Real-Time_PCR实验流程

Real-Time_PCR实验流程一、RNA 的提取详见 RNA 提取及反转录不同组织样本的 RNA 提取适用不同的提取方法，因为 Real-Time PCR 对 RNA 样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止 RNA的降解，保持 RNA 的完整性。

在总 RNA 的提取过程中，注意避免 mRNA 的断裂；取 2ug 进行 RNA 的甲醛变性胶电泳检测，如果存在 DNA 污染时，要用 DNase I 进行消化（因为在处理过程中 RNA 极易降解，建议体系中加入适量 RNA 酶抑制剂）。

二、DNase I 消化样品 RNA 中的 DNA用 DNase I 消化 DNA组份加量模板RNA 10ugRNase Inhibitor 4ulDNase I buffer 10ulDNase I 10ulDEPC 处理 H2O 至 100ul混匀，37℃ 90min三、RNA 琼脂糖凝胶电泳1．1的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制：1)称取琼脂糖 0.45g 放入三角瓶中，向其中加入 4.5ml 的10×MOPS 缓冲液和 39.5ml 的DEPC 水，放微波炉里溶化。

2)待冷却到 60 摄氏度左右时，加入 1ml 甲醛，摇匀（避免产生气泡）。

倒入凝胶板上凝固 30min。

2．取各个 RNA 样品 4l，加入6×RNA 电泳上样缓冲液 2l 混匀，加入变性胶加样孔中。

3．120V 电压下电泳 25min。

用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。

4．RNA 电泳结果如下图所示。

可见 28S 和 18S 两条明亮条带，无 DNA 条带污染。

四．RNA 反转录为 cDNA反转录程序以 MBI 的 M-MLV 为例组份加量20ul 体系加量40ul 体系模板RNA 0.12.5ug 3ug根据条带的亮度适当调整引物 T1850uM或其他引物 2.0ul 4.0ulDEPC 处理 H2O 至 12.5ul 至25ul混匀，70℃ 5min，立即冰浴5buffer 4.0ul 8.0uldNTP10mM 2.0ul 4.0ulRNase Inhibitor 0.5ul 1.0ul混匀，37℃ 5minM-MLV 1.0ul 2.0ul42℃ 60mi n ，70℃ 10min反转录引物的选择与 Real-Time PCR 引物设计的要求1）随机六聚体引物：当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长 mRNA。

用此种方法时，体系中所有 RNA 分子全部充当了 cDNA 第一链模板，PCR 引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。

通常用此引物合成的 cDNA中 96来源于 rRNA。

2）OligodT：是一种仅对 mRNA 特异的方法。

因绝大多数真核细胞 mRNA 具有 3端PolyA尾，此引物与其配对，仅 mRNA 可被转录。

由于 PolyARNA 只占总 RNA 的1-4，故此种引物合成的cDNA 比随机六聚体作为引物和得到的 cDNA 在数量和复杂性方面均要小。

特别适合检测多个基因的表达，这样可以节约反转录的试剂，cDNA 可以多次使用，可用于检测稀有基因是否表达、从极少量细胞中定量检测特定 mRNA 的表达水平。

3）特异性引物：最特异的反转录方法是用含目标 RNA 的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。

用此类引物仅产生所需要的 cDNA，导致更为特异的 PCR 扩增。

做 Real Time PCR 时，用于 SYBR Green I/Eva Green 法时的一对引物与一般 PCR 的引物，在引物设计上所要求的参数是不同的。

引物设计的要求：① Tm55-65℃② GC30-80③ PCR 扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-300bp 之间都可。

④ 引物的退火温度要高，一般要在60℃以上。

要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。

而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组 DNA 污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组 DNA 污染的影响。

至于设计软件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMER EXPRESS 都应该可以的。

做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。

对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不易。

五、cDNA 与引物质量检测取 0.2ml 薄壁 PCR 管，编号。

向各管中加入含染料2×PCR TaqMix10ul；加入正反向引物各 0.5ul（引物浓度 10uM) ，向管中加入混合的 cDNA 各 1ul。

各管补加水至 20ul。

组份加量2×PCRTaqMix 10ul10uMPrimer FW 0.5ul10uMPrimer RV 0.5ulTemplate DNA 1ulddH2O 混匀至 20ul 混匀，置于 TP600PCR 仪中。

95℃ 5min；95℃15s，60℃35s ，40cycles；72℃ 5min；4℃ pause。

取扩增产物各 8μl，DL2000 分子量标准 5μl/泳道。

1琼脂糖凝胶 120V 电压下电泳25min。

用凝胶紫外分析仪观察。

选择特异性好，扩增效率高的引物作为实时荧光使用引物。

六、利用相对定量的方法分析目的基因表达量的情况：由于 RNA 纯化后得率不同、RNA 反转录为 cDNA 的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，因此，在进行基因表达调控研究中都会用一些看家基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。

常用的看家基因有 beta-actin，GAPDH，18SrRNA 等。

因此，在做基因表达调控分析时至少要做两个基因，目的基因和一个看家基因。

七、定量 PCR 检测：取 0.2ml 薄壁 PCR 管，分别编号。

向各管中加入2×qPCR TaqMix12.5ul，10uM 各基因正反向引物混合物 0.5ul，对应的 cDNA 各 1ul。

一管中不加模板用作阴性对照。

各管补加水至 25ul。

组份加量模板cDNA/ddH2O 1.0ul10uM 引物F/R 0.5ul2×qPCR Mix 12.5ulddH2O 11.0ul 混匀，置于 SLAN 荧光定量 PCR 仪中。

95℃5min 预变性后，95℃15s→65℃35s（荧光检测），40cycles。

荧光定量 PCR 一般把退火和扩增设成一个温度，只在扩增出现问题时才会考虑设梯度。

八、扩增曲线和溶解曲线溶解曲线全部为单峰表明为特异性扩增。

一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期，其形状是一条平滑的 S 型曲线。

如果在荧光背景信号阶段出现很多拐点，可能的原因是体系未混匀或者存在固态杂质；如果向下探头后又很快抬头然后又向下探头，可能原因是体系中模板量太高，建议模板稀释后再用。

如果引物二聚体存在则阴性对照会出现抬头现象，这在 Real-Time PCR 中很难避免；若是阴性对照的溶解曲线出现和样品中同样的峰，说明体系配置中存在污染，则实验结果不可用。

在溶解曲线中出现双峰有三种可能：① 引物峰，引物峰通常是两峰中的前面一个，消除的办法是降低体系中的引物量或重新设计引物；②在做基因表达差异时容易出现 DNA 被扩增峰（只在引物跨内含子时存在），出现原因是提取 RNA 时存在 DNA 污染，可以通过电泳验证，这时要重新消化 RNA 样品中的 DNA；③ 扩增非特异，这时要重新摸扩增或重新设计并验证引物。

九、表达差异的计算方法绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本或是目标转录本在不同时相的表达差异之间的表达差异。

2-△△CT 方法是实时定量 PCR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法。

在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。

显然，我们说 X 基因在经过某种处理后表达量增加 2.5 倍比说该基因的表达从 1000 拷贝/细胞增加到 2500 拷贝/细胞更加直观。

2-△△CT 方法的推导（详见实时定量 PCR 和 2-△△CT 法分析基因相对表达量）补充：在 DNase I 消化样品 RNA 中的 DNA 后，需要对样品重新进行氯仿抽提，具体实验流程如下：消化后总体积 10Oul，体积太少，不利于抽提，我们往往补加 200ulDEPC 水。

1. 向离心管中加入等体积氯仿（约 300ul)，剧烈颠倒，充分混匀至中层出现白色片状沉淀。

4℃14000 rpm 离心 8min，取上清（约 250ul）。

2. 加入 1/10 体积的 NaAC（3M）（约 25ul）和预冷的等体积异丙醇（约 280ul），-20℃放置 20min。

3. 4℃14000 rpm 离心 15min，去上清，注意不要触到沉淀。

4. 加入 1ml 的 75乙醇，4℃14000rpm 离心 3min，去上清。

5. 瞬时离心，用 200ul（或 10ul）的头小心吸去离心管底的残存液态（勿吸到管底的沉淀）。

6. 把离心管放置于超净台晾至约 5-10 分钟（勿完全干燥，否则很难溶）。

加入 3050μl的无 RNase 的水，静止 1min 后，振荡 30sec，瞬时离心。

.m.m.m 荧光定量 PCR 完全攻略1、什么是定量 PCR以参照物为标准对 PCR 终产物进行分析或对 PCR 过程进行监测从而达到评估样本中靶基因的拷贝数称为定量 PCR.定量 PCR 的可行性定量一般是在 PCR 扩增的指数期进行的.2、定量 PCR 定量的理论依据是什么特定的待扩增基因片段起始含量越大则指数扩增过程越短当扩增速率趋于稳定后则无论原来样品中起始模板含量多少最终扩增片段的含量通常是一样的. 理想的扩增结果:YX2n其中 Y 代表扩增产物量 X 代表 PCR 反应体中的原始模板数 n 为扩增次数理论上 PCR 扩增效率为 100PCR 产物随着循环的进行成指数增长但实际上:DNA 的每一次复制都不完全即每一次扩增中模板不是呈 2 的倍增长实际应为:Y X1En其中 E 代表扩增效率:E 参与复制的模板/总模板通常E≤1E 在整个 PCR 扩增过程中不是固定不变的.通常 X 在 1105拷贝、循环次数n≤30 时E 相对稳定原始模板以相对固定的指数形式增加适合定量分析这也就是所谓的指数期随着循环次数 n 的增加30 次 E 值逐渐减少Y 呈非固定的指数形式增加最后进入平台期.3、荧光定量PCR 定量的理论模式又是什么PCR 是对原始待测模板核酸的一个扩增过程任何干扰 PCR 指数扩增的因素都会影响扩增产物的量使得 PCR 扩增终产物的数量与原始模板数量之间没有一个固定的比例关系通过检测扩增终产物很难对原始模板进行准确定量.近年来研究人员通过大量的实践研究了相对准确的定量 PCR 方法即荧光定量 PCR.PCR 扩增通式：① TnT01En② TnTn-11En注:0。