堆肥样品DNA提取

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提dna步骤及原理

提dna步骤及原理DNA提取是一种分离纯化DNA的过程，它可以用于分子生物学的各种实验和研究。

以下是DNA提取的步骤及原理：步骤1：细胞破碎首先，需要将目标细胞破碎以释放DNA。

这可以通过机械方式（如刮取细胞）或者化学方式（如孵育细胞在酶溶液中）来完成。

破碎细胞的目的是破坏细胞膜和核膜，释放DNA。

步骤2：细胞溶解接下来，要将破碎细胞中的蛋白质和其他细胞组分溶解。

这可以通过加入表面活性剂（如SDS）来破坏蛋白质的结构，使其变为可溶解状态。

细胞溶解的目的是除去蛋白质和其他细胞成分，保留DNA。

步骤3：蛋白质沉淀通过加入盐类，可以使DNA溶液中的蛋白质形成沉淀。

盐类中的离子与蛋白质形成复合物，使其聚集在一起并沉淀到溶液底部。

这一步的目的是除去大部分蛋白质，净化DNA溶液。

步骤4：DNA沉淀将溶液中的DNA沉淀到管壁上，可以通过加入酒精或其他有机溶剂来实现。

这些溶剂改变了DNA溶液的物理性质，使DNA变得不溶于水而沉淀。

这一步的目的是分离纯化DNA。

步骤5：洗涤和纯化DNA最后，通过洗涤沉淀的DNA，可以除去残留的盐类和其他杂质。

洗涤可以使用乙醇或其他缓冲液。

洗涤后，可以用缓冲液溶解DNA并进一步纯化。

DNA提取的原理是基于DNA和其他细胞成分的物理和化学特性的差异。

其中，细胞破碎和溶解步骤破坏了细胞膜和核膜，并释放了DNA。

蛋白质沉淀和DNA沉淀步骤利用了盐类和有机溶剂对不同分子的溶解性差异，将蛋白质和DNA分离。

洗涤步骤则进一步清洁和纯化DNA。

整个过程旨在从复杂的细胞混合物中分离纯化出DNA，以便在后续实验中进行分析和应用。

堆肥中高效纤维素降解菌的筛选与鉴定

堆肥中高效纤维素降解菌的筛选与鉴定作者：李丹花，乔莉娟，岳丹，等来源：《湖北农业科学》 2015年第16期李丹花，乔莉娟，岳丹，昝立峰，段保宁，白兰所（邯郸学院生命科学与工程学院，河北邯郸０５６００５）摘要：从邯郸地区堆肥中分离出５株具有纤维素降解能力的菌株，纤维素降解能力的初步鉴定结果显示，Ｍ１菌株具有较强的纤维素降解能力。

对Ｍ１菌株进行分子鉴定和生长特性的初步鉴定，结果表明，Ｍ１菌株应当归属于假单胞菌属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．），菌株的温度生长范围为１０～４５°Ｃ，最适生长温度为３０°Ｃ，ｐＨ６～８菌株均可生长，最适条件为ｐＨ６。

关键词：土著菌；纤维素降解；假单胞菌属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）；生长特性中图分类号：Ｘ７０５文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０15）16－3884-03DOI:10.14088/ki.issn0439-8114.2015.16.013收稿日期：２０１５－０５－１４基金项目：邯郸市科技计划项目（１３２２１０１０６５－４）；邯郸学院校内委托项目（１４３０１）作者简介：李丹花（１９８２－），女，河南平顶山人，讲师，博士，主要从事微生物学研究，（电话）186********（电子信箱）ｙｄ＿ｌｄｈ＠１６３．ｃｏｍ。

当前，农村环境污染日趋严重，尤其是农村生活垃圾、畜禽养殖废弃物及农作物秸秆等主要农村固体废弃物已成为污染农村环境的主要因素，影响着农村建设的进程。

堆肥化处理技术是解决农村固体废弃物问题的一个重要途径，是目前使废弃物无害化、减量化和资源化的关键技术［１］。

在高纤维含量的堆肥或者添加秸秆、木屑等调节剂［２］的堆肥处理中，其成分和结构复杂，难以被大多数微生物直接作为碳源物质而转化利用，已成为缩短堆肥周期、提高堆肥效率的限制性因素，因此，纤维素的生物降解成为堆肥技术处理有机固体废弃物的关键，一些研究者就堆肥纤维素分解菌进行了研究，筛选出很多高效的降解菌株［３，４］。

植物dna提取实验报告

植物dna提取实验报告植物基因组研究已经成为生物学的一个重要分支，特别是在农业生产和生态环境保护方面。

在这个研究领域中，植物DNA提取是基础且必不可少的一步。

本文将详细介绍植物DNA提取实验的过程、步骤和注意事项。

一、实验材料和仪器本实验所需材料和仪器如下：植物样品、溶解缓冲液、提取缓冲液、酒精、异丙醇、洗涤盐溶液、碱性蛋白酶、液氮、离心机、温水浴、电泳仪、比色皿等。

二、实验步骤1. 样品准备首先，选取新鲜植物样品，清洗并研磨成粉末。

为了提高DNA的纯度，应尽量避免样品中的杂质和污染。

2. DNA提取将研磨后的样品加入提取缓冲液中，并加入适量的洗涤盐和碱性蛋白酶，混匀后加入异丙醇，离心分离DNA。

将得到的上清液加入溶解缓冲液中，使用离心机将DNA沉淀至底部。

上清液中的DNA可以通过多次酒精沉淀提高回收率。

3. DNA纯化将得到的DNA溶于TE缓冲液中，使用电泳方法确定DNA含量和质量。

DNA的含量和质量可以通过紫外线吸收光谱测定和琼脂糖凝胶电泳检测。

4. DNA保存DNA保存有两种方式：一种是在-80℃低温下保存，这种方式比较适合需要长期保存的植物DNA；另一种是将DNA溶液保存在干燥的、无污染的环境中，这种方式比较适合短期保存的植物DNA。

三、注意事项1. 在样品制备和提取过程中，应尽量避免污染和杂质的混入，否则会影响DNA的纯度和质量。

2. 在DNA提取和纯化的过程中，应注意洗涤缓冲液、异丙醇等试剂的使用时间和浓度，以免影响DNA的回收率和纯度。

3. 在电泳检测中，应根据植物物种的不同选择适合的电泳参数，以确保DNA检测的准确性和可靠性。

四、结语DNA提取是植物基因组研究的基础，它是了解植物遗传信息和探究植物繁殖机制的必要步骤。

本实验详细介绍了植物DNA提取的方法和注意事项，希望可以为植物基因组研究者提供帮助。

几种水稻田土壤微生物总DNA提取方法的比较

第 4期顾华杰等 : 几种水稻田土壤微生物总 DNA提取方法的比较
301
人们首先使用一些常用的 DNA 提取方法从土壤中提取微生物总 DNA ,如 Tsai等使用溶菌酶和 SD S (十二烷基磺酸钠 ) 裂解细胞提取总 DNA[ 5 ] , Nazar等 [ 6 ] 使用液氮研磨 SDS 破解细胞提取总 DNA ,但这些方法所提取的 DNA 杂质较多 ,特别是腐植酸等杂质会严重影响后续的分子生物学实验操作。因此 ,人们又尝试许多方法去除腐植酸的影响 , 其中 Tiedje等人 [ 7 ]试验用 PVPP (聚乙烯吡咯烷酮 ) 和 CTAB (十六烷基三甲基溴化铵 )去除腐植酸 ,获得了很好的效果。在此基础上 ,人们又针对不同的土壤尝试了许多不同的方法 ,如 Bourrain等人 [ 8 ]从活性污泥中提取了 DNA , Reddy等人 [ 9 ]从堆肥中提取了 DNA。另外 ,人们还发展出了一种先从土壤中分离微生物细胞 ,再裂解细胞的间接提取 DNA 的方法 [ 10 ] 。
1 材料与方法
1. 1 土壤样品 2004年 3 月取自吴江市金家坝镇水稻肥料长
期定位试验地。该地土壤为黄泥土 ,自 1989起种植水稻 ,施加少量化肥 ,秸秆全部还田 ,并实行水稻 2油菜轮作制度。土壤基本性质见表 1。采样深度为 0 ～25 cm ,按五点法采样 ,九分法混匀放入无菌铝盒中 , - 20 ℃冰箱保藏。
第 15卷第 4期 2005年 8月
江苏大学学报 (医学版 )
Journal of J iangsu University (medicine)
Vol. 15 No. 4
Aug. 2005Fra bibliotek几种水稻田土壤微生物总 DNA提取方法的比较

DNA提取步骤范文

DNA提取步骤范文1.样本采集：根据具体的研究目的，选择合适的样本进行采集。

常用的样本包括血液、组织、唾液、尿液等。

采集过程应确保样本的完整性和纯度，并保持样本的新鲜度。

2.细胞破碎：将采集到的样本中的细胞破碎，以释放细胞内的DNA。

常用的方法有物理破碎法和化学破碎法。

物理破碎法可以用搅拌器或超声波将细胞破碎，而化学破碎法则是通过加入特定的溶解剂或酶来破坏细胞壁和细胞膜。

3.DNA溶解：将破碎后的细胞溶解，使DNA从细胞核膜和蛋白质中释放出来。

常用的溶解方法是加入含有高浓度盐和洗涤剂的缓冲液，这使得DNA能够与水相混溶，并与洗涤剂形成复合物。

4.蛋白质去除：将溶解后的混合液中的蛋白质去除，以纯化DNA。

常用的方法包括酚/氯仿萃取法和蛋白酶处理法。

酚/氯仿萃取法通过加入酚和氯仿，使混合液分为上层DNA-酚相和下层蛋白质-氯仿相，然后分离上层DNA相。

蛋白酶处理法则是通过加入蛋白酶，将蛋白质降解，然后通过离心使DNA沉淀。

5.DNA沉淀和洗涤：通过加入适量的酒精和高浓度盐，使DNA沉淀到管壁上，并洗掉杂质。

一般情况下，DNA会在低温下沉淀。

之后，将上清液倒掉，并使用酒精洗涤DNA沉淀，去除可能残留的盐、碱、酸和其他杂质。

6.DNA溶解及保存：将洗涤后的DNA沉淀用适当的溶液溶解，以便后续的实验操作或长期储存。

常用的溶解液是低盐浓度的TE缓冲液。

在DNA的溶解过程中，温度、离子浓度和pH值都必须适当，并避免RNA酶和DNA酶的污染。

总之，DNA提取的步骤是多个步骤的组合，旨在从生物样本中分离纯化DNA。

每个步骤都是为了达到高纯度、高产量和高质量的DNA产物。

准确且可靠的DNA提取过程对于后续分子生物学实验和遗传学研究至关重要。

在实际操作中，不同样本和研究的不同要求可能需要适当调整DNA提取步骤的顺序和条件。

因此，在进行DNA提取前，研究者应该仔细根据实验目的和具体样本的特性选择合适的DNA提取方法，并根据实际情况进行优化和调整。

植物中dna的提取方法

植物中dna的提取方法
1.取植物样品：从植物中选取新鲜的叶片、花、果实、根等样品，避免使用含有腐烂、干枯或受到污染的样品。

2. 切碎植物组织：用刀片或剪刀将植物材料切成小块，放入细碎的研钵中，加入液氮或干冰，迅速研磨碎成粉末状。

3. 加入提取缓冲液：将粉末状样品转移到离心管中，加入含有CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）的提取缓冲液，并加入蛋白酶K。

缓冲液的配方可以根据不同的植物种类和研究目的进行调整。

4. 热处理样品：将离心管放入水浴中，用80°C的温度加热30分钟，使细胞壁破裂，释放DNA。

5. 加入有机溶剂：将等体积的氯仿：异戊醇（24:1）加入样品中，充分混合后离心，分离出上清液。

6. 沉淀DNA：将上清液转移到装有冰冷乙醇的离心管中，缓慢倒入样品，轻轻摇晃后静置10分钟，将离心管放入高速离心机中离心10分钟，沉淀出DNA。

7. 溶解DNA：将沉淀的DNA用70%的乙醇洗涤，再用TE缓冲液（10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0）将DNA溶解。

以上是一种常用的植物中DNA提取方法，可以根据实验需要进行调整和改进。

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SiO2_纳米颗粒对猪粪好氧堆肥过程中重金属形态分布和细菌群落的影响

西北农业学报 2023,32(7):1078-1089A c t a A gr i c u l t u r a e B o r e a l i -o c c i d e n t a l i s S i n i c a d o i :10.7606/j .i s s n .1004-1389.2023.07.011h t t p s ://d o i .o r g /10.7606/j.i s s n .1004-1389.2023.07.011S i O 2纳米颗粒对猪粪好氧堆肥过程中重金属形态分布和细菌群落的影响收稿日期:2022-02-09 修回日期:2022-03-18基金项目:陕西省重点研发计划(2019Z D L N Y 01-01);国家重点研发计划(2021Y F D 1600400);陕西省科技重大专项(2020z d z x 03-02-01);陕西省创新能力支撑计划(2020P T -015);陕西省创新能力支撑计划(2019P T -13)㊂第一作者:江海鸿,女,硕士研究生,研究方向为农业废弃物无害化处理与资源化利用㊂E -m a i l :h h j i a n g@n w a f u .e d u .c n 通信作者:王小娟,女,副教授,研究方向为农业废弃物无害化处理与资源化利用㊂E -m a i l :x i a o ju a n 7069@s i n a .c o m 江海鸿,王小娟,谷洁,宋籽霖,丁庆玲,魏淑梅,周志鹏,李悦瑄,魏媛(西北农林科技大学资源环境学院,陕西杨凌 712100)摘要以猪粪和秸秆为原料,S i O 2纳米颗粒(S i O 2NP s )为添加剂,研究添加4个浓度梯度下(0㊁0.5㊁1.0和2.0g /k g)S i O 2N P s 对好氧堆肥过程中腐熟度指标㊁重金属总量和形态分布规律以及细菌群落的影响,并探讨影响重金属生物利用度的因素㊂结果表明,添加S i O 2N P s 提高堆体温度并延长堆肥高温期㊂与堆肥前相比,堆肥后的p H 显著升高,而电导率和C /N 显著降低㊂种子发芽指数由堆肥前的50%升高到堆肥后的163%~182%㊂添加S i O 2N P s 有利于重金属组分由生物可利用形态(可交换态和可还原态)向稳定形态(可氧化态和残渣态)转化,C u 和Z n 的钝化效率可分别达到65.10%~83.89%和6.62%~27.93%,极显著高于C K 处理(分别为52.09%和1.83%,P <0.01)㊂添加S i O 2N P s 增加嗜热菌科的丰度,提高总细菌的多样性和丰富度㊂与C u 相关的优势细菌门为厚壁菌门(F i r m i c u t e s ),与Z n 相关的被鉴定为变形菌门(P r o t e o b a c t e r i a )和放线菌门(A c t i n o b a c t e r i a )㊂偏最小二乘路径模型分析表明C u 的生物利用度受环境因素(C /N 和电导率)和细菌的交互作用,而Z n 的生物利用度受细菌和温度的直接影响㊂关键词 S i O 2纳米颗粒;猪粪;好氧堆肥;重金属形态;细菌群落随着畜禽养殖业逐步趋向于集约化㊁规模化和专业化的发展,从而产生了大量的畜禽粪便㊂据统计,中国每年畜禽粪便产生量高达38亿t,但综合利用率却不足60%[1]㊂重金属铜和锌由于具有预防动物疾病和促进动物生长的作用,常被用作饲料添加剂[2-3]㊂但这些重金属不能被动物完全吸收利用且化学性质稳定,大部分未被利用的重金属会随粪便排出体外[4]㊂畜禽粪便中重金属的残留成为限制畜禽粪便回收利用的瓶颈㊂好氧堆肥是常用的畜禽粪便无害化处理和资源化利用的方法之一,堆肥不会降低重金属总量,有机肥的农业应用会导致重金属在土壤中的积累㊂但是重金属的环境特征,包括生物利用度㊁毒性和流动性是由重金属的形态决定的㊂堆肥能通过调节重金属在不同形态进行转化从而降低重金属的毒性[5]㊂堆肥的本质是通过微生物的作用将大分子有机物降解为腐殖质的过程㊂以往的研究表明,重金属的钝化效果与微生物活性密切相关㊂微生物可以通过生物吸附直接钝化重金属[6],或通过表达一系列的重金属抗性蛋白(例如金属结合蛋白㊁金属氧化酶㊁金属还原酶)来降低重金属的有效性[7-8]㊂微生物还可以通过纤维素酶和木质素酶基因的表达来调节有机物的降解和腐殖质的生成,从而通过腐殖质与重金属阳离子的络合间接影响重金属的生物有效性[9]㊂重金属的生物有效性与微生物之间的关系常因物种不同而具有差异㊂例如,C u 和Z n 的生物有效性分别与热脱球菌(D e i n o c o c c u s -T h e r m u s )和变形菌(P r o -t e o b a c t e r i a )的丰度具有最高的相关性[10]㊂H a o等[11]将重金属组分与细菌丰度之间做了P e a r s o n相关性分析,结果表明C u 与更多的细菌显著相关,而Z n 与细菌的相关性较少㊂在堆肥过程中,温度㊁p H ㊁电导率(E C )㊁总碳和总氮可以调节微生物的活性,从而通过直接和间接作用进一步影响重金属的生物有效性[10]㊂此外,理化性质对重金属也具有钝化作用㊂p H 的增加能使酸溶性组Copyright ©博看网. All Rights Reserved.分形成沉淀来降低重金属的迁移率[12]㊂有机物与带负电荷的重金属界面结合形成稳定的配合物来影响重金属组分的变化[13-14],特别是富含羧基和羟基的腐殖物质更易与金属形成稳定的配合物[15]㊂仅依靠堆肥降低重金属的生物有效性是有限的,添加剂的使用能有效提高重金属的钝化效果㊂A w a s t h i 等[16]的研究表明生物炭有效降低了污泥堆肥中重金属C u ㊁Z n ㊁P b 和N i 的生物有效性㊂其他添加剂包括石灰[17]㊁沸石[18]㊁麦饭石[19]和磷岩[20]都被用于堆肥以促进重金属的可移动部分转化为稳定部分㊂添加剂通过与重金属离子直接结合,或通过调节碳㊁氮和磷转化等过程,改善微生物群落结构,从而通过吸附㊁络合/沉淀/离子交换和微生物富集/代谢机制降低重金属的毒性㊂S i O 2纳米颗粒(S i O 2N P s )是无污染的非金属颗粒,具有较大的比表面积和稳定的化学性质,可从各种类型的农业废物中合成[21],广泛用于去除水和土壤中的重金属[22-23]㊂因此,笔者推测在堆肥过程中加入S i O 2N P s 有助于重金属生物利用度的降低㊂本试验以猪粪和小麦秸秆为堆肥原料,S i O 2N P s 为添加剂㊂(1)研究S i O 2NP s 对重金属C u 和Z n 形态分布的影响;(2)分析S i O 2N P s 对堆肥过程中细菌变化的影响;(3)研究细菌群落㊁环境因素与重金属之间的相互作用㊂这些结果有助于了解堆肥过程中重金属钝化途径的理论体系,提供一种利用S i O 2N P s 来降低堆肥过程中重金属生物有效性的方法㊂1 材料与方法1.1 试验材料与设计原料为猪粪和麦秸,猪粪采自杨凌某中型养殖场,小麦秸秆采自西北农林科技大学某试验田㊂猪粪和小麦秸秆的基本性质见表1㊂S i O 2N P s 从北京德科岛津纳米科技有限公司购买,其平均粒径为30n m ,比表面积为200m 2/g㊂表1 堆肥材料的基本性质T a b l e 1 P r o p e r t y o f c o m po s t r a w m a t e r i a l s 原材料R a w m a t e r i a l s含水率/%M o i s t u r e c o n t e n tp H 总碳/(g /k g)T o t a l c a r b o n总氮/(g /k g)T o t a l n i t r o ge n C u /(m g /k g )Z n /(m g /k g )猪粪S w i n e m a n u r e77.40ʃ1.447.66ʃ0.04401.10ʃ1.2122.25ʃ0.93124.64ʃ3.88595.36ʃ2.52小麦秸秆W h e a t s t r a w7.80ʃ0.026.41ʃ0.07416.13ʃ1.328.40ʃ1.056.66ʃ0.6211.78ʃ1.82注:表中数值为平均值ʃ标准差㊂N o t e :T h e v a l u e s i n t h e t a b l e a r e t h e m e a n v a l u e ʃs t a n d a r d d e v i a t i o n .堆肥试验在密封反应器(有效容积为75L )进行㊂为保证堆肥过程中氧含量充足,在整个堆肥过程中,堆肥底部以0.35L /(h ㊃k g)(干质量)的通风速率进行通风㊂将猪粪和秸秆混合,调节初始C /N 比为30ʒ1,含水率约为60%㊂根据前人的研究和S i O 2NP s 的特性[24-25],按照湿质量向混合物中分别添加0㊁0.5g /k g ㊁1g /k g 和2g /k g 的S i O 2NP s ,记作C K ㊁L ㊁M 和H ㊂每个处理设置3个重复,堆肥过程共进行40d㊂1.2 样品采集与制备根据堆体温度的变化,重复堆肥样品分别在堆肥初期(第0天)㊁中温期(第1天)㊁高温期(第11天)㊁降温期(第16天)和成熟期(第40天)进行采集㊂将重复样品混合均匀后分为两部分:一部分保存于4ħ,用于理化分析;另一部分保存于-80ħ,用于D N A 提取和微生物测序㊂1.3 分析方法1.3.1 腐熟度指标的测定每天测量堆芯和环境温度㊂用p H 计(P H S -3C ,L e i C i,中国)测定pH ㊂电导率用电导率仪(D D S -307电导率仪)测定㊂使用元素分析仪(V a r i o M a c r o C u b e ,E l e -m e n t a r,德国)测定总碳和总氮含量㊂种子发芽指数(G I )的测定参照N Y /T 3442-2019标准进行,计算公式:G I =浸提液发芽种子数ˑ根长对照发芽种子数ˑ根长ˑ100%1.3.2 重金属C u 、Z n 总量和形态的测定采用H N O 3-H C l -H F -H 2O 2微波消解法测定堆肥样品中重金属C u 和Z n 的总量㊂重金属C u 和Z n 的形态采用B C R 连续提取法进行测定[26],包括可交换态(F 1)㊁可还原态(F 2)㊁可氧化态(F 3)和残渣态(F 4)㊂使用火焰原子吸收光谱仪(P E 900F,美国)测定重金属C u 和Z n 总量及各形态的含量㊂㊃9701㊃7期江海鸿等:S i O 2纳米颗粒对猪粪好氧堆肥过程中重金属形态分布和细菌群落的影响Copyright ©博看网. All Rights Reserved.重金属的生物利用度=可交换态重金属含量+可还原态重金属含量重金属的钝化率=(堆肥前重金属的生物利用度-堆肥后重金属的利用度)/堆肥前重金属的生物利用度ˑ100%1.3.3堆肥样品D N A的提取及测序根据制造商的说明,使用F a s t D N A S P I N K i t f o r S o i l (M P B i o m e d i c a l,U S A)提取堆肥样品的D N A㊂提取的D N A在I l l u m i n a H i S e q平台(上海,中国)上进行测序㊂采用引物338F(A C T C-C T A C G G G A G G C A G C A G)和806R(G G A C-T A C H V G G G TWT C T A A T)扩增16S r R N A基因的V3~V4区域㊂Q I I M E(版本1.9.1)和F L A S H(版本1.2.1)用于原始序列的质量筛选㊂使用U P A R S E(版本7.0.1090)在97%的序列相似性水平上检测操作分类单元(O T U),使用R D P分类器对O T U进行分类㊂1.4数据统计及分析采用S P S S19.0对数据进行L S D差异性检验㊂采用E x c e l2019对腐熟度指标和重金属进行绘图分析㊂使用O r i g i n和H e m I V1.0绘制细菌丰度图㊂使用R V4.1.0对重金属生物利用度与细菌之间的关系以及影响重金属生物利用度的因素进行可视化分析㊂2结果与分析2.1S i O2N P s对腐熟度指标的影响2.1.1对温度的影响堆体温度是整个堆肥过程的关键因素之一,也是表征堆肥过程中微生物活性和堆肥腐熟度的重要指标[27]㊂如图1-a所示,在整个堆肥过程中,各处理的温度均呈现出前期大幅度升高后期下降并趋于平缓的变化趋势㊂C K㊁L㊁M和H处理分别在第4天㊁第4天㊁第2天和第1天进入高温期(ȡ50ħ),随后温度峰值分别达到60.04ħ㊁63.52ħ㊁70.03ħ和70.08ħ,高温维持时间分别为12d㊁12d㊁14d 和15d,符合无害堆肥标准的要求(G B7959-2012)㊂添加S i O2N P s缩短堆体进入高温期的时间,提高堆体的最高温度,延长高温期,更有助于堆肥腐熟㊂之后随着可生物降解有机物的分解,微生物活动逐渐减弱,堆体温度逐渐降低直至趋于环境温度水平㊂2.1.2对p H和电导率的影响p H是影响微生物活性的重要因素[28]㊂各处理的p H变化呈现出先急剧升高后降低并趋于稳定(图1-b),在整个堆肥过程中p H变幅为6.78~9.20㊂堆肥初期p H的上升是因为含氮有机物的降解导致N H3释放和N H+4-N积累[29]㊂随着堆肥的进行, N H3释放速率降低,硝化细菌活性增强,从而产生大量H+,导致p H下降[30]㊂堆肥结束时,C K㊁L㊁M和H处理的p H分别为8.77㊁8.96㊁8.86和9.01,满足有机肥料呈弱碱性的标准,添加S i O2N P s的处理与C K处理存在显著差异(P< 0.05)㊂堆肥基质的盐度用电导率(E C)表示,E C也反映了堆肥产品的植物毒性[31]㊂如图1-c所示,4个处理的E C变化趋势相似,堆肥初期由于有机质的降解导致E C急剧下降㊂随着堆肥的进行,有机酸的溶解作用及氨气以铵盐形式存在等使电导率上升[32]㊂最终由于有机质含量降低和氨气挥发导致电导率降低㊂堆肥后,各处理的E C较堆肥前显著降低(P<0.05),分别为1.53㊁1.71㊁1.98和1.97m S/c m,满足有机肥标准规定的小于3m S/c m,添加S i O2N P s显著提高堆肥产品的E C(P<0.01)㊂2.1.3对总碳㊁总氮和C/N的影响微生物通过分解堆肥材料获得碳和氮等营养物质,以供给微生物的生长繁殖㊂碳和氮的含量是影响堆肥进程的主要指标之一,直接影响微生物活性[33]㊂从图1-d可以看出,堆料中的总碳含量持续下降,表明堆料中可降解有机物质不断被微生物消耗利用,碳素损失较快㊂在腐熟期,C K㊁L㊁M和H处理中的总碳含量由初始376.07g/k g分别降至318.27㊁326.23㊁309.91和279.05g/k g㊂M和H处理中碳素损失显著高于C K处理(P< 0.01),这可能是因为M和H处理中的微生物生长导致有效碳分解更快㊂堆料中的总氮含量持续增加(图1-e),这可能是由于堆肥中固氮微生物的活性较高,固定了更多氮素[34]㊂此外,大量有机物以水蒸气㊁C O2等形式逸出造成堆体质量下降,形成浓缩现象 [35]㊂当干物质的浓缩效应大于氮素的矿化作用时,就会导致总氮含量的增加㊂王佳等[36]利用厨余垃圾堆肥得到了类似的结果㊂堆肥结束时,C K㊁L㊁M和H处理中的总氮含量由初始12.89g/k g分别增加到28.20㊁27.71㊁28.68和31.33g/k g㊂H处理的总氮含量显著高于C K处理(P<0.01),这可能是因为添加高剂量的㊃0801㊃西北农业学报32卷Copyright©博看网. All Rights Reserved.S i O2N P s增强了氮素的固定从而减少了氨的剧烈挥发㊂图1-f显示各处理在堆肥过程中C/N的变化㊂由图可知,各处理的C/N在堆肥过程中呈现逐渐降低的变化趋势,与于静等[37]的研究结果一致,这是由于堆肥过程中微生物对有机碳的消耗速率大于有机氮㊂堆肥结束时,C K㊁L㊁M和H 处理的C/N值分别为11.28㊁11.77㊁10.80和8.91,已满足堆肥腐熟要求(C/N<20)[38]㊂H处理的C/N下降幅度最大,且在堆肥的各个阶段均显著低于C K处理(P<0.01),表明高剂量的S i O2N P s促进了有机物的生物降解,有助于堆肥腐熟㊂2.1.4S i O2N P s对发芽指数(G I)的影响 G I广泛用于评估堆肥的植物毒性和腐熟度㊂当G I> 50%时,认为堆肥材料的毒性相对较低;当G I> 80%时,认为堆肥已腐熟或对植物无毒性[39]㊂如图1-g所示,4个处理的G I变化趋势相同,都是随着堆肥的进行呈现逐渐升高的趋势㊂当堆肥结束时,C K㊁L㊁M和H处理的G I分别为134%㊁163%㊁182%和167%,表明添加S i O2N P s可以显著提高G I(P<0.01),促进堆肥腐熟的程度㊂图1堆肥过程中温度㊁p H㊁电导率㊁总碳㊁总氮㊁C/N和发芽指数的变化F i g.1C h a n g e s o f t e m p e r a t u r e,p H,e l e c t r i c a l c o n d u c t i v i t y,t o t a l c a r b o n,t o t a l n i t r o g e n,C/N,a n d g e r m i n a t i o n i n d e x d u r i n g c o m p o s t i n g2.2S i O2N P s对重金属的影响2.2.1S i O2N P s对重金属总量的影响对堆肥不同阶段样品中重金属C u和Z n的总量进行检测(图2-a)㊂4个处理C u和Z n的总量随着堆肥进程逐渐升高,这是由于矿化过程中有机物分解和挥发性物质损失,使得堆体变小,导致堆体中㊃1801㊃7期江海鸿等:S i O2纳米颗粒对猪粪好氧堆肥过程中重金属形态分布和细菌群落的影响Copyright©博看网. All Rights Reserved.㊃2801㊃西北农业学报32卷图2堆肥过程中C u㊁Z n总量(a)和形态分布(b㊁c)的变化以及堆肥后C u㊁Z n在不同处理中的钝化率(d㊁e)F i g.2C h a n g e s o f t o t a l a m o u n t(a)a n d s p e c i a t i o n d i s t r i b u t i o n(b,c)o f C u a n d Z n d u r i n g c o m p o s t i n g,t h e p a s s i v a t i o n r a t e(d,e)o f C u a n d Z n u n d e r d i f f e r e n t t r e a t m e n t s a f t e r c o m p o s t i n gCopyright©博看网. All Rights Reserved.C u和Z n被浓缩 [5]㊂堆肥结束时,C u的含量表现为C K处理(100.75m g/k g)<L处理(102.07 m g/k g)<M处理(107.80m g/k g)<H处理(112.74m g/k g),Z n的含量表现为L处理(486.02m g/k g)<C K处理(512.87m g/k g)<H 处理(524.52m g/k g)<M处理(534.40 m g/k g)㊂M和H处理中的C u和Z n的浓缩程度显著高于C K和L处理(P<0.01),表明M 和H处理的堆肥体积缩小得更多,有机物分解可能更为完全㊂2.2.2 S i O2N P s对重金属形态的影响如图2-b所示,在整个堆肥过程中,C u的主要形态是可氧化态(F3)和残渣态(F4)㊂堆肥前,C u的4种形态分别占总量的14.97%㊁24.08%㊁38.03%和22.92%㊂随着堆肥的进行,可交换态(F1)和可还原态(F2)的含量逐渐降低,最终F1在C K㊁L㊁M和H处理中降低为14.38%㊁10.20%㊁6.88%和5.08%,F2在C K㊁L㊁M和H处理中降低为4.33%㊁3.43%㊁2.15%和1.21%㊂F3和F4的含量逐渐升高,在堆肥结束时分别增加为56.58%~63.74%和24.71%~29.98%㊂这与刘秋萌[40]的研究结果类似,即钝化剂处理后F3分配率最大㊂F1和F2被认为是生物有效组分,容易被微生物吸收和利用[41]㊂堆肥结束时,C K㊁L㊁M和H处理对C u的生物有效组分的相对钝化率分别为52.09%㊁65.10%㊁76.86%和83.89%(图2-d)㊂基于上述结果,表明添加S i O2N P s显著提高C u的钝化率(P<0.01),且随着剂量的增加钝化效果越好㊂F1和F2是堆肥过程中Z n的主要存在形态,二者之和的占比为48.51%~72.94%(图2-c)㊂在堆肥原料中,Z n的F1是最重要的形态,占总量的44.69%㊂经过堆肥处理后,F1含量显著降低,最终在C K㊁L㊁M和H处理中降低为37.75%㊁30.34%㊁25.52%和17.94%㊂堆肥结束时,F3含量在C K㊁L㊁M和H处理中升高为11.86%㊁13.88%㊁18.38%和30.38%㊂从Z n的生物有效组分的相对钝化率来看,H(27.93%)> M(9.55%)>L(6.62%)>C K(1.83%)(图2-e)㊂这些结果表明,添加S i O2N P s能显著降低Z n的生物有效组分(P<0.01),有利于Z n向着稳定态和生物有效性降低的方向转变㊂2.3S i O2N P s对细菌群落结构的影响在好氧堆肥过程中,有机物通过微生物分泌酶的作用而分解㊂桑基图和热图共同说明在堆肥过程中细菌前35科的组成情况及相对丰度的变化(图3)㊂厚壁菌门(F i r m i c u t e s)㊁放线菌门(A c-t i n o b a c t e r i o t a)㊁变形菌门(P r o t e o b a c t e r i a)和拟杆菌门(B a c t e r o i d o t a)是优势菌门,在堆肥过程中占细菌总数的63.44%~99.75%,这与胡婷[42]的结果一致㊂在前35科中,有25.71%属于厚壁菌门,其次是细菌科属于放线菌门和变形菌门的较多,均占22.86%㊂这几个门的微生物在堆肥过程中对有机物的降解(包括碳水化合物和氨基酸)起主要作用[43]㊂乳酸杆菌科(L a c t o b a c i l l a c e a e)㊁链球菌科(S t r e p t o c o c c a c e a e)㊁棒状杆菌科(C o r y n e b a c t e r i-a c e a e)㊁葡萄球菌科(P l a n o c o c c a c e a e)㊁梭菌科(C l o s t r i d i a c e a e)㊁消化链球菌科(P e p t o s t r e p t o-c o c c a c e a e)和黄单胞菌科(X a n t h o m o n a d a c e a e)在堆肥原料中有较高的丰度(图3)㊂随着堆肥的进行,这些非嗜热细菌科的相对丰度显著降低㊂在堆肥的高温期,杆菌科(B a c i l l a c e a e)㊁拟杆菌科(P a e n i b a c i l l a c e a e)㊁L i m n o c h o r d a c e a e㊁拟诺卡菌科(N o c a r d i o p s a c e a e)㊁根瘤菌科(R h i z o b i a c e a e)㊁黄单胞菌科(X a n t h o m o n a d a c e a e)㊁热微生物科(T h e r m o m i c r o b i a c e a e)㊁S a n d a r a c i n a c e a e成为优势菌科,它们是嗜热菌科[44],对有机物的分解起着主要的作用㊂这些细菌科在L㊁M和H处理中的总丰度分别比C K高9.18%㊁13.48%和14.74%(P<0.01),S i O2N P s的添加促进这些嗜热菌科丰度的增加㊂在添加S i O2N P s处理中,温度始终高于C K,这归因于这些嗜热菌科的大量增殖,能够充分利用复杂的有机物作为碳源从而分解有机物㊂S h a n n o n㊁S i m p s o n㊁A c e和C h a o指数基于物种的丰富度和均匀度,用于反映物种多样性,其中S h a n n o n㊁A c e和C h a o指数越大,代表物种的丰富度和多样性越高,而S i m p s o n指数相反㊂堆肥后细菌的S h a n n o n㊁A c e和C h a o指数分别显著升高74.57%~94.67%㊁35.50%~ 61.18%和26.77%~64.79%,S i m p s o n指数显著降低74.81%~89.96%(表2),表明堆肥后细菌群落的多样性和丰富度显著增加,其中S i O2N P s处理的增幅最大,表明添加S i O2N P s有利于丰富堆肥过程中的细菌群落㊂2.4细菌群落与重金属生物有效性的关系选取细菌前35科的相对丰度,分析其与C u㊁Z n的可交换态(F1)和可还原态(F2)的关系,如㊃3801㊃7期江海鸿等:S i O2纳米颗粒对猪粪好氧堆肥过程中重金属形态分布和细菌群落的影响Copyright©博看网. All Rights Reserved.㊃4801㊃西北农业学报32卷图3堆肥过程中细菌前35科的变化F i g.3C h a n g e o f t o p35b a c t e r i a l f a m i l y d u r i n g c o m p o s t i n gCopyright©博看网. All Rights Reserved.表2细菌群落的多样性T a b l e2D i v e r s i t y o f b a c t e r i a l c o m m u n i t y处理T r e a t m e n t S h a n n o n S i m p s o n A c e C h a o堆肥前B e f o r e c o m p o s t i n gC K2.150.23144.79145.5堆肥后A f t e r c o m p o s t i n g C K4.070.03202.64198.69L3.760.06196.19206.67M4.130.02233.37239.77H4.190.02222.91223.4图4所示㊂Z n与细菌科的相关性最为显著,共有27条正相关关系,其中Z n-F1主要与P r o t e o b a c-t e r i a正相关,Z n-F2主要与A c t i n o b a c t e r i a正相关㊂然而,C u的生物有效性与细菌科的相关性较少㊂C u-F2与链球菌科(S t r e p t o c o c c a c e a e)㊁消化链球菌科(P e p t o s t r e p t o c o c c a c e a e)㊁梭菌科(C l o s-t r i d i a c e a e)㊁乳酸杆菌科(L a c t o b a c i l l a c e a e)㊁棒状杆菌科(C o r y n e b a c t e r i a c e a e)和球菌科(P l a n o c o c-c a c e a e)呈正相关,C u-F1仅与伪诺卡氏菌科(P s e u d o n o c a r d i a c e a e)和贝耶林奇菌科(B e i j e r-i n c k i a c e a e)正相关㊂微生物对重金属的钝化具有直接和间接的影响㊂例如,主要由肽聚糖和磷壁酸组成细胞壁的以厚壁菌门为代表的革兰氏阳性细菌,它们的表面带负电,可通过静电吸附直接捕获电子[45]㊂这可能是C u-F2含量大幅度降低的主要原因㊂此外,厚壁菌门㊁变形菌门和拟杆菌门能将纤维素降解为负价脂肪酸,从而与重金属阳离子结合形成稳定的化合物[10]㊂这些微生物会通过影响有机质的组成和官能团,从而通过络合作用影响重金属的生物有效性[46]㊂图4重金属生物有效组分与细菌(细菌前35科)之间的关系F i g.4R e l a t i o n s h i p b e t w e e n b i o a v a i l a b l e c o m p o n e n t s o f h e a v y m e t a l s a n d b a c t e r i a(t o p35b a c t e r i a l f a m i l y)2.5细菌群落和环境因素对重金属钝化途径的交互作用选取细菌科的相对丰度和几个对细菌有显著影响的环境因子构建C u㊁Z n的可交换态和可还原态的偏最小二乘路径模型(p a r t i a l l e a s t s q u a r e s-p a t h m o d e l,P L S-P M)㊂C u-F1主要受细菌(路径系数b=0.82)和C/N(b=0.53)的直接影响(图5-a),C u-F2直接受电导率(b=㊃5801㊃7期江海鸿等:S i O2纳米颗粒对猪粪好氧堆肥过程中重金属形态分布和细菌群落的影响Copyright©博看网. All Rights Reserved.-0.24)㊁细菌(b =-0.48)和C /N (b =0.50)的影响(图5-b )㊂H a o 等[11]研究表明,微生物多样性的增加有助于重金属在不同形态间进行转化㊂具有铜抗性基因(例如c o p C )的微生物可以通过金属结合蛋白的诱导反应和反馈表达影响C u 的生物有效性[47]㊂另外,微生物群落演替受环境因子包括p H 和C /N 的调控[48]㊂对于Z n 而言,直接受到细菌(b =1.12)和温度(b =-0.54)的影响,C /N 对Z n 具有间接影响(图5-c 和5-d)㊂细菌可能通过调控纤维素的降解影响腐殖质的形成及其与锌的络合作用㊂此外,堆肥过程中,有机质的降解以及p H 的升高会促进锌的吸附㊁沉淀和络合[49],从而降低Z n 的生物有效性㊂图5反映出影响C u 的生物有效性的因子比Z n 多,这可能解释了在堆肥系统中C u 比Z n 更容易钝化㊂总体而言,细菌的直接作用和环境因子的直接/间接作用共同构成了钝化重金属的关键㊂*在0.05水平上显著,**在0.01水平上显著*S i g n i f i c a n t a t 0.05l e v e l ,**S i gn i f i c a n t a t 0.01l e v e l 图5 偏最小二乘路径模型用于分析影响重金属生物利用度的因素F i g .5 P a r t i a l l e a s t s q u a r e -p a t h m o d e l w a s u s e d t o a n a l y z e f a c t o r s a f f e c t i n g b i o a v a i l a b i l i t y o f h e a v y me t a l s 3 结论(1)添加S i O 2NP s 提高了堆体温度,延长了堆肥的高温期㊂p H 在堆肥后显著升高(P <0.05),而电导率和C /N 显著降低(P <0.05)㊂G I 由堆肥前的50%升高到堆肥后的163%~182%㊂(2)添加S i O 2N P s 有利于重金属组分由生物可利用形态(可交换态和可还原态)向稳定形态(可氧化态和残渣态)转化,C u 和Z n 的钝化效率可分别达到65.10%~83.89%和6.62%~27.93%,显著高于C K 处理,分别为52.09%和1.83%(P <0.01)㊂(3)添加S i O 2NP s 增加了嗜热菌科的丰度,提高了堆肥中总细菌的多样性和丰富度㊂(4)与C u 相关的优势细菌门为厚壁菌门(F i r m i c u t e s ),与Z n 相关的被鉴定为变形菌门(P r o t e o b a c t e r i a )和放线菌门(A c t i n o b a c t e r i a )㊂(5)P L S -P M 分析表明C u 的生物利用度受环境因素(C /N 和电导率)和细菌的交互作用,而Z n 受细菌和温度的直接影响㊂参考文献 R e f e r e n c e:[1] 韩庆远.中国养殖业的现状分析及对策研究[J ].农村经济与科技,2020,31(11):88-90.HA N Q Y.C u r r e n t s i t u a t i o n a n a l ys i s a n d c o u n t e r m e a s u r e s ㊃6801㊃西北农业学报32卷Copyright ©博看网. 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基因组dna提取流程 -回复

基因组dna提取流程-回复提取基因组DNA是生物学研究和分子生物学实验中的常见步骤之一。

DNA提取过程的主要目标是从细胞中分离纯净的DNA，这样可以进一步进行PCR扩增、测序、限制酶切等实验。

DNA提取的过程需要使用特定的试剂和仪器，并遵循一系列的步骤来确保高质量的DNA样品。

下面将分步介绍DNA提取的流程。

步骤一：准备样品在开始DNA提取之前，需要准备样品。

样品可以是从动植物组织、细菌或真菌中获得的样本。

根据样本的类型，准备的方法可能会有所不同。

对于动植物组织样品，通常需要将样品切碎或磨粉。

这可以通过使用刀具、搅拌器、研钵等实现。

对于一些特殊的组织或植物种类，可能需要优化样品的处理方法。

对于细菌样品，可以利用细菌培养物进行提取，或者直接收集细菌进行提取。

对于培养物，需要将其以高速离心的方式收集下来，并洗涤去除附着在细胞表面的其他物质。

步骤二：细胞破碎细胞破碎是提取DNA的关键步骤之一。

它的目的是破坏细胞膜和核膜，释放DNA。

有许多方法可以破碎细胞，常见的有以下几种：1. 物理破碎：通过高速离心或超声波处理来破坏细胞。

高速离心将沉淀细胞，超声波处理则通过施加强大的震荡来破坏细胞结构。

2. 化学破碎：使用洗涤剂来破坏脂膜和脂蛋白，使细胞破裂。

洗涤剂会溶解脂质双层，使DNA被释放到溶液中。

3. 酶解破碎：使用特定的酶来消化细胞壁或细胞膜，从而释放DNA。

例如，对于真菌样品，可以使用纤维素酶和壁脲酶来消化细胞壁。

步骤三：DNA纯化在细胞破碎后，需要将DNA与其他细胞组分分离。

这样可以去除蛋白质、RNA和其他污染物，使DNA样品更为纯净。

1. 蛋白质消化：可以使用蛋白酶来消化蛋白质。

蛋白酶会降解蛋白质，使其释放出来。

随后，可以使用盐溶液和有机溶剂提取DNA。

2. RNA消化：利用核酸酶消化RNA。

核酸酶将特异性地降解RNA，而不会对DNA产生影响。

消化后，可以使用盐溶液和有机溶剂进行DNA的提取。

3. DNA沉淀：通过向DNA溶液中添加盐和酒精，可以使DNA凝聚成可见的颗粒。

农业废物堆肥中微生物总DNA提取方法的研究及其应用的开题报告

农业废物堆肥中微生物总DNA提取方法的研究及其应用的
开题报告
标题：农业废物堆肥中微生物总DNA提取方法的研究及其应用
研究背景：
随着人口的增加和城市化进程的加快，农业废弃物的处理和处置成为一个迫切的问题。

堆肥作为一种环保、经济、可持续的处理方式已经得到广泛应用，但是目前对
于堆肥微生物的研究主要集中在微生物数量、种类和功能等方面，而对微生物群落结
构及其影响因素的研究还很少，这与微生物群落的复杂性有关。

为了更好地理解堆肥
微生物群落结构的构建过程及其影响因素，需要开发一种可靠、高效的微生物总DNA
提取方法，并对其应用进行探究。

研究内容：
本研究旨在开发一种针对农业废物堆肥中微生物总DNA提取的方法，并应用于
微生物群落结构及其影响因素的研究。

具体研究内容包括：
1. 对不同提取试剂（如三盐溶液、CTAB等）进行筛选，优化微生物总DNA提取方法，评估其提取效率、纯度及适用性。

2. 利用高通量测序技术（如Illumina HiSeq）对提取的微生物总DNA进行测序，分析堆肥中微生物群落的物种组成和多样性指数。

3. 对不同的堆肥处理条件（如不同原料、料堆大小、通气方式等）进行比较，分析其对微生物群落结构的影响，并探究其关联性及生态意义。

研究意义：
本研究将对农业废物堆肥微生物群落的分布、多样性、群落结构和影响因素进行深入研究，有助于提高废弃物的处理效率和资源利用率，为环境保护和可持续发展做
出贡献。

同时，该研究也有望在理论上拓展微生物群落结构的研究领域，探讨微生物
群落构建机制，并为微生物资源的开发及应用提供科学依据。

堆肥样品DNA提取

3 堆肥样品DNA提取3.1堆肥样品的预处理DNA提取前对所有样品进行洗涤。

取堆肥样品1.0g于5 ml离心管内，加入3ml TENP buffer（50mmol·L-1 Tris-HCl，20mmol·L-1 EDTA ，100mmol·L-1 NaCl，pH=10.0），充分涡旋2min，5000 r/min离心10min，沉淀再次洗涤；沉淀加入3mL 120mmol·L-1的磷酸盐缓冲溶液（pH=8.0），充分涡旋混合，5000 r/min离心10min，洗涤直至上清液颜色较为澄清，沉淀用于后续研究。

3.2 DNA提取采用改进的蛋白酶K-CTAB法进行。

1、在洗涤好的样品中加入 1.5mLDNA提取液（100mmol·L-1Tris-HC1，pH=8.0，100mmol·L-1 EDTA，pH=8.0，100mmol·L-1 Na3PO4，1.4mol·L-1 NaCl，2% CTAB），剧烈振荡混匀后加入溶菌酶和蛋白酶K（均为10μL，100mg·mL-1）。

2、将混合好的样品置于37℃、225 r/min摇床上摇动40min，加入200μL（10%）SDS，65℃水浴2h，每隔15-20min轻轻上下颠倒摇动。

3、沉淀在室温6000r/min下离心10min，取上清，转移至新的5ml离心管中，再加入0.5mLDNA提取液和50μL(10%)的SDS，65℃水浴10min，重复操作后，合并上清。

4、在获得的上清液中加入等体积氯仿/异戊醇（体积比24:1），轻轻颠倒30min混合。

6000r/min下离心10min，吸取上清液转移至新的5mL离心管；同样操作3次，最大可能洗去多糖、蛋白质的污染。

在上清液中加入0.6倍体积异丙醇室温沉淀1h，11000r/min下离心10min，弃上清。

5、沉淀以1ml冰预冷的70%乙醇轻微振荡洗涤，4℃下以13000r/min离心3min；沉淀再以0.7ml冰预冷的无水乙醇再次轻微振荡洗涤，4℃下以13000r/min离心2min。

五种蚕沙堆肥微生物总DNA提取方法的对比研究

基金项目：现代农业产业技术体系建设专项（No.CARS-22）；广东省科技计划项目（No.2012A020200013）；2014年茧丝绸发展专项资金项目（粤商务建函［2014］196号）。

作者简介：李丽（1983-），女，硕士，助理研究员，E-mail ：liliaaa666@ 通信作者：杨琼（1970-），女，硕士，研究员，E-mail ：serilover@我国是养蚕大国，蚕桑业在国际上占有绝对的主导地位。

蚕沙是养蚕生产中的大宗废弃物，鲜蚕沙包括幼蚕饲养过程中排放的固体粪便、剩桑，以及消毒留下的石灰和蚕座中的垫料。

蚕沙随意丢弃引发的蚕病暴发及环境污染不可忽视。

堆肥是控制蚕沙污染、变废为宝的主要途径。

微生物是有机堆肥发酵的主体，堆肥过程微生物群落结构演替非常迅速多样［1］。

目前，应该传统分离培养技术仅能得到自然界中<1%的微生物，超过99%的微生物尚不能被纯培养（unculturedmicroorganisms ）［2-5］。

而基于DNA 分析的分子生物学技术，尤其是宏基因组技术的兴起，使得对包含不可培养菌的环境微生物学进行研究成为可能［6］。

由于蚕沙性质与土壤类似，含多种理化性质复杂的物质，直接影响高产量、高纯度的大分子量土壤DNA 的获得。

尤其是大量的腐殖酸、酚类和微量重金属可能对分子生物学操作过程中PCR 扩增、酶活、转化效率及DNA 的杂交特异性等［7-9］产生抑制。

此外，微生物与蚕沙颗粒吸附紧密，也会增加DNA 提取的难度［10］。

因此，建立堆肥蚕沙微生物高质量DNA 分离方法，是进行蚕沙堆肥微生物分子生物学研究的前提。

本试验选取五种方法从堆肥蚕沙中提取总DNA ，对DNA 的得率和质量进行比较分析，并对微生物核基因特异片段进行PCR 扩增效果检测、以期建立一种高效、简便的DNA 提取方法，为后续的蚕沙堆肥微生物分子生物学研究提供理论和技术参考。

DOI ：10.3969/j.issn.2095-1205.2015.03.07五种蚕沙堆肥微生物总ＤＮＡ提取方法的对比研究李丽廖森泰邢东旭肖阳李庆荣叶明强杨琼（广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，广东广州510610）摘要采用5种方法提取蚕沙堆肥中微生物总DNA ，测定粗提液的吸光值，进一步利用通用引物对细菌16S rDNA 基因V4可变区和真菌ITS 区进行PCR 扩增，对扩增产物进行电泳分析，最后对不同方法的提取效果进行综合比较。

专业资料 DNA提取原理及步骤简述

DNA提取原理及步骤简述
DNA提取的步骤主要有裂解、结合、洗涤和洗脱。

以下是各步骤的作用原理：
1.裂解：这一步是必须的，因为DNA通常从细胞或其他生物
物质中被释放出来。

细胞裂解可以通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。

其中，酶作用主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶使细胞破裂，核酸释放。

蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的分离。

2.结合：磁珠表面带负电荷，磁珠buffer是高盐环境有带
正电荷的盐离子，样本被buffer影响，磷酸基团带负电荷。

3.洗涤：核酸的高电荷磷酸骨架使其比蛋白质、多糖、脂肪
等其他生物大分子物质更具亲水性，根据它们理化性质的差异，用选择性沉淀、层析、密度梯度离心等方法
可将核酸分离、纯化。

用无水乙醇沉淀DNA,这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。

乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此
是理性的沉淀剂。

当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。

4.洗脱：加水或者EB破坏高盐环境，形成低盐环境，使
DNA从磁珠上脱落。

请注意，以上步骤的作用原理可能因具体实验条件和设备而有所不同。

在进行实验时，请根据具体情况调整步骤和参数。

基因组DNA抽提操作流程

基因组DNA抽提操作流程
1.收集样本：首先需要从待测样本中收集细胞。

这可以是任何包含细胞核的生物组织，如血液、组织样本或细菌培养物。

选择合适的样本类型根据具体的研究目的和实验要求。

2.细胞裂解：将收集到的样本进行细胞裂解，使细胞内部的DNA释放出来。

这可以通过一系列方法实现，如物理破碎、化学裂解或酶的作用。

具体使用哪种方法取决于待测细胞的特点和实验室的设备条件。

3.蛋白质去除：在细胞裂解的过程中，细胞核中的DNA会与蛋白质连接在一起形成复合物，需要进一步去除蛋白质。

可以使用蛋白酶对DNA溶液进行处理，将蛋白质降解分解，并使用盐溶液或酒精进行去除。

4.DNA沉淀：将去除蛋白质的DNA溶液中加入盐溶液或酒精，使DNA 沉淀下来。

这可以通过离心的方法加快DNA的沉淀速度。

离心操作常常需要根据DNA溶液的体积和设备的转速进行优化。

5. 溶解DNA：将沉淀下来的DNA溶于适当的缓冲液中，使其稳定并易于后续的分析和实验。

常用的溶解液包括TE缓冲液（含有Tris-HCl和EDTA）或纯化水。

6.检测DNA浓度和纯度：使用光谱分析仪或比色法等方法检测DNA的浓度和纯度。

这可以帮助确定DNA样本的适用性和是否需要进一步纯化。

需要注意的是，基因组DNA抽提的操作步骤可能会因实验目的和样本类型的不同而有所差异。

在具体操作过程中，应该根据实验室的设备和实验条件进行优化和调整。

同时，实施基因组DNA抽提操作的人员还需要注意安全规范，避免对人体和环境造成潜在的危害。

玻璃珠法提取堆肥微生物总DNA及其DGGE分析

ＴｏａｔｌＤＮＡｘｒｃｉｎｏｔｃｍｐｏｔｎｇｍｉｒｏｇｎｉｍｌｓａｏｒＤＧＧＥｎｙｉｅｔａｔｏｆｈｏｏｓｉｃｏｒａｓｂｙｇａｓｂｅｄｓｆａａｌｓｓ
ＧＵａＨＡＮＧＪｎｉｎＯＹｎ，Ｚｉｌｇ，ＤＧｈｎｙｎ，ＺａＥＮＣａｇａＨＵＮｅｇ ’ ｎｗｕ（．ＤｐｒｅｔｆｉｃｎｅＳａｇｉＴａｈｒＣｌｇ，ｈｎｑｕ４６０，ｈｎ；．Ｃｌｇｆｎｍｌ１ｅａｔｎｏＬｆＳｉｃ，ｈｎｑｕｅｃｅｓｏｌｅＳａｇｉ７００Ｃｉ２ｏｅｅｏｉａｍｅｅｅａｌＡ
第２６卷第１２期
２１００年１月２
商丘师范学院学报ＪＵＮＬＯＨＮＱＵＴＡＨＥＳＣＬＥＥＯＲＡＦＳＡＧＩＥＣＲＯＬＧ
Ｖ０．６１２Ｎｏ１．２Ｄｅ．ｃ２００１
玻璃珠法提取堆肥微生物总ＤＡ及其ＤＮＧＧＥ分析
ｔｃｏｏｙ．ＴｈｅｕｌｎｉａｄｔａｌｓｅｄａｘｒｃｃｏｒａｉｍｏａｅｈｎｌｇｅｒｓｔｉｄｃｅｈｔｇａｓｂａｓｃｎｅｔａｔｍｉｒｏｇｎｓｔｔｌＤＮＡｒｍｔｃｍｐｓｉｇｑｉｋｙ，ｓｆｏｈｏｏｏｔｎｕｃｌｍｏｅｕｌｒｓｚｆＤＮＡｏｔｉｄｕｉｇｔｉｒｔｃｌｗａａｏｔ２ｋａｄａｅｂｃｅｉｌ６Ｓｒｌｃａｉｅｏｂａｎｅｓｎｈｓｐｏｏｏｓｂｕ３ｂｎｕａｔｒａ１ＲＮＡｅｅａｇｔｄｇｎｔｒｅｅ

环境微生物样品总群落基因组DNA提取(PowerSoil_DNA提取试剂盒)

环境微生物样品总群落基因组DNA提取（PowerSoil_DNA提取试剂盒）PowerSoil DNA Isolation Kit (MoBio)●PCR抑制物去除技术(Inhibitor Removal Technology, IRT)●适用于高腐殖酸环境样品(如堆肥、底泥和土壤等)●已被广泛用于PCR检测各种微生物，包括细菌、真菌、藻类和放线菌等●基本原理：细胞裂解->总基因组DNA与硅胶膜结合->DNA洗脱操作步骤：1.将0.25克土壤样品加入或转移至PowerBead Tube作用：在您的样品已被加载到PowerBead管，下一步是一个同质化和裂解过程。

PowerBead管包含了一个缓冲区，有三种功能（1）帮助分散的土壤颗粒（2）开始降解腐殖酸（3）保护降解核酸。

2.稍涡旋混匀3.检查Solution C1（裂解缓冲液）；若有沉淀，则在60oC加热溶解作用：C1的功能包含SDS和其他破坏需要完整的细胞溶解剂。

除了协助细胞裂解，SDS还是一种阴离子洗涤剂，分解脂肪酸和某些脂质与一些生物的细胞膜。

如果天气变冷，就会形成白色沉淀在瓶子里。

加热至60摄氏度将降解SDS而不会伤害SDS或其他干扰剂。

C1的可以使用，而它仍然适温，4.加60 ul Solution C1（裂解缓冲液），颠倒数次或稍涡旋混匀5.装上涡旋适配器并以最大速度涡旋10 min作用：该涡旋步骤是完全同质化和细胞裂解的关键。

细胞是由溶解从步骤1-4和机械振动在这一步引入组合化学药剂。

通过随机振动的干扰剂存在下，珠与珠碰撞微生物细胞会造成细胞破开。

钼生物涡适配器被设计成一个简单的平台，促进保持管紧紧贴在旋涡。

应该指出的是，尽管你可以用胶带连接管，往往是磁带变得松散，不是所有管会摇匀或有效。

这可能会导致或不一致的结果单产下降。

因此，对莫生物涡适配器是一个高度推荐使用和成本的获得最大的DNA产量有效途径。

6.10,000 g离心30 sec（注意：绝不能超过10,000 g!）7.将上清液（400-500 ul）转移至干净的2 ml收集管8.加250 ul Solution C2（抑制物去除液-1），涡旋5 sec后于4oC放置5 min作用：它包含一种试剂，该试剂由各种有机和无机材料组成，包括腐殖质，细胞碎片，和蛋白质。

DNA提取实验

DNA提取实验DNA提取是现代生物学研究的基础实验之一，它可以从生物体内分离和纯化DNA分子，为各种分子生物学技术和研究提供重要的基础。

本实验旨在介绍DNA提取的基本步骤和操作技巧。

材料和仪器：1. 新鲜的生物样本（如水果、蔬菜、口腔拭子等）2. DNA提取试剂盒3. 离心管4. 加热器5. 离心机6. 显微镜实验步骤：1. 样本处理：a) 将生物样本取出，如水果则切成小块，口腔拭子可直接使用。

b) 将样本放入离心管中。

c) 使用试剂盒提供的试剂，在样本中加入适量的细胞裂解缓冲液。

d) 轻轻摇动离心管，使样本与缓冲液均匀混合。

e) 将离心管放入加热器中，在60摄氏度恒温加热20-30分钟，以促进细胞的破裂和DNA的释放。

2. 细胞裂解：a) 将加热后的样本离心管取出，稍微晃动离心管使样本充分混合。

b) 加入适量的蛋白酶，用离心管盖密封离心管，并再次摇动离心管混合。

c) 将离心管放入加热器中，以高温（通常为60-65摄氏度）恒温孵育10分钟，以使蛋白酶发挥作用，降解细胞蛋白。

3. DNA沉淀：a) 将加热后的样本离心管取出，加入等体积的冷异丙醇，并摇动离心管使两者充分混合。

b) 将混合溶液离心10-20分钟，以最大速度离心沉淀DNA。

c) 抽掉上层溶液，离心沉淀的DNA。

d) 加入适量的70%乙醇洗涤一次，以去除残留的盐和其他杂质。

e) 将离心管倒置于纸巾上，待乙醇挥发后，加入适量的去离子水重新溶解DNA。

4. DNA纯化：a) 使用显微镜观察提取的DNA溶液中是否有明显的纹理和颜色，以确保DNA提取的成功。

b) 使用测量纯度和浓度的仪器对提取的DNA进行定量分析，并记录结果。

c) 将DNA溶液保存在低温冷冻条件下，以防止DNA的降解和损伤。

实验注意事项：1. 实验前需佩戴实验手套和口罩，防止污染和细菌感染。

2. 操作过程中需注意无菌操作，避免污染。

3. 实验前要确保所有仪器和材料已经正确消毒和清洗。

大量土壤样品dna提取处理流程

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