【CN109971676A】一种高产异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌的选育方法及应用【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910223068.9
(22)申请日 2019.03.22
(83)生物保藏信息
CCTCC NO：M 2019118 2019.03.01
(71)申请人 三峡大学
地址 443002 湖北省宜昌市西陵区大学路8
号
(72)发明人 龚大春　孔帅　吕育财　郑美娟　
(74)专利代理机构 宜昌市三峡专利事务所
42103
代理人 成钢
(51)Int.Cl.
C12N 1/20(2006.01)
C12N 13/00(2006.01)
C12R 1/15(2006.01)
(54)发明名称
一种高产异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌的选
育方法及应用
(57)摘要
本发明提供了一种快速高通量选育高产异
亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌
（Corynebacteriumglutamicum B1）
及应用方法，以谷氨酸棒杆菌为对象，在30-37℃，100-200 r/
min的摇床中培养一定时间后，经过常温常压等
离子体（ARTP）诱变处理50-180 s后，接种到
0.05-0.4 mg/mL浓度的磺胺胍培养基中30-37℃
培养1-2天，经过培养后，利用氨基酸与茚三酮的
特异性反应与相对应的菌株发酵上清液进行96
孔板高通量筛选，可选育出高产菌株
Corynebacteriumglutamicum B1。

该菌株在100mL
摇瓶发酵30-48 h的条件下异亮氨酸产量较原始
菌株提高了62.03%，且遗传性状稳定。

该方法建
立了磺胺胍标记初筛和茚三酮多孔板检测的高
通量筛选策略，可以广泛应用于高产异亮氨酸的
谷氨酸棒状杆菌高通量选育，提高筛选效率，具
有巨大的应用价值。

权利要求书1页 说明书5页 附图2页CN 109971676 A 2019.07.05
C N 109971676
A
权　利　要　求　书1/1页CN 109971676 A
1.一种高产异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌，谷氨酸棒杆菌 B1，保藏编号：CCTCC NO：M 2019118 ，分类命名Corynebacteriumglutamicum B1，保藏日期：2019年3月16号，湖北，武汉。

2.一种权利要求1所述的高产异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌的选育方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）以谷氨酸棒杆菌为对象，在30-37℃，100-200 r/min的摇床中培养一段时间，再经过常温常压等离子体诱变处理30-180 s；
（2）待诱变处理后接种到磺胺胍培养基中，在30-37 ℃培养1-2天；
（3）将步骤（2）得到的菌株利用茚三酮进行特异性显色反应后识别出优势菌株，将该优势菌株在种子培养基中培养后，再在发酵培养基中培养，进行氨基酸分析检测复筛后，筛选得到产量最高的菌株，即高产异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌Corynebacteriumglutamicum B1。

3.根据权利要求2所述的高产异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌的选育方法，其特征在于，常温常压等离子体诱变的辐射功率为100-120 W，氦气流量为3-10 L/min，诱变时间为120-150s。

4.根据权利要求2所述的高产异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌选育方法，其特征在于，磺胺胍培养基中含有0.05-0.4 mg/mL的磺胺胍。

5.根据权利要求2所述的高产异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌选育方法，其特征在于，步骤（3）中菌株与茚三酮采用多孔板进行特异性显色反应，多孔板包括48-96孔板。

6.根据权利要求5所述的高产异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌选育方法，其特征在于，将多孔板的优势菌株先在种子培养基中，在30-37 ℃、100-200 r/min下培养1-2天；再以5-10%的接种量接种至发酵培养基中，再在30-37 ℃、100-200 r/min下培养1-2天，进行氨基酸分析检测复筛后，可以得到性能稳定的高产菌株Corynebacteriumglutamicum B1。

7.根据权利要求6所述的高产异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌选育方法，其特征在于，所用的种子液培养基g/L包括：葡萄糖5-10g/L，蛋白胨1-5g/L，氯化钠1-5g/L，牛肉浸粉1-3g/L，磷酸氢二钠0.03-1g/L；
发酵培养基g/L包括：葡萄糖5-10g/L，蛋白胨2-7g/L，氯化钠1-5g/L，牛肉浸粉1-3g/L，磷酸氢二钠0.3-1g/L，酵母浸粉1-5g/L，硫酸铵1-6g/L。

2。