柯萨奇病毒的RT-PCR试验

PCR 注意事项
? PCR关键环节 ? ①模板; ? ②引物; ? ③酶 dNTP; ? ④循环条件 ; ? 寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板
1、杂质蛋白质；特别是染色体中的组蛋白； 2、Taq酶抑制剂； 3、在提取制备模板时丢失过多； 4、模板核酸变性不彻底； 5、模板降解。
RT-PCR 的关键步骤是在 RNA的反转录，要 求RNA模版为完整的且不含 DNA、蛋白质等 杂质。
? 逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反 应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR 中， 由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作 “逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转 录酶）来完成。一条RNA链被逆转录成为互补 DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。
? 1、减少酶量，或调换另一来源的酶； ? 2、减少dNTP的浓度。适当降低 Mg2+浓度。增加模
板量，减少循环次数；
? 3、减少模板量。
如何避免污染
? 严格分区：标本处理区与PCR扩增区、产物分析区，要有 一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：体 系配制→ 标本制备→PCR扩增→产物分析→产物处理。
柯萨奇病毒 (Coxsackie virus ，CV ) 的诊断方法：
? 病毒分离、动物接种 操作烦琐, 成功率低, 影响诊断的敏感性；
? ELISA 法 检测患者血清中相应的特异性 IgM 、 IgG抗体, 但不 能获得有关病毒更多的信息；
? RT - PCR 法 既可以通过检测病人样本中的病毒 RNA 来明确诊断 , 也可以通过进一步的测序来分析病毒流行株特定序 列, 为基因分型提供依据。
两端为保守的非编码 区，中间为编码区。 5'端共价结合一小分 子蛋白质Vpg（约
7kDa），与病毒RNA 合成和基因组装配有 关；3'端带有polyA
尾。编码区编码的病 毒结构蛋白VP1～ VP4，VP1、VP2和 VP3均暴露在病毒衣 壳的表面，有中和抗 原位点；VP4位于衣
壳内部，一旦病毒 VP1与受体结合后， VP4即被释出，衣壳 松动，病毒基因组脱 壳穿入。
? 试剂：引物和探针尽量分装，不要原瓶多次取用。 ? 加样：原则是模板最后加，其他试剂按照体积从大往小的
加。操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓 冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作， 避免污染，又可以增加反应的精确度。
? 耗材：使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混 用；
柯萨奇病毒的RT-PCR实验室诊断
柯萨奇病毒
? 属于小ＲＮＡ病毒科肠道病毒属，最易在灵长类动物细胞中生长。 ? 病毒分为Ａ、Ｂ两组。柯萨奇病毒Ａ组有２３个血清型，柯萨奇病毒
Ｂ组有６个血清型。
?单股正链RNA，全长大约7.4Kb，病毒直 径为25～30nm，球形，无包膜，病毒衣壳 由VP1-VP等4 构成，呈20面体立体对称。
? PCR产物：机器运行完后，取出PCR产物时不能随便丢弃， 应该用塑料手套或其他打结包好后丢入垃圾桶。
? TRIZOL法提取核酸 ? RT-PCR 法检测柯萨奇病毒（两步法）
? 逆转录（RT） ? 聚合酶链反应（PCR） ? PCR产物的检测和鉴定
? 引物：CVB3的3D基因引物
? TRIZOL法提取核酸
5min 15sec 20sec 20sec 10min 保存
×35cycles
? PCR产物的检测和鉴定
1）取100ml电泳缓冲液（1×TAE ）加入到干净的三角瓶中，再加入1.7g琼 脂糖粉末，轻轻摇动三角瓶，是琼脂糖微粒呈均匀混浊状态。
2）微波炉加热使琼脂糖熔化。 3）熔化的琼脂糖自然冷却到60℃左右，加入5ul溴化乙锭（EB），混匀后
? Real Time RT-PCR
– Sensitive and specific – Reagent and equipment costs are a factor – High throughput
RT-PCR实验程序：标本的采集、标本RNA的提取、引物、RT-PCR反应体系、 温度循环参数、琼脂糖电泳、凝胶成像、结果判定及序列测定
? 退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异 性扩增效率，退火温度过高影响引物与模板的 结合而降低 PCR扩增效率。
出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其 原因往往由于酶量过多或酶的质量差， dNTP浓度 过高， Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数 过多引起。其对策有：
cDNA于-20℃ 冰箱冻存。
? 聚合酶链反应（ PCR） 配液： 25ul 体系
2×mix PrimerA(100ug/ml) PrimerS(100ug/ml) cDNA ddH2O
12.5 × 1ul × 1ul × 1ul× 9.5ul×
? 反应程序：
95℃ 95℃ 60℃ 72℃ 72℃ 4℃
? PCR反应系统的组成：
⑴耐热 DNA 聚合酶（ Taq 酶）：这是由耐热水生细菌 体内提取的一种 DNA聚合酶。
⑵模板DNA：即待分析的目的 DNA，其长度不宜大于 10kb。
⑶两种引物：为了保证 DNA聚合酶能够对两条互补链 均能进行延伸，需要两种引物，分别位于两条互补 模板DNA链的3`-端。
? 一步法：反转录 PCR在一个管子里完成，得到 的全部 cDNA产物都一起经 PCR扩增，灵敏度 更高。
? 两步法：反转录和 PCR分开，灵活而且严谨， 但灵敏度不如前者高。
RNA操作注意事项
?全程戴手套 ? 灭菌、清洁的塑料管或无 RNA酶的玻璃制品 ? 高压带滤芯枪尖 ? RNA提取试剂要保证无 RNA酶 ? 所有试剂开盖时要标明日期 ? 在RNA提取、RT-PCR和测序过程中使用无 RNA 酶水 ? 操作快捷，提取后的 RNA应放在-70度 ? 备有冰盒，全程中保持 RNA在低温状态下 ? 避免反复冻融 RNA，防止RNA降解。

倒入已准备好的胶床中，凝胶厚度约为0.3－0.5cm。
4）室温下静置，凝胶固化。拿出已经做好的胶，将带凝胶的胶床置于电泳 槽中。
5）向电泳糟中加入电泳缓冲液（1×TAE），缓冲液的量以超过凝胶表面12mm为宜。
6）核酸样品5ul中加入大约1ul的6×loading buffer，用加样器轻轻混合均匀。 7）用加样器吸取样品，轻轻加入到凝胶的样品孔中。 8）根据指示剂（溴酚蓝）迁移的位置判断是否终止电泳，如可以终止，则
Mg2+ 酶
? Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对 PCR扩增效率影响很 大，浓度过高可降低 PCR扩增的特异性，浓度过 低则影响PCR扩增产量甚至使 PCR扩增失败而不 出扩增条带。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用， 以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
物理原因
? 变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低， 变性时间短，极有可能出现假阴性 ;
⑷四种脱氧核糖核苷酸：用作底物的 dNTPS。
⑸缓冲溶液：保证 DNA聚合酶催化时所需的适当的溶 液pH值
? PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与 靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三 个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后， 使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成 为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单 链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列 配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA 聚合酶的 作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与 半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留 复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的 “半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。 每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因 扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决 于样品中模板的拷贝。
1）取250ul病毒悬液加到1.5ml离心管中，然后加入750ul TRIZOL溶液，混 匀5秒后离心。
2）加入200ul 氯仿溶液，充分混匀5秒钟 3）室温放置10分钟后，10000RPM，室温离心20分钟 4）将上清液转移到一支新的1.5ml离心管中 5）再加入500ul异丙醇溶液，摇匀10秒钟 6）室温静置至少15分钟 7）14000RPM，4℃离心25分钟 8）倒掉上清液，加入950ul冰冷的70%乙醇 9）14000RPM，4℃离心20分钟 10）用吸尖小心吸出上清液倒掉 11）室温干燥后加入15ul dH2O，-70℃保存
切断电源取出凝胶。
9）凝胶成像仪观察电泳条带，保存记录。
1：逆转录 30min所得模板； 2：逆转录 30min所得模板稀释 100倍； 3：逆转录 15min所得模板； 4：逆转录 15min所得模板稀释 100倍； 5：Marker ；6 ：阳性对照； 7：阴性对照； 8：空白对照。
谢谢观看！ 2020
Types of RT-PCR Reactions
? Standard RT-PCR usually with one-step (recommended)
– Sensitive and specific
? Nested PCR
– More sensitive than standard – Contamination is a major problem – Only for very experienced labs
? 逆转录（RT）
配液：RNA 3μl （1μg）
随机引物 1μl
加水至10μl
混匀，瞬时离心， 70℃ 5min
立即冰水浴，瞬时离心，依次添加下列试剂
M-MLV Buffer 5 × 4μl
dNTP 10mM
1μl
M-MLV 200U/μl
1μl
加水至 20μl ，混匀，瞬时离心，
42℃ 15min；95℃ 5min；4℃ 维持。
引物
? 引物质量、浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败 或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引 物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低， 造成低效率的不对称扩增，对策为：
? ①选定一个好的引物合成单位; ? ②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂
糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮 度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此 时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一 条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。 ? ③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰 箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。 ? ④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚 体等。