H9亚型禽流感病毒黏膜DNA疫苗与灭活油乳苗的联合免疫研究
H9N2亚型禽流感病毒分离鉴定及免疫试验
H9N2亚型禽流感病毒分离鉴定及免疫试验作者：许佳敏边海霞来源：《中国动物保健》2021年第01期摘要：为了更好防控H9N2亚型禽流感，且做到科学免疫，免疫减负。
本研究采集疑似感染低致病禽流感鸡群病料，将其无菌处理后接种SPF鸡胚后进行病毒分离，通过分子生物学试验对其进行病原学鉴定。
结果显示：分离鉴定出一株H9亚型禽流感病毒（AIV）；血凝试验（HA）效价在10～11，该病毒属于欧亚分支的BJ亚分支。
将病毒纯化后，制备灭活疫苗免疫SPF鸡，免疫后14d对其进行HI检测，结果显示其效价到达峰值为10Log2，免疫后28～35d其平均效价在9.6Log2，至免疫后12周平均效价在7Log2。
结果说明本研究分离的病毒制备成疫苗后具有较好的免疫效果，可以作为疫苗候选株。
关键词：H9N2亚型禽流感毒株，免疫，疫苗禽流感是禽流行性感冒（avian Influenza，AI）的简称，是由正粘病毒科（orthomyxoviridae）、流感病毒属（influenza virus）、A型流感病毒（influenza A virus）引起的禽类疾病[1]。
国际兽医局（OIE）将禽流感列为A类动物疫病，我国也将其定为一类动物传染病。
H9N2禽流感病毒是低致病性亚型，在世界各地家禽群中流行。
目前，H9N2引起的禽流感在我国呈地方流行，虽然死亡率低，但感染蛋鸡出现鸡输卵管功能异常，产褪色蛋、畸形蛋、砂皮蛋、软壳蛋，鸡群产蛋率下降30%～80%，病程持续时间长的可达月余，造成严重的经济损失[2]。
该疾病可通过免疫疫苗进行抵御但是由于低致病禽流感变异速度快，不同血清型之间交叉保护有限；所以筛选、免疫对型疫苗对养殖业具有重要意义[3]。
本研究通过分子病原学及血清学分离鉴定一株H9N2流行毒株，并进行动物试验，为进一步筛选疫苗提供理论依据。
1材料与方法1.1材料1.1.1病料来源疑似发病鸡病料，采集自宁夏平罗县某商品蛋鸡养殖场。
禽流感(H9亚型)油乳剂灭活苗的研制
１ 疫 苗 安 全 性检 验 ． ５
动物实 验 。取 ６只 ４ ６ 龄鸡 ， 颈部皮下 接种 ～周 在 ０ ． ２毫升 制备 的油乳 剂灭 活 苗 ， 观察 ２ 天 ， 查 接种 １ 检 疫 苗 和鸡 的局 部及全 身反应 。
灭活 效果 检 查 。取 １ ０日龄 Ｓ Ｆ鸡 ６只 ， 只注 Ｐ 每
一
（ 石蜡 油 ） 吐 温 一 ０ 乳 化 剂 ， 要 为 聚 氧 已 稀失 和 ８（ 主
水 山梨醇脂 肪 酸脂 ） 。按 常规 方法 乳化 ， 成油 包水 制
型油乳 剂灭 活 疫苗 ， ４ ８Ｃ 置 ～ ￣保存 。
不 同接毒 量 对鸡 胚血 凝 活 性 的影 响 。为 了测 定 不 同接 毒量 对鸡 胚 繁殖病 毒 的影 响 ， 择 １ 、０３ 选 ０ １ － 、 ２ １ 一 １ 一 １ ｘ ０ 、０ 、 ０ ５个 滴度 。每胚接 种 ０２毫升 ， ． 收取接 毒 后 ４ ～ ６小时 死胚 的尿囊 液 ，测 定 红 细胞 凝集 效 ８９ 价 。另外 ， 以种 毒 １ ４ 释 液 ， 每 胚 ０１ 升 和 ０２ ０稀 按 ．毫 ． 毫升 ， 接 种 ５ 各 ０枚 鸡胚 ， 取 接 毒 后 ４ ～ ６小 时 死 收 ８９ 胚 的尿囊 液 ， 以红 细胞凝 集试验 测定 血凝 效价 。 接 毒孵 育 后 死 胚 和 活胚 的血 凝 价测 定 。 以 １ － ０３ 稀 释 的种 毒 ， 每胚 接 种 ０２毫 升 ， ． 收集 接 毒 后 ４ ６ ８ ９
一
１ 材 料 与 方 法
１ 制 备 用 种 毒 ． １
由哈兽研 提供 Ｈ ９亚型 低病 毒株 ， 毒 栋 的红 细 该
胞凝 集 试 验滴 度 为 １ ３ ０ １ ８ ， Ｉ ∞为 １－ ：２ ～ ０ Ｅ Ｄ ２ ０ 属 于 ８
新城疫与禽流感(H9亚型)二联油乳剂灭活苗免疫效力试验
关键 词 ： 新城 疫 ； 禽流 感 ； 油乳 荆灭 活 苗； ； 疫保护 力 ＨＩ免
Ｅｘ ｅ ｉ ｅ ｔ ｌ Ｔｅ ｔ ｆ Ｅｆ ｃｅ ｃ ｆ ａ ｉ ｅ ｕ ｓｏ ｎ ｒ ｃ ｉｅ ｏ ｐ ｒｍ ｎ ａ ｓｓ ｏ ｆ ｉｎ ｙ ｏ ｎ ｏｌ ｍ ｌｉｎ Ｂｉａ ｙ Ｖａ ｃｎ ｆ ｉ
ｔｅｅ ｎ １ ｅ ｋ ｆ ｒｉｏ ｕｍｅ Ｔ ｅ ｋ ａｅ ｈ ｉ ｍ ｆ Ｈ１ ｅｅ ｒａｈ ｄ ｏ ｅ １ｇ ｌ ｒａｓ ｏ ｈ ｅｔ Ｔ ｅ ｉ ｒｄ ｉ ｗ ｅ ａｔ ｎ ｃ ｌ ｄ ｔ ｅ ｗｏ ｗ ｅ ｓ ｌｔｒｔｅ ｔｅ ｏ ｗ ｒ ｅｃ ｅ ｖ ｒ ６ｏ ２ ａｌ ｉｌ ｔｅ ｔｓ． ｈ ｔ ｔ ｆ 由 ｓ ｆ ＨＩ ｅ ｃ ｅ ｔｅｒ ｅ ｋ ３ ｅ ｋ ａｔｒ ｎ ｃ ｌｔｄ ｎ ｍａｎａｎ ｄ ｖ ｒ４ ｄ ｙ ． Ｔ ｅ ｅ ｕ ｓ ｓ ｏ ｄ ｔａ ｈ ｒ ｏ ｒａ ｈ ｄ ｈ ｉ ｐ ａ ｓ ｗ ｅ ｓ ｆ ｉｏ ｕａ ａ ｄ ｅ ｅ ｉｔｉｅ ｏ ｅ ５ ａ ｓ ｈ ｒｓ ｈ ｈ ｗｅ ｈ ｔ ｔｅ ｐｏｅ ｔ ｎ ｒｔ ｏ ｈ ｎ ｖ ｅ ｔ ｎ ｉａｙ ａ ｃｎ ｅｅ ａｌ ０ ％ ． Ｗ ｈ ｎ ｔｅ ｃ ｉｋ ｎ ｗｅｅ ｃ ａ ｅ ｇ ｄ ６ ｄ ｙ ｆ ｒ ｒｔｃ ｏ ａｅ ｆｔｅ ｍｏ ｏ ｏ ｎ ａ ｄ ｂｎ ｒ ｖｃ ｉｅ ｗ ｒ ｌ ｉ ｌ １０ ｅ ｈ ｈｃ ｅ ｒ ｈ ｌ ｎ ｅ ５ ａ ｓ ａ ｅ ｌ ｔ
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H9_亚型禽流感广谱亚单位疫苗抗原设计及其免疫效力
江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２３ꎬ３９(９):１９０１￣１９０７ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ张雪花ꎬ王卫华ꎬ武㊀奇ꎬ等.Ｈ９亚型禽流感广谱亚单位疫苗抗原设计及其免疫效力[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２３ꎬ３９(９):１９０１￣１９０７.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２３.０９.０１２Ｈ９亚型禽流感广谱亚单位疫苗抗原设计及其免疫效力张雪花１ꎬ２ꎬ㊀王卫华１ꎬ３ꎬ㊀武㊀奇１ꎬ２ꎬ㊀李㊀丁１ꎬ２ꎬ㊀平继辉３ꎬ㊀梅㊀梅１ꎬ２(１.江苏省农业科学院动物免疫工程研究所/国家兽用生物制品工程技术研究中心/江苏省食品质量与安全重点实验室ꎬ江苏南京２１００１４ꎻ２.兽用生物制品<泰州>国泰技术创新中心ꎬ江苏泰州２２５３００ꎻ３.南京农业大学动物医学院ꎬ江苏南京２１００９５)收稿日期:２０２３￣０３￣２３基金项目:江苏省农业科技自主创新基金项目[ＣＸ(２２)３０３１]作者简介:张雪花(１９８２－)ꎬ女ꎬ山东郓城人ꎬ硕士ꎬ助理研究员ꎬ主要从事动物免疫学及兽用生物制品研究ꎮ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｚｈａｎｇｘ￣ｕｅｈｕａ１２１３＠１６３.ｃｏｍ通讯作者:梅㊀梅ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｊａｃｑｕｉ１８＠１６３.ｃｏｍ㊀㊀摘要:㊀Ｈ９Ｎ２亚型禽流感病毒(ＡＩＶ)变异快㊁传染性强ꎬ由病毒流行株制备而成的灭活疫苗达不到完全保护的效果ꎬ导致Ｈ９Ｎ２亚型禽流感时有发生ꎮ为研发具有广谱保护性的Ｈ９亚型禽流感疫苗ꎬ本研究利用生物信息技术ꎬ对Ｈ９亚型ＡＩＶＨＡ基因序列进行分析ꎬ设计获得ＨＡ基因序列ꎮ将ＨＡ基因构建于杆状病毒表达系统ꎬ表达的重组ＨＡ蛋白血凝效价为１ˑ２１２ꎬ与不同分支Ｈ９亚型ＡＩＶ阳性血清具有良好的交叉反应活性ꎮ将重组蛋白制备成疫苗(ｒＨＡ疫苗)免疫１０日龄雏鸡ꎬ免疫后２８ｄ将不同亚分支的Ｈ９亚型ＡＩＶ流行毒株１１５和ＹＺ株分别以１ˑ１０６ＥＩＤ５０(半数鸡胚感染量)感染试验鸡ꎬｒＨＡ疫苗组交叉保护效力明显优于商品苗组ꎮ本研究结果表明Ｈ９亚型禽流感广谱型亚单位疫苗具有较好的应用前景ꎬ可以用于防控Ｈ９ＡＩＶ感染ꎮ关键词:㊀Ｈ９亚型禽流感ꎻＨＡ基因ꎻ杆状病毒表达系统ꎻ广谱亚单位疫苗ꎻ免疫中图分类号:㊀Ｓ８５２.６５㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２３)０９￣１９０１￣０７ＡｎｔｉｇｅｎｄｅｓｉｇｎａｎｄｉｍｍｕｎｅｅｆｆｉｃａｃｙｏｆａｕｎｉｖｅｒｓａｌｓｕｂｕｎｉｔｖａｃｃｉｎｅａｇａｉｎｓｔＨ９ｓｕｂｔｙｐｅａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａＺＨＡＮＧＸｕｅ￣ｈｕａ１ꎬ２ꎬ㊀ＷＡＮＧＷｅｉ￣ｈｕａ１ꎬ３ꎬ㊀ＷＵＱｉ１ꎬ２ꎬ㊀ＬＩＤｉｎｇ１ꎬ２ꎬ㊀ＰＩＮＧＪｉ￣ｈｕｉ３ꎬ㊀ＭＥＩＭｅｉ１ꎬ２(１.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ＆ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬＪｉａｎｇｓｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ/ＮａｔｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｏｆＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ/ＪｉａｎｇｓｕＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＦｏｏｄＱｕａｌｉｔｙａｎｄＳａｆｅｔｙꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００１４ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＧｕｏＴａｉ(Ｔａｉｚｈｏｕ)ＣｅｎｔｅｒｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｎｏ￣ｖａｔｉｏｎｆｏｒＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓꎬＴａｉｚｈｏｕ２２５３００ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００９５ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀ＴｈｅＨ９Ｎ２ｓｕｂｔｙｐｅａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ(ＡＩＶ)ｅｖｏｌｖｅｄｒａｐｉｄｌｙｗｉｔｈｅｎｈａｎｃｅｄｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙꎬａｎｄｔｈｅｉｎａｃ￣ｔｉｖａｔｅｄｖａｃｃｉｎｅｐｒｅｐａｒｅｄｆｒｏｍｔｈｅｅｐｉｄｅｍｉｃｓｔｒａｉｎｃｏｕｌｄｎｏｔｐｒｏｖｉｄｅｃｏｍｐｌｅｔｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔꎬｗｈｉｃｈｌｅｄｔｏＨ９Ｎ２ＡＩＶｅｐｉ￣ｄｅｍｉｃｓｏｃｃｕｒｒｉｎｇｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ.Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｄｅｖｅｌｏｐａｂｒｏａｄ￣ｓｐｅｃｔｒｕｍｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｖａｃｃｉｎｅａｇａｉｎｓｔＨ９ＡＩＶꎬｔｈｅＨＡｇｅｎｅｓｅ￣ｑｕｅｎｃｅｓｏｆＨ９ＡＩＶｅｐｉｄｅｍｉｃｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬａｎｄＨＡｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓｏｂ￣ｔａｉｎｅｄ.ＴｈｅＨＡｇｅｎｅｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍꎬａｎｄｔｈｅｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎｔｉｔｅｒｏｆｒＨＡｐｒｏｔｅｉｎｗａｓ１ˑ２１２.ＴｈｅｒＨＡｓｈｏｗｅｄｇｏｏｄｃｒｏｓｓ￣ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙｗｉｔｈｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｓｅｒａｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｂｒａｎｃｈｅｓｏｆＨ９ＡＩＶ.Ｔｅｎ￣ｄａｙ￣ｏｌｄｃｈｉｃｋ￣ｅｎｓｗｅｒｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄｗｉｔｈｒＨＡｐｒｏｔｅｉｎ.Ａｆｔｅｒ２８ｄａｙｓｏｆｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎꎬｔｅｓｔｉｎｇｃｈｉｃｋｅｎｓｗｅｒｅｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈ１ˑ１０６ＥＩＤ５０ｏｆＨ９ｓｕｂｔｙｐｅＡＩＶｓｔｒａｉｎ１１５ａｎｄｓｔｒａｉｎＹＺꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.ＴｈｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｉｃａｃｙｏｆｒＨＡｖａｃｃｉｎｅｗａｓｏｂｖｉｏｕｓｌｙｂｅｔｔｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｖａｃｃｉｎｅｇｒｏｕｐ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｕｇｇｅｓｔｔｈａｔｔｈｅｂｒｏａｄ￣ｓｐｅｃｔｒｕｍｓｕｂｕｎｉｔｖａｃｃｉｎｅａｇａｉｎｓｔＨ９ｓｕｂ￣ｔｙｐｅＡＩＶｈａｓｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｔｏｂｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄａｓｕｎｉｖｅｒｓａｌｖａｃｃｉｎｅｔｈａｔｃａｎｐｒｏｔｅｃｔａｇａｉｎｓｔＨ９ＡＩＶｉｎｆｅｃｔｉｏｎ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀Ｈ９ｓｕｂｔｙｐｅａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａꎻＨＡ１０９１ｇｅｎｅꎻｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍꎻｂｒｏａｄ￣ｓｐｅｃｔｒｕｍｓｕｂｕｎｉｔｖａｃｃｉｎｅｓꎻｉｍｍｕｎｉｔｙ㊀㊀中国于１９９４年在广东分离出第一个Ｈ９Ｎ２病毒ꎮ中国提供的数据中(全球共享所有流感数据倡议ꎬＧＩＳＡＩＤ)Ｈ９Ｎ２分离株超过７０％ꎮ最新的活禽市场监测结果显示ꎬ２０１４－２０２２年Ｈ９Ｎ２分离率持续居高不下ꎬＨ９Ｎ２亚型逐渐超越其他亚型ꎬ成为家禽中最主要的亚型ꎬ同时也成为养禽业的头号感染源[１￣２]ꎮ大多数感染Ｈ９Ｎ２ＡＩＶ(亚型禽流感)的鸡不会直接死亡ꎬ从而保留了二次感染其他亚型流感病毒的机会ꎬ促进了病毒重组ꎮＨ９Ｎ２禽流感病毒作为 供体病毒 ꎬ为包括Ｈ３Ｎ８㊁Ｈ５Ｎ１㊁Ｈ７Ｎ９㊁Ｈ１０Ｎ８和Ｈ１０Ｎ３在内的各种病毒亚型提供多个内部基因[３￣６]ꎮＨ９Ｎ２ＡＩＶ继续传播和进化将进一步增加它作为新ＡＩＶ基因供体的风险ꎮ尽管Ｈ９Ｎ２ＡＩＶ对禽类的致病性不强ꎬ但当与家禽中的其他病原体发生共感染或继发感染时ꎬ会造成重大经济损失[７￣９]ꎮ１９９８年ꎬ中国广东报道了世界首例人类感染Ｈ９Ｎ２禽流感病毒的病例[１０]ꎮ截至２０２１年１２月ꎬ在全球报告中ꎬ人类感染Ｈ９Ｎ２禽流感病毒确诊病例已达９５例ꎬ其中２０２０－２０２１年报道的３３例病例中有３２例来自中国ꎬ证实了Ｈ９Ｎ２禽流感病毒存在宿主溢出的高风险[１１]ꎮ可见Ｈ９Ｎ２不仅给家禽业造成严重的经济损失ꎬ也对人类健康构成重大的威胁ꎬ是重要的人兽共患病病毒ꎮＨ９型ＡＩＶ与Ｈ５㊁Ｈ７型高致病性禽流感的控制策略不同ꎮ虽然没有强制接种Ｈ９Ｎ２禽流感疫苗ꎬ但几乎所有鸡群都接种了Ｈ９疫苗ꎬ以减少潜在的经济损失ꎮ中国兽药基本信息数据库数据表明ꎬ在过去５年中ꎬ全国大约有５０家生物公司生产了单价或多价Ｈ９Ｎ２疫苗ꎮ经认证的Ｈ９疫苗相关产品中ꎬ疫苗株多达２５株ꎬ且均为全病毒灭活疫苗ꎮ研究和临床数据表明ꎬ接种Ｈ９Ｎ２疫苗可以减少病毒感染引起的临床症状ꎬ为免疫鸡群提供有效保护ꎮ然而ꎬＨ９Ｎ２频繁的抗原漂移是当前Ｈ９Ｎ２疫苗接种的挑战之一ꎮ当Ｈ９Ｎ２疫苗毒株与流行毒株之间的抗原性存在差异时ꎬ全病毒灭活疫苗无法提供足够的保护[１２]ꎮＨ９Ｎ２疫苗需要优化毒株以适应当前病毒变异㊁多抗原群共流行的情况ꎮ重要的是ꎬＨ９Ｎ２灭活疫苗主要诱导体液免疫ꎬ难以阻断鸡上呼吸道的病毒感染和排毒ꎮＨ９Ｎ２ＡＩＶ能够有效地在鸡与鸡之间进行气溶胶传播ꎬ即使在接种疫苗的鸡之间也是如此[１３]ꎬ加大了病毒防控难度ꎮ因此ꎬ 防排毒 成为Ｈ９Ｎ２新型疫苗研制的新标准和又一挑战ꎮ目前迫切需要开发更高效的疫苗来防控Ｈ９Ｎ２ꎬ例如在细胞和黏膜免疫水平上改进现有疫苗ꎬ或开发广谱疫苗以应对抗原的频繁变异[１４]ꎮ本研究室拟通过对Ｈ５亚型ＡＩＶ的血凝素(ＨＡ)蛋白质序列进行比对分析ꎬ设计出ＨＡ共有序列ꎬ制备成ＨＡ亚单位疫苗ꎬ效力试验结果证明ꎬＨＡ亚单位疫苗对不同流行毒株具有理想的保护效果[１５￣１６]ꎮ基于以上研究成果ꎬ本研究同样选择具有免疫原性的ＨＡ基因ꎬ通过对２０１０－２０１９年Ｈ９亚型ＡＩＶＨＡ蛋白关键性氨基酸位点进行分析和统计ꎬ选择每个位点最高频率氨基酸序列ꎬ并对关键性抗原位点进行校正ꎬ设计出ＨＡ(Ｈ９亚型)共有序列[１６]ꎬ利用杆状病毒表达系统表达ＨＡ蛋白ꎮ免疫效力试验结果表明ꎬ该疫苗具有良好的㊁广谱的免疫效果ꎬ为后续广谱疫苗的研究提供了研究数据ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验材料本实验室于２０１７－２０１９年在浙江㊁安徽㊁江苏和山东等省份的养鸡场分离筛选Ｈ９亚型ＡＩＶ毒株１１５㊁２３６㊁ＹＺꎬ经进化树分析ꎬ３个毒株属于ｈ９.４.２.５分支的不同亚分支ꎮＨ９亚型禽流感代表性毒株[Ａ/ｃｈｉｃｋｅｎ/Ｓｈａｎｄｏｎｇ/６/１９９６(ｈ９.４.２.３)(ＳＤ/６)㊁Ａ/ｃｈｉｃｋｅｎ/Ｇｕａｎ￣ｇｘｉ/５５/２００５(ｈ９.４.２.５)(ＧＸ/５５)㊁Ａ/ｔｕｒｋｅｙ/Ｗｉｓｃｏｎｓｏｎ/１/１９６６(ｈ９.１)(ＷＩ/１)]由南京农业大学平继辉教授惠赠ꎮ杆状病毒表达系统为本实验室保存ꎮ１.２㊀试验方法１.２.１㊀目的基因的设计㊀对２０１０－２０１９年公布的Ｈ９亚型ＡＩＶＨＡ蛋白的抗原相关位点㊁受体结合位点㊁潜在糖基化位点等关键序列进行分析ꎬ结合本试验室分离的Ｈ９流行株关键性氨基酸位点ꎬ利用生物信息学软件选择高频氨基酸ꎬ并对关键性位点进行校正ꎬ设计合成基因ＨＡꎮ１.２.２㊀重组杆状病毒的获得与鉴定㊀利用杆状病毒表达系统构建和制备含有目的基因ＨＡ的重组杆状病毒ꎬ经蓝白斑筛选获得含有ＨＡ基因的重组质粒ꎮ用ＨＡ重组质粒转染Ｓｆ９细胞ꎬ２７ħ静置培养ꎬ每天观察ꎬ待转染细胞出现停止生长㊁变圆㊁脱落等细胞病变２０９１江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第９期症状时ꎬ收获ꎬ得到重组杆状病毒ｒＶＨＡꎮ提取ｒＶＨＡ基因组ＤＮＡꎬ然后进行ＰＣＲ鉴定ꎮＰＣＲ鉴定正确后ꎬ取重组病毒ｒＶＨＡ上清液接种Ｓｆ９细胞ꎬ观察４ｄꎬ固定细胞ꎬ进行间接免疫荧光鉴定重组病毒特异性ꎮ１.２.３㊀重组蛋白的表达㊁分析㊀取重组杆状病毒ｒＶＨＡ上清液ꎬ接种悬浮培养的ｈｉｇｈｆｉｖｅ细胞ꎬ同时将野生型杆状病毒感染ｈｉｇｈｆｉｖｅ细胞作为对照ꎮ每天取少量细胞液进行台盼蓝染色ꎬ观察细胞死亡情况ꎬ待细胞９０％变蓝后收获ꎬ利用高压均质机将细胞破碎ꎬ进行Ｗｅｓｔｅｒｎ￣Ｂｌｏｔ㊁血凝活性等分析ꎮ１.２.４㊀红细胞凝集试验检测重组蛋白ＨＡ血凝活性㊀在微量血凝板上先加２５μｌ磷酸缓冲盐溶液(ＰＢＳ)ꎻ第一孔加２５μｌ重组蛋白(ｒＨＡ)混匀ꎬ倍比稀释至２１６ꎻ每孔再加入２５μｌＰＢＳ㊁２５μｌ１％鸡红细胞悬液ꎬ室温(２０~２５ħ)下反应３０ｍｉｎꎬ记录结果ꎮ１.２.５㊀重组杆状病毒传代后遗传稳定性及增殖性能鉴定㊀将重组杆状病毒ｒＶＨＡ连续传代至第８代ꎬ对每代ＨＡ基因的核酸序列进行测序ꎮ对每代重组杆状病毒进行病毒滴度(ＴＣＩＤ５０)鉴定ꎬ评价重组杆状病毒的增殖性能ꎮ１.２.６㊀交叉血凝抑制试验(ＨＩ)㊀检测ｒＨＡ与不同分支Ｈ９亚型ＡＩＶ病毒阳性血清(１１５㊁２３６㊁ＹＺ㊁ＳＤ/６㊁ＷＩ/１)的交叉反应活性ꎬ设无特定病原(ＳＰＦ)阴性血清为对照ꎮ１.２.７㊀重组蛋白的免疫原性评价㊀重组蛋白ｒＨＡ与白油按体积比１ʒ３乳化制备成ＨＡ油乳剂疫苗ꎮ乳化完全后ꎬ经性状㊁稳定性和无菌检验后ꎬ无菌装入疫苗瓶内ꎬ命名为ｒＨＡ疫苗ꎬ４ħ保存ꎮ１０日龄ＳＰＦ鸡３０只ꎬ分３组ꎬ每组１０只鸡ꎮ第一组ꎬｒＨＡ疫苗组ꎬ颈部皮下注射ｒＨＡ疫苗ꎬ每只注射０ ５ｍｌꎻ第二组ꎬ商品疫苗组ꎬ每只注射０ ３ｍｌꎻ第三组ꎬ阴性对照组ꎬ每只注射０ ５ｍｌ无菌生理盐水ꎮ免疫后第１４ｄ㊁２１ｄ㊁２８ｄ采血ꎬ分离血清ꎬ检测血清ＨＩ抗体效价ꎮ免疫２８ｄ后ꎬ选取２株处于不同亚分支的Ｈ９亚型ＡＩＶ流行毒株１１５和ＹＺ株进行攻毒ꎬ每只攻毒剂量为１ˑ１０６ ０ＥＩＤ５０(半数鸡胚感染量)ꎮ每日观察鸡群采食量㊁饮水量以及精神状态是否出现异常ꎬ观察是否出现发病和死亡情况ꎮ攻毒后２ｄ㊁４ｄ㊁６ｄ㊁８ｄ㊁１０ｄ㊁１２ｄ㊁１４ｄ称量各组试验鸡的质量ꎬ计算鸡的相对增质量率ꎮ攻毒后３ｄ㊁５ｄ㊁７ｄ用无菌棉拭子采集鸡喉头和泄殖腔分泌物ꎬ采集的拭子样品通过尿囊腔途径接种１０日龄ＳＰＦ鸡胚３枚ꎬ每枚０ ２ｍｌꎬ每天观察ꎬ连续观察５日ꎬ检测鸡胚尿囊液血凝效价ꎮ若接种喉拭子或泄殖腔拭子的鸡胚任何一个出现鸡胚尿囊液血凝效价ȡ１ˑ２２ꎬ则该鸡排毒ꎻ若鸡胚尿囊液血凝效价<１ˑ２２则为可疑ꎬ需要盲传一代ꎬ盲传后血凝效价<１ˑ２２则判定为阴性ꎬ表明该鸡不排毒ꎮ１.３㊀数据处理用Ｒｅｅｄ￣Ｍｕｅｎｃｈ法计算病毒滴度ꎮ用Ｇｒａｐｈ￣ＰａｄＰｒｉｓｍ５软件进行统计学分析ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀重组质粒的鉴定对构建的ｐＦａｓｔＢａｃ１￣ＨＡ重组杆状病毒转移质粒进行双酶切验证ꎬ获得目的基因和载体２个条带(图１)ꎬ结果表明ＨＡ基因与载体ｐＦａｓｔＢａｃ１连接成功ꎮＭ:ＤＬ５０００ｍａｒｋｅｒꎻ１:双酶切重组质粒ꎮ图１㊀重组质粒ｐＦａｓｔＢａｃ１￣ＨＡ的鉴定Ｆｉｇ.１㊀ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＦａｓｔＢａｃ１￣ＨＡ２.２㊀重组病毒的拯救与鉴定用重组质粒转染Ｓｆ９细胞ꎬ细胞变大变圆ꎬ折光率增加ꎬ细胞停止生长ꎬ表明细胞出现病变ꎬ收获为ｒＶＨＡꎮ通过间接免疫荧光检测重组病毒ｒＶＨＡ感染的细胞与不同Ｈ９阳性血清反应的情况ꎬ荧光显微镜下可见ꎬ感染重组病毒的细胞出现明亮的绿色荧光(图２Ａ~图２Ｃ)ꎻ野生型杆状病毒感染细胞未出现明显荧光(图２Ｄ)ꎬ表明含ＨＡ基因的重组杆状病毒拯救成功ꎬ且表达的ＨＡ蛋白与不同Ｈ９阳性血清间有反应活性ꎮ２.３㊀Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定重组蛋白的表达ｒＶＨＡ感染的ｈｉｇｈｆｉｖｅ细胞完全病变后收获ꎬ用高压均质机裂解细胞ꎬ然后进行Ｗｅｓｔｅｒｎ￣Ｂｌｏｔ鉴定ꎬｒＨＡ与Ｈ９亚型ＡＩＶ阳性血清孵育后ꎬ出现与预期大小一致㊁较明显的特异条带６３０００(图３)ꎬ证明ＨＡ蛋白成功获得大量表达ꎮ３０９１张雪花等:Ｈ９亚型禽流感广谱亚单位疫苗抗原设计及其免疫效力Ａ:ｒＶＨＡ感染Ｓｆ９细胞(１１５血清)ꎻＢ:ｒＶＨＡ感染Ｓｆ９细胞(ＳＤ/６血清)ꎻＣ:ｒＶＨＡ感染Ｓｆ９细胞(ＷＩ/１)ꎻＤ:野毒感染Ｓｆ９细胞(１１５血清)ꎮ图２㊀重组蛋白ＨＡ与不同Ｈ９亚型禽流感阳性血清结合的间接免疫荧光法鉴定Ｆｉｇ.２㊀Ｉｎｄｉｒｅｃｔｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｓｓａｙｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅ￣ｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎＨＡｒｅａｃｔｉｎｇｗｉｔｈｐｏｓｉｔｉｖｅｓｅｒａｏｆｄｉｆ￣ｆｅｒｅｎｔＨ９ａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｓｕｂｔｙｐｅｓＭ:蛋白ｍａｒｋｅｒꎻ１:重组蛋白ＨＡꎻ２:野生杆状病毒对照ꎮ图３㊀Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析重组蛋白质与Ｈ９阳性血清的反应Ｆｉｇ.３㊀ＲｅａｃｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈｐｏｓｉｔｉｖｅｓｅｒａｏｆＨ９ｓｕｂｔｙｐｅｓａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ２.４㊀重组蛋白ＨＡ血凝活性通过微量血凝试验检测ｒＨＡ血凝活性ꎬ同时设１１５病毒尿囊液为对照ꎬ表达的重组蛋白ＨＡ血凝效价为１ˑ２１２(图４)ꎬ说明ｒＨＡ具有凝集红细胞的生物学活性ꎮ２.５㊀重组病毒遗传稳定性及增殖性能鉴定测序结果显示ꎬ第１~８代重组杆状病毒的外源ＨＡ基因与目的序列完全一致ꎬ表明重组病毒具有良好的遗传稳定性ꎮ重组杆状病毒传至第７~８代时病毒滴度达１０８.００ＴＣＩＤ５０/ｍｌ以上(表１)ꎬ表明重组杆状病毒增殖性能良好ꎮ图４㊀重组ＨＡ蛋白的血凝活性检测Ｆｉｇ.４㊀ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＨＡｐｒｏｔｅｉｎ表１㊀重组杆状病毒稳定性检测结果Ｔａｂｌｅ１㊀Ｓｔａｂｉｌｉｔｙｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ毒种代次ＴＣＩＤ５０的对数Ｐ３６.００Ｐ４６.５０Ｐ５７.２５Ｐ６７.５０Ｐ７８.５０Ｐ８８.２５ＴＣＩＤ５０:病毒滴度ꎮ２.６㊀重组ＨＡ蛋白交叉反应活性通过ＨＩ试验测定ｒＨＡ与不同分支Ｈ９阳性血清交叉反应的抗原性ꎬ并同时与不同分支Ｈ９病毒进行比较ꎮ由图５可知ꎬｒＨＡ与现有流行毒株血清(ｈ９.４.２.５)反应的ＨＩ滴度较高ꎬ与分支较远的ＷＩ/１(ｈ９.１)反应最差ꎮ除去血清与同源病毒的反应ꎬｒＨＡ反应活性明显优于其他病毒ꎬ表明ｒＨＡ具有良好的交叉反应活性ꎮ２.７㊀重组病毒的免疫原性评价ＨＩ血清抗体作为流感疫苗血清学保护的反应指标ꎬ商品疫苗效力评判标准为ＨＩ抗体效价ȡ１ˑ２６.００ꎮ试验组于免疫后１４ｄ㊁２１ｄ㊁２８ｄ采集静脉血ꎬ以分离的流行毒株１１５㊁ＹＺ作为检测抗原检测血清抗体ＨＩ效价ꎮ重组蛋白疫苗免疫后１４ｄ即可诱导鸡产生较高水平的ＨＩ抗体应答ꎬ免疫后１４ｄＨＩ效４０９１江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第９期价能达到１ˑ２１２.００以上ꎬ免疫后２８ｄ达到１ˑ２１４.５９ꎬｒＨＡ组抗体效价显著高于商品苗组(图６)ꎮ㊀㊀ＳＰＦ鸡免疫２８ｄ后ꎬ对不同亚分支的Ｈ９亚型ＡＩＶ流行株１１５和ＹＺ以１ˑ１０６ＥＩＤ５０的病毒量进行攻毒ꎮ临床观察结果显示ꎬ各攻毒试验组在攻毒后１４ｄ内均无死亡ꎮｒＨＡ组㊁商品苗组在攻毒后无异常ꎬ饮水量㊁采食量㊁精神状态均正常ꎬ空白组(阴性组)在攻毒后４ｄ食欲与饮水欲相对较差ꎮ攻毒后２ｄ㊁４ｄ㊁６ｄ㊁８ｄ㊁１０ｄ㊁１２ｄ㊁１４ｄ分别对各组试验鸡称体质量ꎬ并计算不同试验组鸡体质量相对增长率ꎮ结果显示ꎬｒＨＡ免疫组的试验鸡相对增质量率最高ꎻ空白组(阴性组)的鸡相对增质量率明显低于免疫组(图７)ꎮａ:ｒＨＡꎻｂ:ｈ９.４.２.５￣１１５ꎻｃ:ｈ９.４.２.５￣２３６ꎻｄ:ｈ９.４.２.５￣ＹＺꎻｅ:Ｓｈ９.４.２.３￣ＳＤ/６ꎻｆ:ｈ９.１￣ＷＩ/１ꎮｈ９.４.２.５为流行毒株ꎮ图５㊀重组蛋白ＨＡ与Ｈ９不同阳性血清型交叉反应活性Ｆｉｇ.５㊀Ｃｒｏｓｓ￣ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎＨＡｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒ￣ｅｎｔｐｏｓｉｔｉｖｅｓｅｒｏｔｙｐｅｓｏｆＨ９Ａ:以病毒１１５为检测抗原检测免疫后血清ＨＩ抗体ꎻＢ:以病毒ＹＺ为检测抗原检测免疫后血清ＨＩ抗体ꎮ∗表示差异显著(Ｐ<０ ０５)ꎮ图６㊀不同抗原检测免疫后血清ＨＩ抗体Ｆｉｇ.６㊀ＨＩａｎｔｉｂｏｄｙｉｎｓｅｒａａｆｔｅｒｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｄｅｔｅｃｔｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｎｔｉｇｅｎｓＡ:感染１１５毒株后试验鸡相对增质量率ꎻＢ:感染ＹＺ毒株后试验鸡相对增质量率ꎮ图７㊀攻毒后不同试验组鸡的相对增质量率Ｆｉｇ.７㊀Ｒｅｌａｔｉｖｅｗｅｉｇｈｔｇａｉｎｒａｔｅｏｆｃｈｉｃｋｅｎｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐｓａｆｔｅｒｃｈａｌｌｅｎｇｅ㊀㊀１１５和ＹＺ毒株感染后３ｄ㊁５ｄ㊁７ｄ分别采集各组试验鸡的咽拭子和泄殖腔拭子样品ꎬ测定攻毒后每只鸡的排毒情况ꎮ感染１１５毒株３ｄ后ꎬｒＨＡ疫苗组喉头排毒率为２０％ꎬ泄殖腔排毒率为０ꎻ感染５ｄ后ꎬ喉头排毒率为２０％ꎬ泄殖腔排毒率为０ꎻ商品苗感染３ｄ后ꎬ喉头排毒率为１００％ꎬ泄殖腔排毒率为２０％ꎻ感染５ｄ后ꎬ喉头排毒率为２０％ꎬ泄殖腔未检测到排毒ꎻ阴性对照组感染３ｄ㊁５ｄ后ꎬ喉头排毒率为１００％ꎬ泄殖腔排毒率为１００％ꎻ感染７ｄ后所有组未测到排毒(表２)ꎮ５０９１张雪花等:Ｈ９亚型禽流感广谱亚单位疫苗抗原设计及其免疫效力表２㊀感染１１５毒株免疫保护结果Ｔａｂｌｅ２㊀Ｒｅｓｕｌｔｓｏｆｉｍｍｕｎｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔ１１５ｓｔｒａｉｎｓａｆｔｅｒｉｎｆｅｃｔｉｏｎ组别㊀㊀喉头排毒率(％)３ｄ５ｄ７ｄ泄殖腔排毒率(％)３ｄ５ｄ７ｄｒＨＡ组２０２０００００商品苗组１００２００２０００阴性对照组１００１０００１００１０００㊀㊀攻击ＹＺ毒株３ｄ后ꎬｒＨＡ疫苗组的喉头排毒率为２０％ꎻ其余未检测到病毒ꎬ排毒率为０ꎮ商品苗组攻毒３ｄ后的喉头排毒率为１００％ꎬ泄殖腔排毒率为２０％ꎻ攻毒５ｄ后喉头排毒率为４０％ꎬ泄殖腔未检测到排毒ꎮ阴性对照组攻毒３ｄ㊁５ｄ后的喉头排毒率为１００％ꎬ泄殖腔排毒率也为１００％ꎮ７ｄ后所有组未测到排毒(表３)ꎮ综上ꎬｒＨＡ疫苗组保护率明显高于商品苗组ꎬ表明ｒＨＡ疫苗对当前Ｈ９亚型ＡＩＶ流行株毒株具有良好的保护效果ꎮ表３㊀感染ＹＺ毒株免疫保护结果Ｔａｂｌｅ３㊀ＲｅｓｕｌｔｓｏｆｉｍｍｕｎｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔＹＺｓｔｒａｉｎｓａｆｔｅｒｉｎｆｅｃｔｉｏｎ组别㊀㊀喉头排毒率(％)３ｄ５ｄ７ｄ泄殖腔排毒率(％)３ｄ５ｄ７ｄｒＨＡ组２００００００商品苗组１００４００２０００阴性对照组１００１０００１００１０００３㊀讨论目前ꎬ中国控制Ｈ９Ｎ２禽流感的主要策略是疫苗接种ꎮ然而ꎬ中国Ｈ９Ｎ２病毒多种抗原型同时流行ꎬ疫苗更新速度落后于病毒变异速度ꎬ使有效疫苗接种面临挑战ꎮ灭活疫苗免疫可有效减轻Ｈ９Ｎ２病毒感染后的临床症状ꎬ大大减少经济损失ꎮ然而ꎬ另一个挑战是全病毒灭活疫苗免疫不能阻止Ｈ９Ｎ２ＡＩＶ再感染或病毒脱落ꎮ在中国ꎬ包括散养和混养在内的传统畜牧业系统继续占据重要地位ꎬ然而ꎬ中国家禽业的主要发展方向是集约化圈养ꎮ研制具有广谱性中和活性的通用疫苗对于控制Ｈ９Ｎ２具有重要意义ꎮ关于广谱疫苗的研究已有报道ꎬ利用Ｅｐｉｇｒａｐｈ算法来设计猪Ｈ３流感疫苗血凝素蛋白ꎬ该疫苗接种小鼠后可产生显著针对不同Ｈ３分离株的交叉反应抗体和Ｔ细胞反应ꎬ免疫雪貂后ꎬ用２种Ｈ３Ｎ２病毒攻击ꎬ该疫苗可保护雪貂免受攻击毒株的侵害[１７￣１８]ꎻ基于马赛克ＨＡ序列的Ｈ９亚型禽流感灭活疫苗能对异源Ｈ９Ｎ２ＡＩＶ株产生较好的交叉攻毒保护效果[１９]ꎮ随着基因工程技术的发展ꎬ重组病毒表达系统成为生产有广谱交叉免疫效果的禽流感疫苗的技术平台ꎮ杆状病毒表达系统具有诸多优点:不使用活病毒ꎬ生物安全性高ꎻ表达的ＨＡ蛋白可组装成病毒样颗粒(ＶＬＰ)ꎬ其结构功能与天然蛋白质相似ꎬ免疫原性良好ꎬ蛋白质表达效率高ꎻ重组杆状病毒基因遗传稳定ꎬ病毒增殖性能良好ꎬ保证了疫苗的生产质量[２０￣２１]ꎮ新型广谱疫苗一直是防控禽流感病毒相关研究的热点方向ꎬ只研究单个毒株的ＨＡ免疫原性ꎬ不能得到具有广谱保护效果的疫苗ꎬ本研究通过对２０１０－２０１９年Ｈ９亚型禽流感及本试验室分离的最新流行株ＨＡ蛋白的抗原相关位点㊁受体结合位点㊁潜在糖基化位点等关键位点序列进行分析ꎬ并对关键位点进行校正ꎬ利用生物信息学软件选择每个位点最高频次氨基酸设计合成ＨＡ基因ꎬ并构建杆状病毒表达系统获得重组蛋白ꎬ经间接免疫荧光㊁免疫印迹㊁交叉血凝抑制试验对其广谱活性进行鉴定ꎬ初步证明重组蛋白具有广谱的交叉反应活性ꎮ重组蛋白疫苗免疫后１４ｄ即可诱导鸡产生较高水平的ＨＩ抗体应答ꎬ１４ｄＨＩ效价能达到２１２.００以６０９１江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第９期上ꎬ２８ｄ达到１ˑ２１４.５９ꎬ显著高于商品苗组ꎮ用２株不同亚分支的Ｈ９亚型ＡＩＶ毒株１１５㊁ＹＺ攻击免疫组鸡ꎬ各组均未出现临床症状ꎮ攻击１１５毒株３ｄ后ꎬｒＨＡ疫苗组保护率为８０％ꎬ商品苗保护率为０ꎻ５ｄ后ꎬｒＨＡ疫苗组保护率为８０％ꎬ商品苗保护率为８０％ꎮ攻击ＹＺ毒株３ｄ后ꎬｒＨＡ疫苗组保护率为８０％ꎬ商品苗保护率为０ꎻ５ｄ后ꎬｒＨＡ疫苗组保护率为１００％ꎬ商品苗保护率为６０％ꎮ表明ꎬ重组蛋白疫苗组产生较好的交叉保护效果ꎬ明显高于商品苗组ꎮ另外ꎬ本研究采用高表达效率的ｈｉｇｈｆｉｖｅ细胞ꎬ提高了蛋白质的表达量ꎬ血凝活性高达１ˑ２１２ꎻｈｉｇｈｆｉｖｅ细胞为无血清培养基培养的全悬浮细胞ꎬ降低了成本ꎬ生产周期变短ꎬ适于大规模培养ꎬ为亚单位疫苗规模化生产提供了可行性ꎮ综上ꎬ通过分析㊁设计Ｈ９亚型禽流感ＨＡ关键位点等得到ＨＡ基因ꎬ利用Ｂａｃ￣ｔｏ￣Ｂａｃ表达的外源蛋白ＨＡ具有广谱的保护效力ꎬ可为研究Ｈ９亚型广谱亚单位疫苗提供技术基础和科学依据ꎮ参考文献:[１]㊀ＢＩＹＨꎬＣＨＥＮＱＪꎬＷＡＮＧＱＬꎬｅｔａｌ.ＧｅｎｅｓｉｓꎬｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｐｒｅｖａｌｅｎｃｅｏｆＨ５Ｎ６ａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓｉｎＣｈｉｎａ[Ｊ].ＣｅｌｌＨｏｓｔ＆Ｍｉｃｒｏｂｅꎬ２０１６ꎬ２０(６):８１０￣８２１.[２]㊀ＢＩＹＨꎬＬＩＪꎬＬＩＳＱꎬｅｔａｌ.Ｄｏｍｉｎａｎｔｓｕｂｔｙｐｅｓｗｉｔｃｈｉｎａｖｉａｎｉｎ￣ｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓｄｕｒｉｎｇ２０１６－２０１９ｉｎＣｈｉｎａ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＣｏｍｍｕｎｉ￣ｃａｔｉｏｎｓꎬ２０２０ꎬ１１(１):５９０９.[３]㊀ＰＵＪꎬＷＡＮＧＳＧꎬＹＩＮＹＢꎬｅｔａｌ.ＥｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｔｈｅＨ９Ｎ２ｉｎｆｌｕ￣ｅｎｚａｇｅｎｏｔｙｐｅｔｈａｔｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄｔｈｅｇｅｎｅｓｉｓｏｆｔｈｅｎｏｖｅｌＨ７Ｎ９ｖｉｒｕｓ[Ｊ].ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔ￣ｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａꎬ２０１５ꎬ１１２:５４８￣５５３.[４]㊀ＧＵＡＮＹꎬＳＨＯＲＴＲＩＤＧＥＫＦꎬＫＲＡＵＳＳＳꎬｅｔａｌ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒ￣ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＨ９Ｎ２ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓ:ｗｅｒｅｔｈｅｙｔｈｅｄｏｎｏｒｓｏｆｔｈｅ"ｉｎｔｅｒｎａｌ"ｇｅｎｅｓｏｆＨ５Ｎ１ｖｉｒｕｓｅｓｉｎＨｏｎｇＫｏｎｇ?[Ｊ].Ｐｒｏｃｅｅｄ￣ｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡ￣ｍｅｒｉｃａꎬ１９９９ꎬ９６(１６):９３６３￣９３６７.[５]㊀ＱＩＷꎬＺＨＯＵＸꎬＳＨＩＷꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｅｓｉｓｏｆｔｈｅｎｏｖｅｌｈｕｍａｎ￣ｉｎｆｅｃ￣ｔｉｎｇｉｎｆｌｕｅｎｚａＡ(Ｈ１０Ｎ８)ｖｉｒｕｓａｎｄｐｏｔｅｎｔｉａｌｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｔｈｅｖｉｒｕｓｉｎｐｏｕｌｔｒｙꎬＣｈｉｎａ[Ｊ].Ｅｕｒｏｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅꎬ２０１４ꎬ１９(２５):２０８４１.[６]㊀ＬＩＦＴꎬＬＩＵＪＹꎬＹＡＮＧＪＺꎬｅｔａｌ.Ｈ９Ｎ２ｖｉｒｕｓ￣ｄｅｒｉｖｅｄＭ１ｐｒｏ￣ｔｅｉｎｐｒｏｍｏｔｅｓＨ５Ｎ６ｖｉｒｕｓｒｅｌｅａｓｅｉｎｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓ:ｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｉｎｔｅｒ￣ｓｐｅｃｉｅｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｈｕｍａｎｓ[Ｊ].ＰＬｏＳＰａｔｈｏｇｅｎｓꎬ２０２１ꎬ１７(１２):ｅ１０１００９８.[７]㊀ＬＩＣＪꎬＹＵＫＺꎬＴＩＡＮＧＢꎬｅｔａｌ.ＥｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＨ９Ｎ２ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉ￣ｒｕｓｅｓｆｒｏｍｄｏｍｅｓｔｉｃｐｏｕｌｔｒｙｉｎｍａｉｎｌａｎｄＣｈｉｎａ[Ｊ].ＶｉｒｏｌｏｇｙＪｏｕｒ￣ｎａｌꎬ２００５ꎬ３４０(１):７０￣８３.[８]㊀ＣＨＯＩＹＫꎬＯＺＡＫＩＨꎬＷＥＢＢＹＲＪꎬｅｔａｌ.ＣｏｎｔｉｎｕｉｎｇｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＨ９Ｎ２ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓｉｎｓｏｕｔｈｅａｓｔｅｒｎＣｈｉｎａ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌ￣ｏｇｙꎬ２００４ꎬ７８(１６):８６０９￣８６１４.[９]㊀ＧＵＯＹＪꎬＫＲＡＵＳＳＳꎬＳＥＮＮＥＤＡꎬｅｔａｌ.ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆｍｅｍｂｅｒｓｏｆｔｈｅｎｅｗｌｙｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄＨ９Ｎ２ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｌｉｎｅａｇｅｓｉｎＡｓｉａ[Ｊ].ＶｉｒｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌꎬ２０００ꎬ２６７(２):２７９￣２８８.[１０]郭元吉ꎬ李建国ꎬ程小雯ꎬ等.禽Ｈ９Ｎ２亚型流感病毒能感染人的发现[Ｊ].中华实验和临床病毒学杂志ꎬ１９９９ꎬ１３(２):５￣８. [１１]ＡＤＬＨＯＣＨＣꎬＦＵＳＡＲＯＡꎬＧＯＮＺＡＬＥＳＪＬꎬｅｔａｌ.Ａｖｉａｎｉｎｆｌｕ￣ｅｎｚａｏｖｅｒｖｉｅｗＳｅｐｔｅｍｂｅｒ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２０２１[Ｊ].ＥＦＳＡＪｏｕｒｎａｌꎬ２０２１ꎬ１９(１２):ｅ０７１０８.[１２]ＳＵＮＹＰꎬＰＵＪꎬＦＡＮＬＨꎬｅｔａｌ.Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｉ￣ｆｉｃａｃｙｏｆａｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｖａｃｃｉｎｅａｇａｉｎｓｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｎｔｉｇｅｎｉｃｇｒｏｕｐｓｏｆＨ９Ｎ２ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓｉｎｃｈｉｃｋｅｎｓ[Ｊ].ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２０１２ꎬ１５６(１/２):１９３￣１９９.[１３]ＺＨＯＮＧＬꎬＷＡＮＧＸＱꎬＬＩＱＨꎬｅｔａｌ.ＭｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｔｈｅａｉｒｂｏｒｎｅｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｉｌｉｔｙｏｆＨ９Ｎ２ａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａＡｖｉｒｕｓｅｓｉｎｃｈｉｃｋｅｎｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙꎬ２０１４ꎬ８８(１７):９５６８￣９５７８. [１４]ＤＯＮＧＪＺꎬＺＨＯＵＹꎬＬＩＵＬＴꎬｅｔａｌ.ＳｔａｔｕｓａｎｄｃｈａｌｌｅｎｇｅｓｆｏｒｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔａｖｉａｎＨ９Ｎ２ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｉｎＣｈｉｎａ[Ｊ].Ｌｉｆｅ￣ｂａｓｅｌꎬ２０２２ꎬ１２(９):１３２６.[１５]ＷＵＰＰꎬＬＵＪＨꎬＺＨＡＮＧＸＨꎬｅｔａｌ.Ｓｉｎｇｌｅｄｏｓｅｏｆｃｏｎｓｅｎｓｕｓｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ￣ｂａｓｅｄｖｉｒｕｓ￣ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｓｖａｃｃｉｎｅｐｒｏｔｅｃｔｓｃｈｉｃｋｅｎｓａｇａｉｎｓｔｄｉｖｅｒｇｅｎｔＨ５ｓｕｂｔｙｐｅｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＩｍ￣ｍｕｎｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ８:１６４９.[１６]张雪花ꎬ陆吉虎ꎬ华㊀涛ꎬ等.通用型Ｈ５亚型禽流感病毒亚单位疫苗抗原表达和免疫效力研究[Ｊ].病毒学报ꎬ２０１９ꎬ３５(６):８６４￣８７２.[１７]ＢＵＬＬＡＲＤＢＬꎬＣＯＥＤＥＲＢＮꎬＤＥＢＥＡＵＣＨＡＭＰＪꎬｅｔａｌ.Ｅｐｉ￣ｇｒａｐｈｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｖａｃｃｉｎｅｉｎｄｕｃｅｓｂｒｏａｄｃｒｏｓｓ￣ｒｅａｃｔｉｖｅｉｍｍｕｎｉｔｙａｇａｉｎｓｔｓｗｉｎｅＨ３ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎꎬ２０２１ꎬ１２(１):１２０３.[１８]ＢＵＬＬＡＲＤＢＬꎬＤＥＢＥＡＵＣＨＡＭＰＪꎬＰＥＫＡＲＥＫＭＪꎬｅｔａｌ.Ａｎｅｐｉｔｏｐｅ￣ｏｐｔｉｍｉｚｅｄｈｕｍａｎＨ３Ｎ２ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖａｃｃｉｎｅｉｎｄｕｃｅｓｂｒｏａｄＬＹｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｉｍｍｕｎｉｔｙｉｎｍｉｃｅａｎｄｆｅｒｒｅｔｓ[Ｊ].ＮＰＪＶａｃｃｉｎｅｓꎬ２０２２ꎬ７(１):６５.[１９]李㊀丽ꎬ唐国毅ꎬ冯贺龙ꎬ等.基于马赛克ＨＡ序列的Ｈ９亚型禽流感灭活疫苗的免疫效力分析[Ｊ].畜牧兽医学报ꎬ２０２１ꎬ５２(１２):３５６９￣３５７７.[２０]ＢＵＣＫＬＡＮＤＢꎬＢＯＵＬＡＮＧＥＲＲꎬＦＩＮＯＭꎬｅｔａｌ.Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｔｒａｎｓｆｅｒａｎｄｓｃａｌｅ￣ｕｐｏｆｔｈｅＦｌｕｂｌｏｋｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ(ＨＡ)ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖａｃｃｉｎｅｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓ[Ｊ].Ｖａｃｃｉｎｅｓꎬ２０１４ꎬ３２(４２):５４９６￣５５０２.[２１]ＭＡＮＮＩＮＩＩꎬＴＲＯＭＢＥＴＴＡＭꎬＬＡＺＺＥＲＩＧꎬｅｔａｌ.Ｅｇｇ￣ｉｎｄｅｐｅｎｄ￣ｅｎｔｉｎｆｌｕｅｎｚａｖａｃｃｉｎｅｓａｎｄｖａｃｃｉｎｅｃａｎｄｉｄａｔｅｓ[Ｊ].Ｖａｃｃｉｎｅｓ(Ｂａ￣ｓｅｌ)ꎬ２０１７ꎬ５(３):１８.(责任编辑:陈海霞)７０９１张雪花等:Ｈ９亚型禽流感广谱亚单位疫苗抗原设计及其免疫效力。
鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗三种佐剂乳化效果比较
鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗三种佐剂乳化效果比较作者：毛春玲，袁明霞，赵刚等来源：《兽医导刊》 2013年第8期毛春玲1,2，袁明霞2，赵刚1，王君伟1（1.东北农业大学动物医学院,黑龙江哈尔滨 150030；2.哈药集团生物疫苗有限公司,黑龙江哈尔滨 150069）新城疫（ND）和禽流感（AI）是危害养禽业最为严重的两种传染病，广泛分布于世界各国。
这其中，ND与H9亚型AI混合感染发病率最高，在临床上最常见，给我国的养禽业造成了严重的经济损失。
国内外普遍使用疫苗（有活苗和灭活苗两种）预防这该疾病，单苗的使用较为普遍，但单苗存在使用不便，两次免疫造成养殖成本上升。
为此研制开发一种安全有效的二联疫苗将两种病毒抗原联合，达到一针防两病的目的，对预防控制危害养禽业的两种主要病原具有重要的实践意义。
灭活疫苗是采用化学或物理方法杀死病原生物所制备的一种用于预防接种的生物制品。
灭活疫苗是先对病毒或细菌培养，然后用加热或化学剂将其灭活。
灭活疫苗即可由整个病毒或细菌组成，也可由它们的裂解片段组成为裂解疫苗。
鸡新城疫、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗主要是由甲醛灭活后与油佐剂混合乳化制成。
所有的乳化剂分子都是由极性的亲水基团和非极性的亲油基团两部分组成。
而且两部分分处分子两端，形成不对称的结构。
这样的分子结构使得乳化机分子一部分可溶于水，另一部分易于和油相结合。
乳化剂的作用就在于使用机械作用分散所得的液滴不互聚集结。
乳化机在成品质量方面发挥的很大的功效，影响着产品的质量，本文主要通过试验对不同乳化剂进行研究，以便指导生产。
一、材料和方法（一）材料1.试验用主要试剂（如表1）。
2.试验用动物。
试验用SPF鸡，由哈药集团生物疫苗有限公司实验动物中心提供，饲养在SPF舍内，由专人负责管理和饲喂，饲料均经Co60照射消毒，饮水用煮沸消毒的常水；试验用SPF鸡胚，由山东济南斯帕法斯家禽有限公司提供SPF种蛋，哈药集团生物疫苗有限公司孵化；SPF鸡血清，SPF鸡鸡翅静脉采取血液1ml，3000rpm离心10min获得3.试验用疫苗。
禽流感(AI)H9和新城疫二联灭活油佐剂疫苗的研制
禽流感(AI)H9和新城疫二联灭活油佐剂疫苗的研制
刘佃章;杨小燕;赖友辉;华绍桂;黄金兰
【期刊名称】《龙岩学院学报》
【年(卷),期】2005(023)006
【摘要】从本地分离的禽流感(AI)-H9毒株和ND-lasota株,分别在9-11日龄的鸡胚增殖,灭活后用高压匀浆机乳化制成禽流感-H9、新城疫二联灭活油佐(乳)剂疫苗,经效力检验和攻毒试验结果表明,5日龄白羽肉鸡免疫后15天,抗体效价可达1:32以上,并能够保护免疫鸡免受AI的自然感染,ND的抗体效价也达到较高的水平.
【总页数】2页(P66-67)
【作者】刘佃章;杨小燕;赖友辉;华绍桂;黄金兰
【作者单位】森宝(龙岩)公司;龙岩学院生物科学与工程系,福建,龙岩,364000;森宝(龙岩)公司;森宝(龙岩)公司;森宝(龙岩)公司
【正文语种】中文
【中图分类】S859
【相关文献】
1.鸡新城疫、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗三种佐剂乳化效果比较 [J], 毛春玲;袁明霞;赵刚;王君伟
2.鸡新城疫和禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗不同佐剂的免疫效果试验 [J], 曹绘;李宝臣;李漫;方维焕
3.鸡新城疫-禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗(La Sota株+HP株)的灭活试验 [J], 陈
慧婧
4.鸭坦布苏病毒病-H9亚型禽流感二联灭活疫苗免疫佐剂筛选 [J], 田宇杰;王梦瑶;李银;嵇辛勤;章丽娇;刘青涛;韩凯凯;杨婧;刘宇卓;赵冬敏;刘娜
5.禽流感等重大动物疫病快速检测试剂和鸡新城疫、禽流感(H5、H9亚型)二联三价灭活疫苗二个项目通过专家鉴定 [J],
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种鸡免疫H9亚型禽流感油乳剂灭活苗的最佳抗体基础水平探讨
１２ １ 不 同 Ｈ ．． ９抗体 水 平 鸡 只 筛选 随 机 无 菌 采 集 ５ ０ ０
份最后 一次 免疫 时 间不 同的种 鸡 血 液 ， 离 血 清 ， 一 一 分 并
对 应 。用 血凝 （ １ 、 凝 抑 制试 验 （ Ａ） 测 血清 中 Ｈ Ｈ ）血 ＨＩ 检 ９
亚型禽流感病毒抗体。结果抗体效价在 ４ ０ｏ２的种鸡 ～１ｌ ｇ
安 徽 农 学 通 报 ， ｎ ｕ Ａ ． ｅ Ｂ ｌ ２ １ ，６ １ ） Ａ ｈ ｉ Ｓｉ ｕ１ ０ ０ １ （ ７ ． ．
７ １
种鸡 免疫 Ｈ ９亚 型 禽 流 感 油 乳 剂 灭活 苗 的
最 佳 抗 体 基 础 水 平 探 讨
陶海元 胡 忠祥 余
（ 国市畜牧兽医局 ， 徽宁国 宁 安
鸡 … 。近年来 Ｈ ９亚型低 致 病性 禽 流 感 ， 成 鸡 产 蛋性 能 造 下 降等不 良影 响 ， 给种鸡 养殖 业带 来很 大 的经 济损 失 。本 试验初 筛 出不 同抗 体水 平 的种鸡 ， 用禽 流感 （Ｈ Ｈ 使 ５、 ９亚 型 ）二联 灭活疫 苗进 行 免 疫 ， 测 免 疫后 Ｈ９抗 体 滴 度 的 监 变化 ， 索种鸡 禽 流感免 疫最 佳抗 体水 平 的时机 。 探
斌
２ ２ ０ ２ ４ ３０ ）
摘 要： 采用禽流感（ ９亚型） Ｈ 二联灭活疫苗对种鸡进行 了免疫， 监测免疫后 Ｈ 抗体滴度的变化， ９ 结墨表明在 ５ １ 。
的抗 体 水 平 下 ， 注射 禽 流 感 疫 苗 效 果 最 好 。 关 键 词 ： 鸡 ； 流 感 疫 苗 ； 体 水 平 种 禽 抗
中 图分 类 号 ￥ ３ ８１ 文 献标 识 码 Ａ 文章 编 号 １０ ７ ３ （０ ０ １ ７ ０ ０ ７— ７ １ ２ １ ）７— １— ２
H9亚型禽流感病毒黏膜DNA疫苗与灭活油乳苗的联合免疫研究
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中 国 人 兽 共 患 病 学 报
４２ ５
文章 编 号 ： ０ ２—２ ９ ２ ０ ） ５—０ ２ １０ ６ ４（ ０ ８ ０ ４ ５—０ ５
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鸡新城疫病毒、禽流感病毒(H9亚型)病毒、禽腺病毒三联灭活疫苗抗体免疫持续期研究
究取鸡新城疫、禽流感（H9 亚型）、禽腺病毒三联
灭活疫苗免疫 7 日龄和 21 日龄 SPF 鸡，于免后不同
时间进行血清抗体测定，来确定该产品的免疫持续
20
饲料博览 2021 年第 5 期
期，以期指导鸡病系灭活疫苗
鸡新城疫病毒、禽流感病毒（H9 亚型）、禽
80％
[ 6-7 ]
。该病主要发生于 3~5 周龄的肉鸡，肉杂
鸡（817）、麻鸡、种鸡和蛋鸡亦可在相似的日龄段
发病，是目前危害养禽业健康发展的最严重的传染
病之一，在我国每年都有不同程度的流行，严重危
害集约化养禽业的持续、稳定、健康发展，给养禽
业造成巨大的经济损失。
近几年来以上三种病毒混合感染在我国家禽上
produced by Harbin Pharmaceutical Group Biological Vaccine Co., Ltd. Seven-day and 21-day SPF chickens were
inoculated subcutaneously with the triple inactivated avian adenovirus vaccine. Blood samples were collected on the
protection standard in the 5th month after immunization. The results showed that the immune duration of chickens
under two weeks old was two months, and that of chickens over two weeks old was four months.
禽流感灭活疫苗(H9亚型)子代通过母源抗体获得被动免疫力的效力试验
禽流感灭活疫苗(H9亚型)子代通过母源抗体获得被动免疫力的效力试验姜宇;常超;杨朋欣【摘要】为进一步了解疫苗在免疫持续期临界点时子代通过母源抗体获得被动免疫力的结果及疫苗使用时间,以实验室试制的3批禽流感灭活疫苗(H9亚型)进行母源抗体对子代鸡的被动免疫试验.取父母种鸡接种疫苗4个月后的产蛋进行孵化,分别对各批次雏鸡进行血清学和免疫攻毒试验.结果表明,随着日龄的增大,子代鸡的母源抗体逐渐消退.因此,在进行子代鸡的免疫时,应该根据种鸡免疫的时间进行灵活确定,在接种前,应该进行母源抗体效价测定,确定<4log2,才能进行免疫接种;如果没有条件检测母源抗体效价,建议在10日龄后接种,以避免母源抗体干扰免疫效果.【期刊名称】《饲料博览》【年(卷),期】2017(000)009【总页数】2页(P37-38)【关键词】禽流感灭活疫苗;母源抗体;效力试验【作者】姜宇;常超;杨朋欣【作者单位】哈药集团生物疫苗有限公司,哈尔滨 150069;哈药集团生物疫苗有限公司,哈尔滨 150069;哈药集团生物疫苗有限公司,哈尔滨 150069【正文语种】中文【中图分类】S83;S852.65+9.5Abstract:In order to further understand the critical point of vaccination at the critical stage of immunity,the offspring obtained the passive immunity through the mother antibody and the time of vaccine use,the passive immunization test of the maternal antibody against the off springs of chickens was carried out with 3 batches of inactivated avian influenza vaccine(H9 subtype)produced in the laboratory in this papper.When parents vaccinated 4 months later,the eggs were hatched and the serological and immunological tests were conducted on each batch of chicks.The results show that the maternal antibodies of progeny chickens gradually decreased as the age increased.Therefore,when carrying out the immunity of the offspring chicken,it should be flexibly determined according to the time of the immunization of the breeder chickens.Before vaccination,the maternal antibody titer should be determined,and Onlytiter was less than 4log2 could be vaccinated;if there were no conditions to detect maternal antibody titer,vaccination should be done at greater than 10 days of age to avoid maternal antibodies interfering with the immune response.Key words:inactivated avian influenza vaccine;maternal antibody;efficacy test根据世界动物卫生组织（OIE）的疾病分类标准，高致病性禽流感属A类疾病，我国也将其列为一类传染病，其传播速度快、发病率和死亡率高[1]。
减毒沙门菌运送的H9N2亚型禽流感病毒DNA疫苗的研制及其免疫试验
ＨＡ） 以 ５ ０ ｃｕ 只的 剂量 两 次 口服 接 种 １日龄 的 商品代 伊 莎褐 蛋鸡 ， 疫 鸡既 能检 测 到 ＨＡ 特 异性 的 。 ×１ 。 ｆ ／ 免 血 清抗体 应答 ， 又能检 测 到黏 膜免 疫 应 答 ， 用 Ａ／ ｈｃ ｅ ／ ｈ ｎ ｈ ｉ３ ２ ０ （ Ｎ２ Ａ Ｖ 毒 株 经 滴 鼻和 口 采 Ｃ ｉ ｎ Ｓ ａ ｇ ａ ／ Ｏ ２ Ｈ９ ） Ｉ ｋ ／
刘 丽 平 ， 新 安 ¨ ， 小 荣 潘 志 明 焦 张 ，
（． 州 大学 兽 医学 院 ， 苏 扬 州 ２ ５ ０ ；． 苏 省 淡 水 水 产 研 究 所 ． 苏 南 京 ２ ０ １） １扬 江 ２０９２江 江 １０ ７
摘 要 ： 据 Ｇｅ Ｂ ｎ 根 ｎ ａ ｋ中 已发 表 的 Ｈｇ Ｎ２亚 型 ＡＩ Ｖ ＨＡ基 因序 列设计 并合 成一 对 Ｐ Ｒ 引物 ， Ｃ 通过 ＲＴ － Ｐ Ｒ扩 增 Ａ／ ｉｋ ｎ Ｓ ａ ｇ ａ／ ／ Ｏ ２ Ｈ９ ） Ｖ毒 株 的 ＨＡ基 因 ， 序确 认后 ， 其 克 隆入 真核 表 达 载 Ｃ Ｃｈｃ ｅ ／ ｈ ｎ ｈ ｉ３ ２ ０ （ Ｎ２ ＡＩ 测 将 体 ｐ Ｘ１和 ａｄｐ ＶＡ ｓ－ ＶＡＸ１ 到 重组 表 达 质 粒 ｐ 得 ＶＡＸ１ＨＡ 和 ａ ｄｐ 一 ｓ－ ＶＡＸ１ＨＡ。 将 重 组 质 粒 转 染 Ｃ － 一 － Ｏｓ７细 胞 ， 间接 免 疫 荧光试 验证 实， 经 ＨＡ 基 因在 细胞 内得 到 了瞬 时表达 。进 一 步将 重 组 质粒 转化 减毒 鼠伤 寒 沙 门
H9亚型禽流感病毒变异的研究进展
H9亚型禽流感病毒变异的研究进展1. H9亚型禽流感病毒简介H9亚型禽流感病毒(H9N2)是一种常见的禽流感病毒，广泛存在于鸡、鸭、鹅等禽类中。
该病毒对家禽的感染具有高度传染性，且对人类具有一定的潜在传染性。
近年来，H9N2病毒发生了多次变异，引起了广泛的关注。
本文将介绍H9N2亚型禽流感病毒变异的最新研究进展。
2. H9N2亚型禽流感病毒变异的临床表现H9N2亚型禽流感病毒在家禽中引起了一系列临床表现，包括呼吸道炎症、消化道异常等。
在人类中，该病毒引起了轻度呼吸道感染，并偶尔导致重度肺部损伤和死亡。
近年来发现的新变异株显示出更高的传染性和致死率。
3. H9N2亚型禽流感病毒基因组变异H9N2亚型禽流感病毒基因组变异是其变异的重要基础。
研究发现，H9N2病毒的表面糖蛋白HA和NA基因发生了多次变异，导致了病毒的抗原性和传染性的改变。
此外，H9N2病毒内部基因片段的重组和变异也是其变异的重要原因。
4. H9N2亚型禽流感病毒与其他流感病毒亚型间的基因交换H9N2亚型禽流感病毒与其他流感病毒亚型之间存在着广泛而频繁的基因交换。
这种交换导致了新流行株的出现，增加了人类和动物之间传播的风险。
近年来发现H9N2与H7N9、H5N1等高致死性禽流感病毒亚型之间存在着多次基因交换事件。
5. H9N2亚型禽流感病毒对抗药物耐药性近年来，一些H9N2亚型禽流感株对抗药物出现耐药性。
这种耐药性不仅增加了治愈该类感染的难度，也增加了人类治愈其他高致死性禽流感病毒感染的难度。
因此，研发新的抗病毒药物对于控制H9N2亚型禽流感病毒的传播至关重要。
6. H9N2亚型禽流感病毒的传播途径H9N2亚型禽流感病毒主要通过飞沫传播途径在家禽间传播。
然而，近年来发现该病毒也可以通过空气传播和接触传播途径在家禽间和人类间传播。
这种多种传播途径增加了该病毒对人类健康的威胁。
7. H9N2亚型禽流感病毒变异对防控措施的影响H9N2亚型禽流感病毒变异增加了防控该类疾病的难度。
鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联油乳剂灭活疫苗免疫效力试验
１ ． ２ ． １ 血 清 学效 力 检验 与靶 动 物 免疫 攻 毒 保 护相
关 性 的 研 究
１ ． ２ ． １ ． １ 新 城疫
将 ７ ０只 ３ ０日龄 Ｓ Ｐ Ｆ鸡 随机分
续 期试 验评 估 了该 灭 活 苗对 Ｓ Ｐ Ｆ鸡 的免 疫 保 护 效
成 ４组 ， 第１ 组 ～第 ３ 组 每组 ２ ０只鸡 ， 分别按 ０ ． ０ １ 、 果， 为合 理制定 免疫 程序 及预 防和控 制禽 流 感 、 新 城 ０ ． ０ ２ 、 ０ ． ０ ３ ｍＥ ／ 只 的剂 量 免 疫 鸡 新 城 疫 灭 活 疫 苗 ； 疫 的发 生和 流行提 供依据 。 第 ４组 １ ０只鸡 ， 不 免疫作 为对 照 。免疫 接种 后 ２ １ ｄ
动物 医学进 展 。 ２ ０ １ ３ ， ３ ４ （ ３ ） ： ５ ８ － ６ １
Ｐｒ ｏ ｇｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｎ Ｖｅ ｔ ｅ ｒ ｉ ｎ ａ ｒ ｙ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎｅ
鸡新城疫 、 禽流感 （ Ｈ ９ 亚型 ） 二 联 油 乳 剂 灭活 疫 苗 免疫 效 力试 验
摘 要 ： 为评价 鸡新城 疫和 禽流 感（ Ｈ９亚型 ， Ｓ Ｙ株 ） 二联 灭活 疫苗 （ 以下 简称 “ 二 联 苗” ） 对 Ｓ Ｐ Ｆ鸡 的免 疫保 护效 力 ， 进行 了血 清学效 力检验 与靶动 物免 疫攻毒 保 护相 关性 的研 究及 免 疫持 续期 试验 。不 同抗 体 水
平的 Ｓ Ｐ Ｆ鸡 攻毒试 验结 果表 明 ， 当 ＮＤＶ ＨＩ ≥５ ． ０ ｌ ｏ ｇ ２ ， ＡＩ Ｖ ＨＩ ≥６ ． ０ ｌ ｏ ｇ ２时 ， 分别 攻 击 Ｎ ＤＶ、 ＡＩ Ｖ， 试验 鸡
１ ． １ ． ２ 疫苗 新 城 疫 、 禽 流感 （ Ｈ９亚 型 ， Ｓ Ｙ株） 二
减毒沙门氏菌介导H9亚型禽流感DNA疫苗与灭活疫苗联合应用研究
减 毒 沙 门 氏 菌 介 导 H 9 亚 型 禽 流 感 D NA 疫 苗 与灭活疫苗联合应用研究
潘志明, 程宁宁, 刘蓓蓓, 孙 林, 耿士忠, 陈 祥, 黄金林, 焦新安 3
(扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室, 江苏 扬州 225009)
摘 要: 构建获得含有 H 9 亚型禽流感病毒血凝素 (HA ) 基因的重组真核表达质粒 pCA GGS2 HA 。 重组质粒电转化减 毒 9 鼠伤寒沙门氏菌 SL 7207, 获得重组沙门氏菌 SL 7207 (pCA GGS2 HA ) 。 重组菌 SL 7207 (pCA GGS2 HA ) 以 5 ×10 cfu 的剂 量 2 次口服免疫 1 日龄 商品代伊莎褐蛋鸡后, 再以油乳剂 灭活疫苗加强免疫 1 次, 并设立重 组菌单独免 疫组、 灭活苗免 疫组、 空载 体免疫组及空白对照 组 。 联合免疫组和重组菌单 独免疫组的小肠黏膜抗 体效价与其他组之 间存在显著 差异 (P < 0105) , 且两组的攻毒 免疫保护水平与空载体 组之间差异显著 ( P < 0 105) , 其 中联合免疫组的 免疫保护率 最高, 达 100% , 而 灭活 苗免 疫组 保护 率为 80% , 表明减毒沙门 氏菌介导的 H9 亚型 禽流感 DNA 疫苗与 灭活疫苗联合应用具有 良好的免疫协同作用 。 关键词: H 9 亚型禽流感; 减毒沙门氏菌; DNA 疫苗; 灭活油乳苗; 联合免疫 中图分类号: S 852. 65+ 9 . 5 文献标识码: A 文 章编 号: 1671- 4652 (2007) 04- 0001- 05
PAN Zh i-m ing, C HENG Ning- n ing, L IU Bei- be i, SUN L in , GENG Sh i- zhon g, CHEN Xiang, HUANG J in - l in , J IAO Xin -an
禽流感(H9亚型)油乳剂灭活疫苗的研究
禽流感(H9亚型)油乳剂灭活疫苗的研究韩正博;刘芳悦;郭兴福;马世华;邬立权;李宝臣;胡海军;戴秀莉;潘兴广【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2001(035)006【摘要】将H9亚型禽流感病毒尿囊液,经甲醛灭活,以矿物油为佐剂制成油乳剂灭活疫苗.疫苗物理性状良好,接种鸡无不良反应,接种疫苗后14d,禽流感病毒HI GMT(Log2)为7.7～7.8,21d为8.9～9.3,于接种疫苗后14、21、30、60d攻击同型禽流感病毒,接种疫苗鸡全部获得保护.现地实验取得了良好地免疫效果,证明制备的油乳剂灭活疫苗安全,免疫原性良好.【总页数】4页(P4-7)【作者】韩正博;刘芳悦;郭兴福;马世华;邬立权;李宝臣;胡海军;戴秀莉;潘兴广【作者单位】黑龙江省生物制品一厂,黑龙江,哈尔滨,150069;黑龙江省生物制品一厂,黑龙江,哈尔滨,150069;黑龙江省生物制品一厂,黑龙江,哈尔滨,150069;黑龙江省生物制品一厂,黑龙江,哈尔滨,150069;黑龙江省生物制品一厂,黑龙江,哈尔滨,150069;黑龙江省生物制品一厂,黑龙江,哈尔滨,150069;黑龙江省生物制品一厂,黑龙江,哈尔滨,150069;黑龙江省生物制品一厂,黑龙江,哈尔滨,150069;黑龙江省生物制品一厂,黑龙江,哈尔滨,150069【正文语种】中文【中图分类】S859.797【相关文献】1.鸭H9亚型禽流感油乳剂灭活疫苗的免疫原性 [J], 刘宇卓;李银;张敬峰;顾玉美2.鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联油乳剂灭活疫苗免疫效力试验 [J], 白军;刘淑红;焦铁军;王运宏;黄建斌;李河林;马建玲;赵希斌;于三科3.禽流感(H5、H9亚型)二价油乳剂灭活疫苗试验研究 [J], 赵雪丽;李明义;范根成4.禽流感(H5、H9亚型)二价油乳剂灭活疫苗试验研究 [J], 李明义;范根成;杜元钊;张文学5.鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联油乳剂灭活疫苗最小免疫剂量试验 [J], 王宏俊;姜北宇;校海霞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
禽流感H_9亚型油乳剂灭活疫苗的改进
禽流感H_9亚型油乳剂灭活疫苗的改进陈瑞爱;温志芬;唐满华;潘洪波;李琳【期刊名称】《中国兽医科技》【年(卷),期】2004(34)1【摘要】用新引进的 6株禽流感病毒 (AIV )H9亚型和现制苗用的AIV H9毒株分别制备AIV H9、AIV H5、NDV二联三价油乳剂灭活疫苗 ,免疫 5日龄和 10日龄雏鸡 ,于免疫当日直至 80日龄鸡出栏期间定期采血 ,用HI法检测相应的AIV H9、AIV H5和NDV抗体。
结果表明 ,10日龄免疫鸡的AIV H9抗体效价最高 ,5日龄和 10日龄免疫鸡的AIV H5抗体效价差别不明显 ;用引进的 3号AIV H9毒株制备的联苗对 10日龄雏鸡免疫后 2 0d产生AIV H9保护性抗体 ,一直持续到 80日龄以上 ,期间的抗体平均效价为 6 .72 (lb) ,而现制苗用的AIV H9毒株制备的联苗免疫力较差 ;现制苗用的AIV H5毒株制备的联苗免疫效力仍较好 ;分别接种 0 .2 5、0 .30mL/只联苗的雏鸡AIV H5抗体效价没有明显差别 ,而AIV H9抗体效价以接种 0 .30mL/只剂量的为高 ;不同日龄、不同免疫剂量的试验鸡NDV抗体效价没有明显差异。
【总页数】5页(P45-49)【关键词】禽流感;H9亚型油乳剂灭活疫苗;病毒;AIV;雏鸡;抗体效价;免疫;剂量;日龄【作者】陈瑞爱;温志芬;唐满华;潘洪波;李琳【作者单位】广东温氏食品集团有限公司;华南农业大学动物科学学院【正文语种】中文【中图分类】S858.315.3【相关文献】1.鸭H9亚型禽流感油乳剂灭活疫苗的免疫原性 [J], 刘宇卓;李银;张敬峰;顾玉美2.禽流感H5亚型2价油乳剂灭活疫苗免疫鸡群后HI抗体消长规律的测定 [J], 肖丽辉;宋凤香;陆桂英3.禽流感(H5、H9亚型)二价油乳剂灭活疫苗试验研究 [J], 赵雪丽;李明义;范根成4.禽流感H5亚型油乳剂灭活疫苗免疫丹顶鹤抗体消长规律 [J], 李洪彬;王文峰;李忠;刘力威;张显光;黄宇翔;王志强;邹跃5.禽流感(H_9亚型)油乳剂灭活疫苗的血凝抑制(HI)抗体动态变化的研究 [J], 陈一兵;刘岳龙;刘雷;解增俊;印继华;丛华;沈海蜂因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
H9亚型禽流感油乳剂灭活苗免疫产生期内T淋巴细胞表型亚类的检测与研究
H9亚型禽流感油乳剂灭活苗免疫产生期内T淋巴细胞表型亚类的检测与研究付朝阳;于康震;唐秀英;冯菊艳;田国斌;吴东来;贾永清【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2001(023)006【摘要】采用免疫荧光法、使用流式细胞检测仪对经H9亚型禽流感病毒人工感染SPF鸡、H9亚型禽流感油乳剂灭活苗免疫SPF鸡以及经免疫后使用H9亚型禽流感病毒攻毒后的SPF鸡外周血、脾脏、胸腺中T细胞表型亚类(CD4+、CD8+、TCR1+)的变化规律进行了监测,结果表明,H9亚型禽流感油乳剂灭活苗免疫后抗原的缓慢释放可在一定程度上激发机体的细胞免疫应答,使免疫活性T淋巴细胞得到活化,免疫后鸡体外周血中CD4+、CD8+和TCR1+T细胞的数量呈现出一明显升高的过程;同时,人工感染免疫鸡后,脾脏和胸腺TCR1+T细胞的数量上升,外周血CD4+、CD8+和TCR1+T细胞的数量少量降低或维持不变,随后短期即恢复正常;而人工感染SPF对照鸡后,外周血CD4+、CD8+和TCR1+T细胞的数量呈现下降趋势.【总页数】4页(P430-433)【作者】付朝阳;于康震;唐秀英;冯菊艳;田国斌;吴东来;贾永清【作者单位】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,;东北农业大学,【正文语种】中文【中图分类】S858.31【相关文献】1.种鸡免疫H9亚型禽流感油乳剂灭活苗的最佳抗体基础水平探讨 [J], 陶海元;胡忠祥;余斌2.自发性早产母胎界面子宫自然杀伤细胞免疫表型及T淋巴细胞亚群变化的研究[J], 高燕;王萍玲;袁军;刘水合;黄林3.首发重度抑郁症患者不同亚类T淋巴细胞产生主要细胞因子水平的研究 [J], 何军;毕斌;罗洁;许琦;张姝;尹科;张捷;韩小娟4.H9亚型禽流感油乳剂灭活苗免疫、免疫后攻毒及人工感染鸡抗体的监测 [J], 付朝阳;冯菊艳;唐秀英;田国彬;于康震5.急性非T淋巴细胞白血病的免疫表型与临床特点的研究 [J], 郭承山;张明珙因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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文章编号:1002-2694(2008)05-0425-05H9亚型禽流感病毒黏膜DNA 疫苗与灭活油乳苗的联合免疫研究*程宁宁,潘志明,刘蓓蓓,孙 林,耿士忠,贾自文,黄金林,焦新安摘 要:目的 构建减毒沙门氏菌介导的H9亚型禽流感病毒黏膜DN A 疫苗,并探讨黏膜DN A 疫苗与灭活油乳苗联合应用的免疫效力。
方法 以RT-PCR 法扩增H 9N 2亚型禽流感病毒分离株(A /Chicken/China/N/2005)的血凝素(H A )基因,然后克隆入pmcDN A3.1+载体中,获得重组质粒pmcD NA 3.1-H A 。
通过电穿孔法将重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL 7207,构建沙门氏菌介导的黏膜DN A 疫苗SL 7207(pmcD NA 3.1-HA )。
重组菌与灭活油乳苗联合免疫1日龄商品代伊莎褐蛋鸡,并设立重组菌SL 7207(pmcDN A3.1-H A)单独免疫组、油苗免疫组、空载体免疫组及空白对照组。
用H I 或ELI SA 测定血清和小肠黏膜抗体效价,以H9N2亚型禽流感病毒攻击,计算免疫保护力。
结果 联合免疫组和重组菌SL 7207(pmcD -N A 3.1-H A )单独免疫组能激发机体产生黏膜免疫应答,且与其他试验组之间存在显著性差异(P <0.05)。
联合免疫组和重组菌SL7207(pmcDN A 3.1-H A )单独免疫组的免疫保护力均与空载体组、空白对照组有显著差异(P <0.05),且联合免疫组的免疫保护率最高,达100%。
结论 成功构建H 9亚型禽流感病毒黏膜DN A 疫苗,DN A 疫苗与灭活油乳苗联合应用具有良好的免疫协同作用。
关键词:H 9亚型禽流感;减毒沙门氏菌;DN A 疫苗;灭活油乳苗;联合免疫 中图分类号:S855.3 文献标识码:AThe prime -boost strategy with mucosal DNA vaccine and killed oi-l emulsifiedvaccine against H9subtype of avian influenza virusCH ENG Ning -ning,PAN Zh-i ming,LIU Be-i bei,SU N Lin,GEN G Sh-i zhong ,JIA Z-i w en,H U ANG Jin -lin,JIA O Xin -an(J iang su K ey Labor ator y of Zoonos is ,Yang z hou Univ er s ity ,Yangz hou 225009,China)ABSTRAC T:In or der t o determ ine the sy ner gistic immune efficacy of the D NA vaccine w ith the killed o i -l emulsif ied vaccine of H 9N 2subt ype avian influenza v irus(A IV ),the mucosal DN A vaccine named SL 7207(pmcDN A -H A )w as construsted,and the immunog enicity of the pr ime -bo ost strateg y w ith the DN A v accine and killed oi-l emulsified vaccine w as ev aluated in chicken model.T he hemag glut inin (H A)gene fro m t he H9N 2subty pe A IV w as amplified w ith the R T -PCR and sub -clo ned int o vector pmcDN A 3.1+.T he recombinant plasmid was transfor med into the att enuated S almonella ty p himur ium SL7207,and t he pos-i t ive reco mbinant was designated as SL 7207(pmcDN A3.1-H A).One -day -old commer cial ISA br ow n chickens wer e immunized with SL 7207(pmcDN A3.1-H A)plus killed oi-l emulsified vaccine o f AI V,SL7207(pmcDN A 3.1-H A ),killed oi-l emulsified vac -cine of A IV ,SL7207(pmcDN A 3.1),and PBS.It w as show n that the intest inal mucosal antibody titers in combined inoculation and SL7207(pmcDN A 3.1-H A)g roups wer e significantly hig her than those o f other g ro ups (P <0.05).T he result o f protec -t ive immunity sho wed bo th the gr oup o f combined ino culation and SL 7207(pmcDN A 3.1-H A)pr ov iding significantly prot ection co mpar ed w ith the neg ativ e co nt rol g ro ups(P <0.05),and the g ro up of combined inoculation o btaining 100%pro tect ion.In co nclusio n,the muco sal DN A vaccine o f H9N2subty pe A IV was successfully co nstr ucted,and the muco sal DN A v accine plus killed o i -l emulsified v accine has go od sy ner gist ic effect o f protectio n.KEY WORDS:H9N 2subt ype of avian influenza;att enuated Salmonella ty p himur ium ;DN A v accine;killed o i-l emulsified vaccine;combined immunization*国家自然科学基金(30425031);全国优秀博士学位论文作者专项资金(FANEDD 200358);国家863计划(2006AA10A206);江苏省自然科学基金项目(BK2007511) 通讯作者:焦新安,Email:jiao@作者单位:扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室,扬州225009禽流感(A vian Influenza,AI)是由正粘病毒科A 型流感病毒引起的家禽及野生禽类感染或疾病的综合症112。
H9亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)属于低致病性禽流感病毒,最早报道于1966年122。
自20世纪90年代起该亚型病毒已在亚洲鸡群中广泛流行132,给养禽业造成严重的经济损失,而且可引起人发病,其诱发的公共卫生问题也已引起人们的极大关注142。
目前,对于H9亚型AI的防治主要采用油乳剂全病毒灭活疫苗进行免疫预防,能产生高水平的循环抗体,但不能有效激发细胞免疫和黏膜免疫152。
更为重要的是,即使鸡群存在高水平的循环抗体,在受到AIV攻击时,也会造成毒株在肠道局部复制并间歇排毒,一旦鸡群处于免疫保护的临界点,就会发病。
而AIV主要通过黏膜途径感染机体,因此在局部建立有效的黏膜免疫应答对于AI的控制有着重要的意义。
研究表明,重组减毒沙门氏菌能够通过黏膜自然感染途径,靶向运送DNA疫苗给专职抗原提呈细胞,能同时激发机体产生细胞、体液和黏膜免疫应答16-72。
因而,黏膜DNA疫苗与灭活疫苗二者之间的联合应用对于AI的免疫预防将有十分重要的意义。
为进一步探讨这些问题,本研究通过构建H9N2亚型AIV黏膜DNA疫苗,探讨DN A疫苗与灭活苗联合免疫对鸡的协同保护作用,从而为有效地控制AI的发生和流行探索新的途径和方法。
1材料与方法1.1材料1.1.1毒株和疫苗H9亚型禽流感病毒株A/ Chicken/China/N/2005(H9N2)(简称N株),由本室从华东地区某发病鸡群中分离保存。
H9亚型禽流感灭活油乳苗购自扬州威克生物工程有限公司。
1.1.2菌株、细胞和质粒减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,DH5A宿主菌,COS-7细胞株由本室保存。
pCR2.1-T载体购自Invitrog en公司。
真核表达质粒pm cDNA3.1+由本室构建182。
1.1.3主要试剂限制性内切酶K p nÑ、X hoÑ, Taq DNA聚合酶,T4DNA连接酶,RNA酶抑制剂均购自宝生物工程(大连)有限公司。
Trizo l Rea-g ent试剂,转染试剂Lipofectam ine2000购自In-v itro gen公司。
M-M LV反转录酶购自Pro mega公司。
QIA GEN Plasm id M ini Kit购自Qiagen公司。
FIT C标记兔抗鸡IgG荧光二抗及H RP标记的羊抗鸡IgA酶标二抗购自Sigma公司。
鸡H9N2 AIV抗血清为自制。
1.1.4实验鸡和鸡胚1日龄商品代伊莎褐蛋鸡购自江苏省无锡市养鸡场集团公司。
9日龄SPF鸡胚购自扬州威克生物工程有限公司。
1.2方法1.2.1H A基因的RT-PCR扩增与克隆参照GenBank中已发表的H9N2亚型禽流感病毒H A 基因序列,设计一对引物:P1:5-CAA G GTA CC CA-CAACCACT CAAGAT GRAA-3(K p nÑ)P2:5-AT T CT CGAG GCCAAT TAT ATACAAAT GTT G-3(X hoÑ)按T rizol试剂盒说明书抽提N株AIV基因组RN A作为模板。
利用上、下游引物以AIV基因组RN A为模板进行RT-PCR。