BDSMARTRACE中文使用说明书

BD SMART™ RACE cDNA Amplificatin Kit User Manual
Table f Cntents
I. 简要概述
II. 成分列表
Cntrl Human PlacentalTtal RNA 和BD SMART II A lignucletide在–70°C下保存。

NucleTrap Gel Extractin Kit 室温下保存。

其余试剂–20°C下保存。

随BD SMART RACE cDNA Amplificatin Kit 同时免费提供BD PwerScript Reverse Transcriptase和BD Advantage 2 PCR Kit。

所有试剂可以满足7 次cDNA 合成反应和30次PCR反应。

First-strand cDNA 合成
•7µl BD SMART II™ A lignucletide (12 µM)
5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG–3'
• 7µl 3'-RACE CDS Primer A (3'-CDS; 12 µM)
5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30V N–3'
(N = A, C, G, r T; V = A, G, r C)
• 7µl5'-RACE CDS Primer (5'-CDS; 12 µM)
5'–(T)25V N–3' (N = A, C, G, r T; V = A, G, r C)
• 7µl BD PwerScript™ Reverse Transcriptase
• 200 µl 5X First-Strand Buffer
250 mM Tris-HCl (pH 8.3)
375 mM KCl
30 mM MgCl2
• 200 µl Dithithreitl (DTT; 20 mM)
• 1ml Deinized H2
5'- & 3'-RACE PCR
• 400 µl 10X Universal Primer A Mix (UPM)
Lng (0.4 µM):
5'–CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT–3' Shrt (2 µM):
5'–CTAATACGACTCACTATAGGGC–3'
• 50 µl Nested Universal Primer A (NUP; 10 µM)
5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT–3'
Cntrl Reagents
• 5µl Cntrl Human Placental Ttal RNA (1 µg/µl)
• 25 µl Cntrl 5'-RACE TFR Primer (10 µM)
• 25 µl Cntrl 3'-RACE TFR Primer (10 µM)
General Reagents
• 70 µl dNTP Mix (dATP, dCTP, dGTP, and dTTP, each at 10 mM)
• 2 X 1 ml Tricine-EDTA Buffer
10 mM Tricine-KH (pH 8.5)
1.0 mM EDTA
NucleTrap® Gel Extractin Kit (Cat. N. 636053 r K3070-y)
• 100 µl NucleTrap Suspensin
• 3 ml NT1 Buffer
• 10 ml NT2 Buffer
• 2ml NT3 Buffer
• User Manual (PT3169-1)
Free trial-size BD Advantage™ 2 PCR Kit (Cat. N. 639207 r K1910-y)
The BD Advantage 2 kit prvides sufficient reagents fr 30 PCR reactins.
The fllwing cmpnents are included:
• 30 µl50X BD Advantage 2 Plymerase Mix
• 200 µl10X BD Advantage 2 PCR Buffer
• 50 µl 50X dNTP Mix (10 mM each)
• 30 µl Cntrl DNA Template (100 ng/µl)
• 30 µl Cntrl Primer Mix (10 µM each)
• 1 ml PCR-Grade Water
• User Manual (PT3281-1)
III. 另备物品
下列试剂需另外准备：
• 0.5-ml PCR 反应管，推荐使用PerkinElmer GeneAmp 0.5-ml reactin tubes (Cat. N. N801-0737 r N801-0180).
• Mineral il (e.g., Sigma Cat. N. M-3516)
IV. BD SMART RACE的要点
使用前请全面阅读
•所有参数均经过优化，但可能因所使用的酶、模版、引物和热循环仪而不同。

因此应使用Cntrl Human Placental Ttal RNA和Cntrl 5'- and 3'- RACE TFR Primers进行预实验。

•RACE PCR的效率取决于试验样品RNA中mRNA的丰度。

另外退火温度和延伸温度也依引物不同而变化。

请参照第X节的建议优化PCR的条件。

•在进行5'-RACE and 3'-RACE PCR时必须使用热启动。

本手册已经过优化，所使用的BD Advantage 2 Plymerase Mix中包含BD TaqStart 抗体用于自动进行PCR的热启动(Kellgg et al., 1994)。

也可以手动(D’Aquila et al., 1991).或使用蜡珠(Chu et al., 1992)来进行热启动。

•推荐使用试剂盒中提供的Tricine-EDTA缓冲液稀释和重悬DNA样品。

Tricine缓冲液在高温下较Tris-based缓冲液有更好的缓冲能力。

Trisbased 缓冲液会导致pH降低，引起DNA的降解。

•整个过程要戴手套以防核酸酶污染。

• 重悬过程（包括吸入和吹出溶液）要轻缓，短暂离心使所有成分聚集管底。

• 无特别标示，所有操作均应在冰上进行。

• 聚合酶在最后加入。

• 使用推荐的酶加入量，该量已经过特别的优化。

• EB是致癌物质，小心处理和使用。

V. 引物设计
A. 引物序列
特异引物(GSPs) 应当：
• 23–28 个核苷酸
• GC含量为50–70%
• Tm 大于或等于65°C，如果Tm >70°C可获得最好的结果(可使用降落PCR)。

模版、引物及RACE产物如图3所示。

至少需要两个特异引物才能进行完整的BD SMART RACE：即用于5'-RACE PCR的反义引物和用于3'-RACE PCR的正义引物。

如果只进行5'- 或3'-RACE则只需一个特异引物。

引物长度在23–28个核苷酸，长于30个核苷酸没有优势。

如图3所示，两种引物的5'- and 3'-RACE扩增产物存在部分重叠，如果在重叠区有一个合适的限制性酶切位点，可以通过酶切和连接反应可以得到cDNA的全长。

将两个引物设计成其RACE产物有100–200-bp的重叠的形式，就能够配合使用作为PCR反应的阳性对照。

引物并非一定要设计成获得重叠片断的形式。

对于大或稀有cDNAs，引物最好要设计的尽量靠近cDNA的末端，不产生重叠。

此外，引物自身可以重叠（如互补）。

特异引物GC含量为50–70% ，其至少65°C。

使用nearest neighbr 分析(Freier et al., 1986; 我们使用Primer Premier软件来计算Tm’s) Tm.应尽可能大于70°C。

根据我们的经验，长引物的退火温度高于70°C 特别从困难的样品中可以得到强的RACE扩增。

Tm’s 超过70°C 可以使用降落PCR。

此外GSP1和GSP2设计成具有相似的Tm’将更有利于使用。

通过计算或试验能够得到GSP1和GSP2的Tm’s。

要避免使用内部互补的引物或引物之间互补的引物，尤其在引物的3'末端互补。

注意：不要将酶切位点都合并到5'和3'特异引物的5'末端，根据我们的经验，这些额外的序列将会增加反应的背景。

Figure 3. The relatinship f gene-specific primers t the cDNA template.
B. 引物在基因上的位置
尽管我们使用BD SMART RACE Kit成功地得到了大于6.5 kb扩增产物，但为了使你的5'-和3'-RACE 产物达到2 kb，建议对引物加以筛选。

C. 降落PCR
我们发现降落PCR (Dn et al., 1991; Rux, 1995)明显增加BD SMART RACE扩增的特异性。

降落PCR的
退火温度符合首次PCR循环的Tm 高于通用引物的Tm 。

如果你的特异引物Tm，在这些循环中将只有与基因特异性结合的引物发生聚合，从而积累一定量的特定产物。

退火温度在随后降低到与通用引物相配合的程度，引起特异性基因模版的指数和高效率的扩增。

当你的引物的T m>70°C时我们推荐使用降落循环程序。

D. 巢式引物
在首次试验时，不要使用巢式PCR。

混合的通用引物（UPM）和基因特异引物（GSP）通常能得到较好的低的非特异性背景的RACE产物。

但是，巢式特异引物可以作为探针在鉴定RACE产物的Suthern bltting中使用。

此外巢式PCR在使用特异引物进行5'- r 3'-RACE存在高背景或高非特异性扩增时有必要使用。

在巢式PCR中，使用外侧引物进行一个初步的扩增，如果扩增产物模糊不清，可以使用内部引物重新扩增初步产物的一部分。

BD SMART RACE 指南包括了可选的步骤，指明了巢式引物能够被使用的地方。

本试剂盒提供的通用巢式引物A 可用于5'- and 3'-RACE。

按照上述指南可以设计巢式特异引物。

巢式引物与外侧特异引物尽可能不重叠，如果因序列有限而必须重叠，其内部引物的3'末端的序列也要尽可能唯一。

VI.总RNA 和Ply A+ RNA的制备
A. 总的预防
影响cDNA合成质量的首要因素就是总RNA和ply A+ RNA的完整度和纯度。

下述预防措施可使你避免RNA的降解和污染。

• 戴手套
• 直接使用新鲜去离子水，没有用DEPC 处理。

.
• 用0.5 N NaH漂洗所有的玻璃器皿，160–180°C烘烤4–9 hr.
• 使用一次性吸管吸头.
B. RNA 分离
BD Bisciences Clntech 提供几种试剂盒用于RNA分离和纯化，如NucleBnd® RNA/DNA Mini Kit (Cat. N. 635945)。

C. RNA 分析
推荐使用变性甲醛琼脂糖电泳检测RNA 样品。

哺乳动物的总RNA 展示为两条4.5 和1.9 kb的带，分别对应28S 和18S 核糖体RNA，它们之间的亮度比率约为1–2:1。

哺乳动物的Ply A+ RNA 会产生0.5–12 kb 的弥散带，亮度较核糖体RNA带弱。

Size distributin may be smaller with nnmammalian tissue surces.
VII. cDNA 的第一链合成
如下所述，两个10-µl的反应可以将50 ng–1 µg 总RNA 或ply A+RNA转换成用于RACE的cDNA的
第一链。

我们推荐尽量使用ply A+ RNA。

但是如果总RNA的量少于50 µg，则不宜进行ply A+RNA 的纯化，否则最终产量很小将会影响分析RNA数量和质量。

为获得最好的试验结果，可以使用1 µg 的ply A+ RNA或1 µg 的总RNA 。

我们强烈推荐使用包括Human Placental Ttal RNA 在内的试验样品进行阳性对照cDNA 的合成。

该cDNA将会被用于阳性对照的RACE反应。

1. 在0.5-ml 微型离心管中加入下列试剂：
*取1 µl 的Cntrl Human Placental Ttal RNA (1 µg/µl)作为对照合成。

2.加入消毒水至终体积为5 µl 。

3. 混合并在小型离心机上短暂离心。

4. 70°C 下温育2 min。

5. 迅速在冰上冷却2 min。

6. 短暂离心使成份聚集管底。

7. 在每个反应管中再加入下列试剂（已有5 µl体积）：
2 µl 5X First-Strand Buffer
1 µl DTT (20 mM)
1 µl dNTP Mix (10 mM)
1 µl BD PwerScript Reverse Transcriptase
总体积为10 µl
8. 小心混合管内组分。

.
9. 短暂离心使成份聚集管底。

10. 42°C 下温育1.5 hr。

注意: 使用水浴或热循环仪会由于蒸发作用而降低反应液的体积，由此降低第一链的合成效率。

11. 使用Tricine-EDTA 缓冲液来稀释反应产物：
• 如果以<200 ng的总RNA开始反应，可加入20 µl来稀释。

• 如果以>200 ng的总RNA开始反应，可加入100 µl来稀释。

•如果以ply A+ RNA开始反应，可加入250 µl 来稀释。

12. 72°C下加热管7 min。

13.所得产品可以在–20°下保存3个月。

到此你已经得到了用于3'- 和5'-RACE的cDNA 样品。

这些产物的量足以用于后期的RACE反应，如果使用LD PCR 构建全长cDNA ，请在此留出足够的产物用作膜板。

VIII. PCR 的阳性对照试验
在用样品cDNA进行5'- 和3'-RACE之前，我们强烈推荐使用来自于Cntrl Human Placental 总RNA 的cDNAs进行阳性对照RACE PCR 反应。

这些反应将会扩增铁转运蛋白受体(TFR) cDNA。

该程序会为你确认BD SMART RACE的正确工作节省可观的时间。

将来一旦有问题出现，本对照试验将有助于你确认问题是发生在RACE PCR（如不同的循环仪）还是cDNA 。

我们推荐使用提供的BD Advantage 2 Plymerase Mix进行首次BD SMART RACE PCR反应。

如果你的cDNA的GC含量比较高，可以使用BD Advantage™ GC 2 Plymerase Mix (Cat. N.
639114) 或PCR Kit (Cat. Ns. 639119 & 639120)。

fr subsequent analysis. Fr
applicatins in which the highest fidelity prduct is desired, the BD Advantage™
HF 2 PCR Kit (Cat. Ns. 639123 & 639124) can amplify templates up t 3.5 kb.
Fr mre infrmatin, see Sectin XI (Trubleshting Guide).
1. 为所有的PCR反应和1 个额外的反应准备足够的主混合液。

对于每个50-µl PCR反应，混合下列试剂：
34.5 µl PCR纯度的水
5 µl 10X BD Advantage 2 PCR Buffer
1 µl dNTP Mix (10 mM; in BD SMART RACE 或BD Advantage
2 PCR Kit)
1 µl 50X BD Advantage
2 Plymerase Mix
总体积为41.5 µl
2. 旋涡混合(无泡沫产生), 短暂离心。

3. 按表2进行PCR反应的准备，按顺序在0.5-ml PCR 管中加入各种成份，轻柔混合。

4. 每管加入2滴矿物油覆盖，加盖。

注意: 如果使用热盖循环仪则可以不用矿物油。

5. 按下列程序启动触减式PCR
6. 每样取5 µl在1.2 % 琼脂糖凝胶上进行电泳分析。

其余45 µl 保存在–20°C。

理想的试验结果(泳道2 和 5 所示)：5'-RACE对照应当产生一条2.6-kb 带，3'-RACE对照反应应当产生一条2.9-kb 带。

如果没有观察到这些带出现，将各PCR反应管重新放回到循环仪中，再进行5次循环。

如果仍然没有期望的带出现，参照第XI节的疑难解答。

一定要在阳性对照反应能够在42个或更少的循环次数内(5 cycles annealing at 72°C + 5 cycles at 70°C + 32 cycles at 68°C).产生了很明显的单条正确的产物带之后再使用试验引物和cDNA进行正式的试验。

Figure 4. 5'- and 3'-RACE sample results.
本试验使用总RNA进行RACE的反应结果：
Lanes 1 & 4：干扰素受体
Lanes 2 & 5: 铁转运蛋白受体
Lanes 3 & 6: HPRT.
2和5道的RACE产物的大小为2.6 kb和2.9 kb。

铁转运蛋白受体的3'-.RACE （5道）会偶尔产生一条0.6-kb 的产物
IX. cDNA 末端的快速扩增(RACE)
本部分描述了利用5'-RACE 和3'-RACE PCR 反应得到5' 和3' cDNA 片段. 正式试验前请按照第八节所述进行阳性对照试验。

虽然随盒提供了Nested Universal Primer A(NUP)，但在BD SMART RACE 反应中不是一定要进行巢式PCR。

所有的RACE PCR 反应都用BD Advantage 2 Plymerase Mix进行了最优化处理。

PCR 反应混合液的准备：确保混合液体积足够所有的PCR反应和一次额外的反应。

该混合液用于5'- 和3'-RACE 反应。

对于50-µl PCR 反应，所混合的成份如下：2. 旋涡混合(不要产生气泡), 短暂离心。

3. 对于5'-RACE: 按表III准备PCR反应；
对于3'-RACE: 按表IV准备
在0.5-ml PCR 管中按顺序加入所有成份，轻柔混合。

* 如果RNA是非人类的，可以跳过此步
† 如果特异引物不产生重叠可以跳过此步。

有关对照反应的细节参照第XI节.
* 如果RNA是非人类的，可以跳过此步
† 如果特异引物不产生重叠可以跳过此步。

有关对照反应的细节参照第XI节.
4. 每管内覆盖2滴矿物油，加盖。

Nte:.如使用热盖循环仪则不必加矿物油。

5. 使用下列程序之一启动循环仪，(prgrams 1 和2 用于5'- 和3'-RACE TFR
和UPM Primers的阳性对照)。

依据所使用的是ply A+ 还是总RNA来选择正确的循环次数。

* 如果扩增的片段长度>3 kb ，则每增加1 kb延长1 min。

6. [可选] 如果本次PCR 反应没有产生目的带或产生的是弥漫带，可以用Suthern
blt 来验证：
a. A cDNA prbe
b. A nested primer as a prbe
或者，可以使用NUP 引物和NGSP进行“巢式”PCR：
a. 取上述PCR产物5 µl用245 µl Tricine- EDTA缓冲液稀释。

b. 重复上述步骤1–5 ：
•用5 µl 稀释过的初级PCR 产物代替用于RACE的cDNAs。

• 加入NUP 引物1 µl 、巢式特异引物1 µl 。

• Prgram 2的循环为15–20 次。

X. RACE 产物的鉴定
RACE 产物的鉴定使用3种方法：(A) 对比用GSPs 和NGSPs得到的RACE产物；(B) Suthern bltting；(C) 克隆和测序。

A 和B 需要巢式引物。

A. 对比用GSPs 和NGSPs得到的RACE产物
对于5'-RACE 反应，将UPM Mix 和GSP1 得到的初级扩增产物与UPM 和NGSP1得到的扩增产物进行对比(对于3'-RACE，将UPM和GSP2 与UPM 和
NGSP2的扩增产物进行对比)。

当有多条扩增带时，巢式引物的扩增带应当稍小些，其中一些带应当
消失。

Nte: 不要使用Nested Universal Primer A (NUP)。

B. Suthern Blt Analysis
当RACE 产物有多条带时，用GSPs 或NGSPs制作探针进行Suthern blt 可以把握地确认真正的RACE 产物带。

通常5'-RACE 比3'-RACE易出现多条带。

1. 琼脂糖凝胶电泳检测RACE 产物。

2. 照相、转尼龙膜。

3. 准备探针，探针内不能有GSP1 (r GSP2)的序列。

可以将NGSP1 (r
NGSP2)进行末端标记。

如果GSPs的5' 和3'产物有重叠，则可以用GSP2 做探针鉴定5'-RACE产物，用GSP1 做探针鉴定3'-RACE产物。

使用cDNA进行缺口翻译或随机引物扩增都可以制作探针。

4.杂交、曝光、显影。

5. 与琼脂糖凝胶电泳照片进行对比。

6. 一旦得到了目的条带，使用NucleTrap Gel Extractin Kit进行胶回收，分离DNA。

C. RACE产物的克隆和测序
1. 使用NucleTrap GelExtractin Kit 进行RACE 产物的回收和纯化，直接克隆到T/A类型的PCR 克隆载体上。

2. 使用32P-标记的NGSP进行菌落杂交或从GSP处开始测序，验证克隆的插入。

对于5'-RACE产物，推荐至少挑取8–10单克隆，以便在5' 末端获得最大量的序列。

一旦确认克隆内含有最大的特异基因的插入子，就尽可能获取较多的序列数据。

可以得到完整RF以及5' 和3UTR。

ptins fr generating full-length cDNA
在对RACE产物进行部分或完全测序之后，用下述方法之一可以得到全长cDNA ：
1. 根据cDNA的5' 和3' 的末端序列设计引物，以用于5'-RACE 的cDNA为膜板，进行长距离PCR (LD PCR) 。

2. 克隆重叠性5'- 和3'-RACE 片段，借助重叠区内的限制性酶切位点得到全长。