DC细胞和调节性T细胞研究新进展培训课件

CD195(CCR5)
MIP-1αβ, RANTS
CD196(CCR6)
MIP-3 α
CXCR1
IL-8
CD184(CXCR4)
SDF
成熟DC
CCR7
MIP-3 beta, SLC(6Ckine)
部分树突细胞表型分析Marker
MHC II
++++
+++
Endocytosis
++++
-
CD54
+
+++
胞内细胞因子标记
BD Pharmingen™ Intracellular Cytokine Staining Reagent
(using BD Pharm Lysis Buffer, Cat.No.555899
Cytofix/Cytoperm Cat.No.555028)
Human IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6,
50T 552598
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举例1：MDDC胞内因子COX分析
LPS炎性刺激诱导未成熟MDDC大量表达COX-2，而成熟MDDC 组成性表达COX-2
COX-1
Inmature MDDC
LPS unstim.
isotype
% Positive MFI
FL3-H or NI -RA
1 2 3 4 56 78 9
A
B C
2
D
E
F
G
H
I
FL4 -
Cytometric bead array 检测 Ly49Q+和Ly49Q– 小鼠类浆细胞 前体DC分泌细胞因子的能力
(Omatsu Y, Iyoda T, Kimura Y et al. J. Immunol. 2005 )
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小鼠DC分型
Splenic dendritic cells (DCs) express B7-DC (Nguyen, L.T., et al.. 2002.J. Exp. Med.)
名称 Anti-mouse B7-DC (CD273) PE Rat IgG2a, κPE isotype control anti-mouse CD11b FITC anti-mouse CD11c APC CD45/B220 PerCP Anti-mouse IFN-PE
• 活化DC上调CD40 、CD80 、CD86
人外周血树突细胞髓系和淋巴系亚群分析 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
• 人外周血DC主要分为CD123+和CD11＋亚群
3-color assay lin 1 FITC (Cat No. 340546)、CD123 PE (Cat No. 554529)、CD11C PE (Cat No. 555392)、Anti–HLA-DR PE-Cy5 (Cat No. 555813)、Mouse IgG1 PE (Cat No.555749)、Mouse IgG2a PE (Cat No.555574) 4-color assay lin 1 FITC、CD123 PE 、CD11c APC (Cat No. 559877)、 Anti–HLA-DR PerCP、Mouse IgG1 PE 、Mouse IgG2a APC (Cat No.555576)
IL-8,IL-10, IL-12p40/p70, IL-12p70, IL-13, IL-16, GM-CSF, GRO-α, IFN-γ, IP-10, MCP-1, MCP-3, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, TNF-α, TNF-β
Mouse IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6,
BDTM CD86/CD209 /CD83 组合
CD209 PE
Cat.No. 551265
CD86 PE-Cy5 Cat.No. 555659/555666
CD83 APC
Cat.No. 551073
CD14 Alexa Fluor 488 (Cat. No. 557700)
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• 激活静息型T 细胞 • 捕获抗原 • 迁移至淋巴组织和呈递
抗原给T细胞
向淋巴滤泡迁移形成滤泡DC
• 至初级抗体应答后，滤泡树突细胞 表面形成大量的抗原抗体复合物
• 形成一个抗体蓄水池，维持对记忆 型B细胞持续刺激
IL-3
CD11c- 淋巴系DCs 类浆细胞(plasmacytoid) DCs
• 快速分泌IFN-a • 初级免疫
59%
48
52%
38
文举档仅例供参2考：，不能外作为周科学血依据D，C请勿和模仿M；如D有D不C当之对处，L请P联S系应网站或答本人产删除生。 IL-12
unstimulated
0.01%
LPS
3.9%
IFNg+LPS
15.7%
外周血DC
10 0
10 1
10 2
10 3
10 4
10 0
10 1
10 2
DC的获取和培养
• CD34+祖细胞
位于骨髓、脐带血和成年人外周血中，在细胞因子如GM-CSF、TNFα培养条件下可以发育为DC
• 外周血CD14 + 单核细胞
在GM-CSF 和IL-4 的条件下可以分化发育成DC，现多采用，主要因 为取材广泛、培养方便
• 外周血中CD34-前体细胞
可以诱导出大量的DC，具有成熟DC所有的特征
10 3
10 4
CD11c APC
0.01%
1.4%
10 0
10 1
10 2
10 3
10 4
11
10 2
10 3
10 4
10 0
10 1
10 2
10 3
10 4
IL-6 FITC
10 0
10 1
10 2
10 3
10 4
举例3：CBA检测DC细胞因子 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
99%
43
99%
42
COX-2
LPS unstim. isotype
% Positive MFI
54%
71
0.25%
29
COX-1
Mature LPS MDDC
unstim.
isotype
% Positive MFI
98%
48
98%
50
COX-2
LPS unstim. isotype
% Positive MFI
IL-12p40/p70, IL-17, IFN-γ, MCP-1, MDC (ABCD-1), TNF-α
BrdU流式检测
Description
Size Cat.No.
BD Pharmingen™ BrdU Flow Kit (FITC)
50 T 559619
BD Pharmingen™ BrdU Flow Kit (APC)
成熟DC
DC的分化过程 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
CD34+骨髓前体细胞
单核细胞
CD14-幼稚型DC
淋巴系统
GM-CSF 和TNFa ± IL-4 典型DC
成熟
TNFa
间质 DC
Langerhans DC
•激活静息型CD4和CD8 T细胞 •诱导静息型 B细胞分化成分泌 抗体的浆细胞
居住在淋巴组织T细 间隙腔里面
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成熟和未成熟DC比较
部分胞内细胞因子及其受体
受体
配体
未成熟DC
CD191(CCR1)
MIP-1α. RANTEC,MIP-3,MIP-5
CD192(CCR2) CCR4
MCPs TARC.MDC
P plasmacytoid DC M myeloid (conventional) Mat mature DC imm immature >表达高于
人类DC分析相关Marker 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
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CD1a 抗原呈递
DC的起源和分类 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
• 小鼠体内DC根据其起源、功能和分布情况 主要分为髓系DC和淋巴系DC两种，分别 用CD11b和CD45R/B220区分
• 人体DC至少可以分为与小鼠类似的两群： DC1和DC2
• 外周血前体细胞可分为来源于外周血单个 核细胞的前体细胞pDC1和来源于血液或者 扁桃体的类浆细胞的前体细胞pDC2
DC功能分析
DC功能分析主要包括胞内外细胞因子检测和混合淋巴细胞刺激反应
胞内流式：胞内细胞因子： BD Cytometric Beads Array (CBA)：胞内外细胞因子 同种混合淋巴细胞刺激反应(Allo-MLR) ：用细胞因子流式法结合BrdU掺入法检 测DC刺激同种异体T细胞的能力 同源的抗原特异性T细胞的刺激能力：同上
CD80
+
+++
CD86
+
+++
CD58
+
+++
CD40
+
++
CD83
+
++
CD191(CCR1)
++++
+
CD195(CCR5)
++++
+
CD196(CCR5)
++++
+
CD197(CCR7)
+
+++
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DC的表型分析
体外培养的MDDC (Monocyte derived DCs) 表型分析
• DC激活巨噬细胞、NK细胞、NK-T细胞和嗜碱性粒细胞引发自然 杀伤反应
• 淋巴系DC通过快速分泌IFN-α和IFN-β对特定病毒产生应答
• DC与Th细胞的关系
DC1 IL-12 pDC2 发育 DC2
促凋亡 IL-12 (+) CD40/ IFN-γ(-)
Th1
Th0 Th2 IL-4 未成熟DC
举例4：MDDC的同种混合淋巴细胞刺激反应 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
IFNg
Unstimulated allo-PBMC
1:1 DC:allo-PBMC
1:5 DC:allo-PBMC
1:25 DC:allo-PBMC
IL-2
小鼠DC研究相关Marker 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
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人DC分类
• 髓样DC(MDC)
–不表达lin(CD19、CD20、CD56、CD14、CD3) 但高表达HLA-DR及CD11c;
• 浆细胞淋巴样DC(PDC)
–不表达lin(CD19、CD20、CD56、CD14、CD3) 高表达HLA-DR及CD123.
人外周血DC1和DC2的鉴定 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
4-Color Assay
R3: lin-HLA-DR-CD123+ 嗜碱性粒细胞 R4：lin-HLA-DR+CD123+ 淋巴系细胞DC（DC2） R5：lin-HLA-DR+CD11C+ 髓系DC（DC1）
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树突细胞篇
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树突细胞（Dendritic Cell；DC）
树突细胞根据其独特形态而得名, 是目前功能最强大 的抗原递呈细胞(APC)
体内
体外
IL-2 IL-4
• 高度纯化的乳铁蛋白阳性的终末期中性粒细胞的前体细胞
加入GM-CSF、IL-4和TNF-α可形成DC 样细胞
• 白血病细胞
成功诱导出DC, 具有较强的刺激混合淋巴细胞反应能力
货号 557796 554689 553310 / 557396 550261 553093 554412
DC的生物学特征 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
• DC主要激活静息型Tcell, 也可诱导繁殖型T细胞激发获得性免疫
• Diaz-de-Durana et al. (Blood.2006)等发现 DC与B细胞之间通过 BLys激活B细胞和嵌合的Fc-TACI蛋白信号促使DC成熟
定量分析
APC与T细胞 间作相互用
IFNg TNFa
细胞因子分泌
增殖/死亡
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树突细胞膜表面分子
Important surface molecules of DC
黏附分子 CD83
CD11c
MHC-II
CD80/86
CD40