层平板法从牛场污水混样中分离得到一株金黄色葡萄球菌噬菌体ꎬ命名为ＳＰ６８８ꎮ可见在含有宿主菌的双层平板上形成较大噬菌斑ꎬ边缘整齐无晕环ꎬ形态均一ꎬ清晰透亮ꎬ平均直径大小２.５ｍｍ(图
１)ꎮ
图１㊀双层平板上噬菌体ＳＰ６８８形成的噬菌斑２.２㊀噬菌体效价测定
将纯化后的噬菌体连续１０倍梯度稀释ꎬ通过双层平板法计算各浓度梯度噬菌斑个数ꎮ经多次平行试验后ꎬ得出ＳＰ６８８噬菌体效价为２.７５ˑ１０１０ＰＦＵ/ｍＬꎮ
４３１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀
２.３㊀噬菌体电镜形态观察
在透射电镜下观察ＳＰ６８８噬菌体的形态(图２)发现ꎬ其头部呈多面体结构ꎬ具不收缩的长尾ꎬ尾端有明显的纤突结构ꎻ总长４１３.４０ｎｍꎬ头部的长度和宽度分别为１０２.１ｎｍ和５９.５１ｎｍꎬ尾巴的长度为２９１.５２ｎｍꎬ爪子的宽度和长度分别为３３.０８ｎｍ和１９.７８ｎｍꎮ
图２㊀噬菌体ＳＰ６８８透射电镜下的形态２.４㊀最佳感染复数测定
将不同浓度的噬菌体稀释液与宿主菌共同培养后ꎬ通过对微孔浊度的观察ꎬ发现在ＭＯＩ为１时ꎬ微孔内液体澄清透亮ꎬ无弥散状浑浊ꎮ同时测定ＯＤ６００数值ꎬ在ＭＯＩ为１时ꎬ与细菌组比较差异显著ꎮ结合两方法结果ꎬＳＰ６８８最佳感染复数为１(图３)ꎮ
∗∗㊁∗∗∗分别表示在０.０１㊁０.００１水平上与
细菌组差异显著ꎮ
图３㊀噬菌体ＳＰ６８８最佳感染复数结果２.５㊀噬菌体裂解动力学
将不同浓度噬菌体与宿主菌共同培养ꎬ通过动态酶标仪每小时记录ＯＤ６００值ꎬ绘制噬菌体的裂解动力学曲线(图４)ꎮ结果显示ꎬＳＰ６８８噬菌体可一定程度抑制细菌的生长速度ꎬ减少细菌数ꎬ高浓度噬菌体在１０ｈ内能完全抑制细菌的生长
ꎮ
图４㊀ＳＰ６８８噬菌体的裂解动力学测定结果２.６㊀噬菌体的裂解谱测定
通过双层平板法测定噬菌体对５４株临床分离细菌的裂解作用ꎬ得到噬菌体裂解谱(表１)ꎮ噬菌体ＳＰ６８８裂解谱范围较宽ꎬ可裂解９株金黄色葡萄球菌ꎬ其中７株对氨苄西林有耐药性ꎮ宿主特异性较强ꎬ对大肠杆菌无裂解作用ꎮ
表１㊀噬菌体ＳＰ６８８对５４株临床分离细菌的裂解谱
菌株裂解结果菌株来源菌株裂解结果菌株来源Ｓ.ａｕｒｅｕｓ１６０＋乳样分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓ６.１８－乳样分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓ１１１＋乳样分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓ１１３－乳样分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓ６８８＋乳样分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓ１２５－乳样分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓ１０７＋乳样分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓ１４７－乳样分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓ２１８ａ＋乳样分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓ１８２－乳样分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓ６８３＋乳样分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓ８５－乳样分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓ６５９＋乳样分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓ８４－乳样分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓＪＳ－１＋乳样分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓ１５－乳样分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓＪＳ－２＋乳样分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓ６８１－乳样分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓ２２２－乳样分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓ３９４－乳样分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓ６０－乳样分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓ１３１－乳样分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓ１２４－乳样分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓ１７７－乳样分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓ１４８－乳样分离Ｅ.ｃｏｌｉ１１－乳样分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓ５７２－乳样分离Ｅ.ｃｏｌｉ１２－环境分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓ６８６－乳样分离Ｅ.ｃｏｌｉ１４－环境分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓ１８０－乳样分离Ｅｔｅｃ－１－乳样分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓ２３－乳样分离Ｅｔｅｃ－２－乳样分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓ６７９－乳样分离Ｅ.ｃｏｌｉ１２１２－乳样分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓ６８７－乳样分离Ｅ.ｃｏｌｉ１－环境分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓ４７７－乳样分离Ｅ.ｃｏｌｉ２－环境分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓ６８５－乳样分离Ｅ.ｃｏｌｉ５－环境分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓ６.３０－乳样分离Ｅ.ｃｏｌｉ６－乳样分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓ２２８－乳样分离Ｅ.ｃｏｌｉ９－乳样分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓ５７３－乳样分离Ｅ.ｃｏｌｉ１２１０－１－环境分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓＧＳ－ＪＹ－乳样分离Ｅ.ｃｏｌｉ１２１０－３－乳样分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓ１３３－乳样分离Ｅ.ｃｏｌｉ１２１０－５－环境分离Ｓ.ａｕｒｅｕｓＢ１１－乳样分离Ｅ.ｃｏｌｉ１２１０－６－环境分离㊀㊀注:＋表示可裂解ꎬ－表示不可裂解ꎮ
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㊀第３期㊀张雪丽ꎬ等:一株裂解耐氨苄西林金黄色葡萄球菌的噬菌体及其生物学特性与全基因组分析
２.７㊀噬菌体的抗逆性
２.７.１㊀温度稳定性㊀将在不同温度孵育过的噬菌体通过双层平板法测定效价ꎬ结果(图５)显示ꎬ在－２０ħ至４６ħ时ꎬ噬菌体活性受到影响较小ꎬ效价变化不大ꎮ温度达到５４ħ时ꎬ噬菌体开始急剧失活ꎬ效价急剧下降ꎬ６０ħ时完全失活ꎮ表明噬菌体对低温有一定的耐受性(小于３７ħ)ꎬ对高温耐受性弱ꎬ超过５４ħ噬菌体开始逐渐失去活性
ꎮ
∗∗㊁∗∗∗分别表示与对照组在０.０１㊁０.００１水平上差异显著ꎬ下同ꎮ
图５㊀温度对噬菌体ＳＰ６８８效价的影响
２.７.２㊀噬菌体的紫外线稳定性㊀将在紫外线下照射不同时间的噬菌体通过双层平板法测定效价ꎬ结果(图６)显示ꎬＳＰ６８８噬菌体对紫外线的耐受力较弱ꎬ照射１０ｍｉｎ时ꎬ效价下降４０％左右ꎬ照射３０ｍｉｎ后完全失活ꎮ
２.７.３㊀噬菌体的ｐＨ稳定性㊀将在不同ｐＨ缓冲液中孵育的噬菌体通过双层平板法测定效价ꎬ结果(图７)显示ꎬ噬菌体ＳＰ６８８对酸碱耐受范围较大ꎬ对酸㊁碱均有一定的耐受力ꎬ但对强碱的耐受程度不如强酸ꎮｐＨ值为７.４时ꎬ噬菌体活性最强ꎻ
当ｐＨ值为３.０㊁５.０㊁６.０㊁８.５㊁１１.０时ꎬ对噬菌体活性影响不大ꎬ效价降低２０％左右ꎻ当ｐＨ值为１３.０时ꎬ效价降低６０％ꎮ
２.８㊀噬菌体基因组测序
为了解噬菌体ＳＰ６８８的基因组特征ꎬ对其进行了Ｉｌｌｕｍｉｎａ全基因组序列测定ꎬ获得有效数据８９１.８Ｍｂꎮ组装后结果显示ꎬ噬菌体基因组为环状ＤＮＡ(图８Ａ)ꎬ全长为４５４９９ｋｂꎬＧＣ总含量为３４.１％(图８Ｂ)ꎮＧｅｎｅＭａｒｋＳ软件预测噬菌体ＳＰ６８８
图６㊀紫外线对噬菌体ＳＰ６８８
效价的影响
图７㊀ｐＨ值对噬菌体ＳＰ６８８
效价的影响
图８㊀噬菌体ＳＰ６８８基因组圈图(Ａ)及ＧＣ含量图(Ｂ)
６３１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀
基因组含６４个开放阅读框(ＯＲＦｓ)ꎬ其中１９个(２９.６９％)具有特定功能ꎬ可将它们分为以下几个模块:(１)噬菌体结构组成相关蛋白:衣壳成熟相关蛋白(００４)㊁主要衣壳蛋白(００５)㊁主要尾蛋白(０１０)㊁主要尾蛋白(０１１)㊁尾标尺蛋白(０１４)㊁尾家族蛋白(０１５)ꎻ(２)复制和代谢相关蛋白:调节蛋白(０３２)㊁核酸结合蛋白(０４２)㊁ＤＮＡ聚合酶Ａ结构域(０４３)㊁ｄＵＴＰ酶(０５３)㊁转录激活因子(０５８)㊁病毒型复制修复核酸酶结构域(０６１)㊁ＳＮＦ２＿Ｎ家族超家族ⅡＤＮＡ/ＲＮＡ解旋酶(０６２)㊁ＨＮＨ核酸内切酶(０６４)ꎻ(３)噬菌体包装相关蛋白:末端酶小亚单位(００１)㊁末端酶大亚单位(００２)ꎻ(４)杀菌抑菌相关蛋白:穿孔素(０２３)㊁含ＣＨＡＰ结构域蛋白(０２４)㊁整合酶(０２５)㊁毒素－抗
毒素系统蛋白(０２９)ꎮ根据噬菌体基因组的注释和分类ꎬ表明其具有自我复制㊁组装和宿主裂解所需的所有核心基因ꎮ
根据Ｏｌｉｖｅｉｒａ等[１２]对噬菌体裂解酶的描述ꎬ将金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶分为４种不同类型:第一类由单基因编码ꎻ第二类含有Ⅰ组内含子ꎻ第三类由两段相邻基因共同编码ꎻ第四类含裂解酶间二级翻译起始位点的单基因ꎮ经分析ꎬＳＰ６８８噬菌体的裂解酶含ＡＭＩ－３ꎬＡｍｉｄａｓｅ＿３ｄｏ￣ｍａｉｎ(ＰＦ０１５２０/ＩＰＲ００２５０８)ꎻＳＨ３－５ꎬＳＨ３＿５ｄｏ￣ｍａｉｎ(ＰＦ０８４６０/ＩＰＲ０１３６６７)两段结构域ꎬ属第三类噬菌体裂解酶(图９Ａ)ꎬ与ＳＰＰ１相似度最高
(图
９Ｂ)ꎮ
图９㊀噬菌体ＳＰ６８８(Ａ)和ＳＰＰ１(Ｂ)裂解酶
３㊀讨论与结论
β－内酰胺类药物曾经被认为是治疗金黄色
葡萄球菌的有效抗生素[１３]ꎬ但近年来由于滥用导致其耐药菌株分离率越来越高ꎬ严重威胁奶牛健康ꎬ临床防治迫切需要噬菌体等新的抗菌手段ꎮ本研究以临床分离到的奶牛源耐氨苄西林金黄葡萄球菌为宿主菌ꎬ分离得到一株裂解性噬菌体ꎬ命名为ＳＰ６８８ꎮ噬菌体ＳＰ６８８能在含有其宿主菌的双层平板上形成边缘整齐㊁透亮㊁无晕环的噬菌斑ꎬ符合裂解性噬菌体的特征[１４]ꎮ透射电镜观察发现ꎬＳＰ６８８具有长而不收缩的尾巴ꎬ末端有一个膨大的纤突ꎬ符合长尾科噬菌体的特征[１５－１６]ꎮ与王一凡等[１７]分离到的短尾金黄色葡萄球菌噬菌体Ｐ４２相比ꎬＳＰ６８８效价更高ꎬ能达到１０１０ＰＦＵ/ｍＬ以上ꎬ且裂解谱较广ꎬ对７株不同的耐氨苄西林金黄色葡萄球菌均有裂解能力ꎮ最佳感染复数为
１ꎬ该指标的确定有利于快速收获高滴度噬菌体悬液[１８]ꎮ分析其裂解动力学曲线发现ꎬ该噬菌体可以一定程度抑制和减少细菌的生长速度和数量ꎬ且浓度较高时可在１０ｈ内完全抑制细菌的生长ꎮ在自然环境中ꎬ噬菌体对环境压力的耐受性决定其侵染宿主的能力ꎬ良好的环境压力耐受性是噬菌体作为新型生物抑菌制剂的前提[１９]ꎮ噬菌体ＳＰ６８８对温度耐受范围较宽ꎬ在－２０~４６ħ均具有良好的活性ꎬｐＨ值３~１１范围内活性良好ꎮ与葛志毅等[２０]分离到的噬菌体相比ꎬＳＰ６８８的耐热能力和耐酸碱能力更强ꎬ具备作为环境消毒剂的应用潜力ꎮ健康奶牛的乳腺环境ｐＨ值一般在
６.４~６.６之间ꎬ患乳腺炎时会升高至７.２左右[２１]ꎻ体温正常范围在３７.５~３９.５ħ[２２]ꎮ基于ＳＰ６８８良好的抗性ꎬ将其作为乳腺注入剂的应用过程中ꎬ也可保持稳定的活性ꎬ且不会在食品中残留ꎬ对人类健康和公共卫生具有良好意义ꎮ
全基因组分析是了解噬菌体最重要的手段ꎮ在基因水平上分析噬菌体的安全性是研究噬菌体的重要前提ꎬ是解析其结构和功能的基础[２３]ꎮ本研究中ꎬ噬菌体ＳＰ６８８全基因组测序结果显示ꎬ其基因组为环状ＤＮＡꎬ全长４５４９９ｋｂꎬ包含６４个ＯＲＦｓꎬ其中已知基因功能的编码序列(ＣＤｓ)有１９个(２９.６９％)ꎮ通过基因组的注释和分类ꎬ该噬菌体具有ＤＮＡ代谢㊁病毒粒子组装和裂解宿主所需的所有核心基因ꎮ穿孔素(０２３)㊁含ＣＨＡＰ结构域蛋白(０２４)是噬菌体ＳＰ６８８基因组中被注释到７
３１㊀第３期㊀张雪丽ꎬ等:一株裂解耐氨苄西林金黄色葡萄球菌的噬菌体及其生物学特性与全基因组分析
的与裂解相关的基因ꎬ是裂解酶ＬｙｓＧＨ１５起催化作用的关键活性片段[２４]ꎬ该裂解酶对金黄色葡萄球菌表现出广谱高效的抗菌活性ꎮ一般来说ꎬ噬菌体大多采用穿孔素－裂解酶(ｈｏｌｉｎ－ｌｙｓｉｎ)系统来裂解细菌[２５]ꎮ穿孔素是一种可插入细胞质膜并在膜上形成小孔的疏水性小蛋白质ꎬ与细菌内溶素(或裂解酶)协作ꎬ在噬菌体繁殖周期的最后阶段降解细菌细胞壁的肽聚糖ꎬ通过使细菌内部细胞质的渗透压失衡导致细菌溶解ꎬ同时释放子代噬菌体[２６]ꎮ噬菌体ＳＰ６８８裂解酶由该两段相邻基因共同编码ꎬ表现出良好的裂解活性ꎬ在未来的应用研究中ꎬ不仅可以直接应用噬菌体ＳＰ６８８来进行疾病治疗ꎬ还可以通过蛋白表达手段制备裂解酶来抑制细菌的生长繁殖ꎮ
综上ꎬ本研究分离并鉴定了一株新的可裂解耐氨苄西林金黄色葡萄球菌的噬菌体ＳＰ６８８ꎬ其裂解谱广ꎬ裂解能力强ꎬ具有较好的环境耐受性ꎮ研究结果可为进一步开发噬菌体制剂提供数据支持ꎬ为使用噬菌体制剂防控细菌病提供新的参考ꎮ参㊀考㊀文㊀献:
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