mtDNA测序结果分析2003
线粒体遗传病
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线粒体遗传病简介线粒体遗传病是一类由线粒体异常导致的遗传疾病,通常会影响身体的能量产生和细胞功能。
线粒体是细胞内的一个细小器官,负责生产细胞所需的能量(ATP)。
线粒体有自己的DNA,其中编码了一小部分参与线粒体功能的蛋白质。
线粒体遗传病可以通过遗传给下一代,也可以在个体发生随机突变时产生。
线粒体结构和功能线粒体是细胞的动力中心,它们是细胞内的能量生产工厂。
线粒体提供细胞所需的大部分ATP,以供细胞的各种生化反应和功能运作。
线粒体有自己的DNA,称为线粒体DNA(mtDNA)。
mtDNA是环状的,由37个基因编码,其中包括13个编码蛋白质、22个编码转运RNA和2个编码核糖体RNA。
这些蛋白质参与线粒体内的能量产生,并与细胞核中编码的蛋白质相互协作。
线粒体遗传病可能是由于mtDNA中的突变导致的。
这些突变可以影响线粒体蛋白质的功能,进而影响细胞的能量产生和其他线粒体相关功能。
线粒体遗传病的类型线粒体遗传病有多种不同的类型,其临床表现和症状也有很大的变化。
下面是一些常见的线粒体遗传病类型:韦尔尼柯-霍夫综合征韦尔尼柯-霍夫综合征是一种常见的线粒体疾病,具有多系统受累的表现。
病人通常会表现为进行性视力丧失、耳聋、心肌病、神经肌肉病等症状。
米尔瓦-格拉斯病米尔瓦-格拉斯病是一种罕见的线粒体疾病,主要影响心血管和神经系统。
症状可能与心肌病、运动障碍和智力障碍有关。
卡尼特-鲍尔病卡尼特-鲍尔病是一种遗传性神经肌肉病,病人通常会表现为进行性肌无力、运动障碍和呼吸衰竭等症状。
增生性肌病增生性肌病是一类由线粒体DNA突变导致的肌无力病。
这些突变会导致肌肉的进行性退化和功能障碍。
线粒体遗传病的诊断和治疗线粒体遗传病的诊断通常涉及以下几个方面:1.临床症状评估:医生会根据病人的症状和体征进行初步评估,如视力丧失、肌肉无力、心脏问题等。
2.实验室检测:通过检测血液、尿液或其他组织的线粒体功能和结构指标来帮助诊断,如乳酸、丙酮酸和氨基酸水平的测定,线粒体DNA的测序等。
DNA测序常见问题及分析
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DNA测序过程可能遇到的问题及分析对于一些生物测序公司(如Invitrogen等),我们的菌液或质粒经过PCR和酶切鉴定都没问题,但几天后的测序结果却无法另人满意。
为什么呢?PCR产物直接进行测序,在PCR产物长度以后将无反应信号,机器将产生许多N值。
这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基,我们所用的T载体克隆PCR产物就是应用该原理,通常PCR产物结束的位点,PCR产物测序一般末端的一个碱基为A(绿峰),也就是双脱氧核甘酸ddNTP终止反应的位置之前的A,A后的信号会迅速减弱。
N值情况一般是由于有未去除的染料单体造成的干扰峰。
该干扰峰和正常序列峰重叠在一起,有时机器377以下的测序仪无法正确判断出为何碱基。
有时,在序列的起始端的小片段容易丢失,导致起始区信号过低,机器有时也无法正确判读。
在序列的3’端易产生N值。
一个测序反应一般可以读出900bp以上的碱基(ABI3730可以达到1200bp),但是,只有一般600bp以前的碱基是可靠的,理想条件下,多至700bp的碱基都是可以用的。
一般在650bp以后的序列,由于测序毛细管胶的分辩率问题,会有许多碱基分不开,就会产生N值。
测序模板本身含杂合序列,该情况主要发生在PCR产物直接测序,由于PCR产物本身有突变或含等位基因,会造成在某些位置上有重叠峰,产生N值。
这种情况很容易判断,那就是整个序列信号都非常好,只有在个别位置有明显的重叠峰,视杂合度不同N值也不同。
测序列是从引物3’末端后第一个碱基开始的,所以就看不到引物序列。
有两种方法可以得到引物序列。
1.对于较短的PCR产物(<600bp),可以用另一端的引物进行测序,从另一端测序可以一直测通,可以在序列的末端得到该引物的反向互补序列。
对于较长的序列,一个测序反应测不通,就只能将PCR产物片段克隆到载体中,用载体上的通用引物(T7/SP6)进行测序。
载体上的通用引物与所插入序列间有一段距离,因此就可以得到完整的引物序列。
DNA测序数据分析与应用研究
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DNA测序数据分析与应用研究DNA测序是一项重要的生物学技术,通过对DNA序列的测定可以揭示生物体的遗传信息,为基因组学、生物医学研究和临床诊断提供了重要的工具。
随着测序技术的不断发展和成熟,高通量测序技术的出现使得大规模的DNA测序成为可能,从而推动了DNA测序数据分析与应用的研究。
DNA测序数据分析是指对测序仪生成的原始序列数据进行处理、整理和解读的过程。
这些原始序列数据通常是由测序仪以碱基序列的形式输出,以FASTQ格式或BAM格式存储。
DNA测序数据分析的主要任务包括序列质量控制、序列比对、变异检测和功能注释等。
在序列质量控制方面,由于测序过程中可能存在测序错误、质量降低和杂质等问题,因此需要对原始序列数据进行质量控制。
常用的质量控制方法包括去除低质量序列、去除接头序列和去除PCR扩增引物序列等。
这些步骤可以有效地提高测序数据的质量,减少后续分析的误差。
序列比对是DNA测序数据分析的重要环节。
通过将测序数据与参考基因组进行比对,可以确定测序数据在参考基因组上的位置。
常用的序列比对算法包括BLAST、Bowtie和BWA等。
通过序列比对,可以确定测序数据中的SNP(单核苷酸多态性)、InDel(插入缺失)和SV(结构变异)等变异信息,为后续的变异检测和功能注释提供基础。
变异检测是DNA测序数据分析的核心内容之一。
通过比对测序数据和参考基因组,可以发现个体间的遗传变异。
常用的变异检测方法包括单样本变异检测和群体变异检测。
单样本变异检测可以发现个体间的SNP、InDel和SV等变异,而群体变异检测可以发现不同个体间的遗传变异,从而研究个体间的遗传差异和群体遗传结构。
功能注释是DNA测序数据分析的重要环节之一。
通过对变异位点进行功能注释,可以揭示变异位点对基因功能和表达的影响。
常用的功能注释方法包括注释SNP的功能类别、预测SNP对蛋白质结构和功能的影响、注释SNP对基因表达的影响等。
功能注释可以帮助研究人员理解变异位点的生物学意义,从而进一步研究其与疾病的关联。
线粒体DNA异常与肿瘤的相关性
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线粒体DNA异常与肿瘤的相关性龙廷综述摘要:线粒体DNA(mtDNA)是真核细胞中唯一独立于核DNA之外的遗传物质,其特殊的环境、结构与功能以及在肿瘤细胞中所表现出的高比率异常,提示mtDNA与肿瘤发生之间存在密切的相关性。
mtDNA异常与肿瘤之间的相互关系及其作用和调控机制仍是当前研究热点。
关键词:线粒体DNA,肿瘤线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)是真核细胞中唯一存在的独立于核DNA之外的遗传物质,被称为“人类第25号染色体”。
近年来在多种肿瘤组织中相继发现了线粒体DNA 异常,而且线粒体DNA 的突变率明显高于核基因,目前趋向认为肿瘤的生物学特征不仅取决于核内遗传物质,而且与核外线粒体DNA密切相关,线粒体DNA异常可能参与肿瘤发生。
1 线粒体DNA的结构与功能特点Aderson等人于1981年首先完成对人类mtDNA全序列的测定[1]。
mtDNA是一条全长16569bp的双链闭环分子,一条为重链(H链),含较多鸟嘌呤,是12S和16S rRNA基因、14种tRNA基因及12种蛋白多肽基因的模板,另一条为轻链(L链),含较多胞嘧啶,是8种tRNA基因和1种蛋白多肽基因的模板。
mtDNA基因组内编码的13种蛋白多肽分布为:复合体Ⅰ(NADH-泛醌还原酶,NADH dehydogenase-uˉbiquinene oxidoreductase,ND)中7个亚基(ND 1 ,ND 2 ,ND 3 ,ND 4 ,ND 4L ,ND 5 ,ND 6 );复合体Ⅲ(泛醌-细胞色素C还原酶,ubiquinone-cytodhrome c oxidoreductase)中1个亚基(Cytb);复合体Ⅳ(细胞色素C氧化酶,cytochrome c oxidase,CO)中3个亚基(COⅠ,COⅡ,COⅢ)和复合体V(ATP合酶,A TPsynthase)中2个亚基(ATPase6和ATPase8)。
DNA测序过程可能遇到的问题及分析
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DNA测序过程可能遇到的问题及分析对于一些生物测序公司(如Invitrogen等),我们的菌液或质粒经过PCR和酶切鉴定都没问题,但几天后的测序结果却无法另人满意。
为什么呢?PCR产物直接进行测序,在PCR产物长度以后将无反应信号,机器将产生许多N值。
这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基,我们所用的T载体克隆PCR产物就是应用该原理,通常PCR产物结束的位点,PCR产物测序一般末端的一个碱基为A(绿峰),也就是双脱氧核甘酸ddNTP 终止反应的位置之前的A,A后的信号会迅速减弱。
N值情况一般是由于有未去除的染料单体造成的干扰峰。
该干扰峰和正常序列峰重叠在一起,有时机器377以下的测序仪无法正确判断出为何碱基。
有时,在序列的起始端的小片段容易丢失,导致起始区信号过低,机器有时也无法正确判读。
在序列的3’端易产生N值。
一个测序反应一般可以读出900bp以上的碱基(ABI3730可以达到1200bp),但是,只有一般600bp以前的碱基是可靠的,理想条件下,多至700bp的碱基都是可以用的。
一般在650bp以后的序列,由于测序毛细管胶的分辩率问题,会有许多碱基分不开,就会产生N值。
测序模板本身含杂合序列,该情况主要发生在PCR产物直接测序,由于PCR产物本身有突变或含等位基因,会造成在某些位置上有重叠峰,产生N值。
这种情况很容易判断,那就是整个序列信号都非常好,只有在个别位置有明显的重叠峰,视杂合度不同N值也不同。
测序列是从引物3’末端后第一个碱基开始的,所以就看不到引物序列。
有两种方法可以得到引物序列。
1.对于较短的PCR产物(<600bp),可以用另一端的引物进行测序,从另一端测序可以一直测通,可以在序列的末端得到该引物的反向互补序列。
对于较长的序列,一个测序反应测不通,就只能将PCR产物片段克隆到载体中,用载体上的通用引物(T7/SP6)进行测序。
载体上的通用引物与所插入序列间有一段距离,因此就可以得到完整的引物序列。
DNA测序结果中常见的几个问题
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1 、为什么开始一段序列的信号很杂乱,几乎难以辨别?这主要是因为残存的染料单体造成的干扰峰所致,该干扰峰和正常序列峰重叠在一起;另外,测序电泳开始阶段电压有一个稳定期,所以经常有20-50 bp 的紧接着引物的片段读不清楚,有时甚至更长。
2 、为什么在序列的末端容易产生N 值,峰图较杂?由于测序反应的信号是逐渐减弱的,所以序列末端的信号会很弱,峰图自然就会杂乱,加上测序胶的分辨率问题,如果碱基分不开,就会产生N 值,正常情况下ABI377测序仪能正确读出500个碱基的有效序列。
3 、测序结果怎么找不到我的引物序列?如果找不到测序所用的引物序列。
这是正常的,因为引物本身是不被标记的,所以在测序报告中是找不到的;如果找不到克隆片段中的扩增引物,可能是您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近,开始一段序列很杂,几乎难以辨别,有可能看不清或看不到扩增引物;另外插入片段的插入方向如果是反的,此时需找引物的互补序列。
4 、测序结果怎么看不到我克隆的酶切位点?可能的原因同上,您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近,开始一段序列很杂,几乎难以辨别,有可能看不清或看不到酶切位点。
通常我们会尽量选择距离酶切位点远点的引物,当然,若是样品出现意外原因,如空载、载体自连等,克隆的酶切位点也是看不到的。
5 、你测出的结果与我预想的不一致,给我的结果与我需要的序列有差距,这是怎么回事? 首先,我们会核实给您的测序结果是否对应您的样品编号,如果对应的是您的样品,由于不知您的实验背景,测得的序列是否与您预想的结果一致我们无法判断,我们能做到的是检查发送给您的测序结果和您提供来的样品是否一致。
6 、序列图为什么会有背景噪音(杂带)?是否会影响测序结果?序列图的背景杂带是由荧光染料引起,如果太强会影响测序结果,要看信噪比,我们给的结果信噪比大都在98%以上。
7 、测序结果为什么与标准序列有差别?原因可能有:样品个体之间的差别、测序准确率的问题,自动测序仪分析序列的准确并非100%,建议至少测一次双向,通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。
测序后分析实验报告
![测序后分析实验报告](https://img.taocdn.com/s3/m/df717a34ae1ffc4ffe4733687e21af45b307fef9.png)
一、实验目的本次实验旨在通过对DNA或RNA样本进行测序,获取其基因序列信息,并对测序结果进行生物信息学分析,以揭示样本的遗传特征、基因变异等信息。
实验过程包括样本准备、测序、数据质量控制、序列比对、基因注释等步骤。
二、实验材料1. 样本:实验样本为某物种的DNA或RNA,样本数量为5份。
2. 试剂:DNA/RNA提取试剂盒、PCR试剂盒、测序试剂盒等。
3. 仪器:PCR仪、测序仪、凝胶成像系统、计算机等。
三、实验方法1. 样本准备:提取样本中的DNA或RNA,并进行PCR扩增。
2. 测序:将扩增后的产物进行测序,获取基因序列信息。
3. 数据质量控制:对测序数据进行质量控制,包括去除低质量序列、校正序列、去除重复序列等。
4. 序列比对:将处理后的序列与参考基因组进行比对,找出与参考基因组一致的序列。
5. 基因注释:对比对结果进行基因注释,包括基因名称、功能、位置等。
6. 基因变异分析:对样本序列与参考基因组进行比对,找出基因变异位点,并进行功能注释。
四、实验结果1. 测序数据:5份样本共获得约10万个高质量序列,平均长度为500bp。
2. 数据质量控制:去除低质量序列、校正序列、去除重复序列后,保留高质量序列约8万个。
3. 序列比对:将处理后的序列与参考基因组进行比对,共发现约1000个基因变异位点。
4. 基因注释:对基因变异位点进行功能注释,发现其中约300个为已知基因,其余为未知基因。
5. 基因变异分析:对已知基因进行变异分析,发现其中约50个基因存在显著变异,可能与疾病、表型等密切相关。
五、讨论与分析1. 测序数据质量:本次实验中,测序数据质量较高,平均Q20值达95%以上,说明实验操作规范,测序仪性能稳定。
2. 数据质量控制:数据质量控制是生物信息学分析的重要环节,本实验通过去除低质量序列、校正序列、去除重复序列等手段,保证了后续分析的准确性。
3. 序列比对:序列比对是基因变异分析的基础,本实验采用BLAST等比对工具,确保了比对结果的可靠性。
中国不同人群线粒体DNA遗传多样性研究进展
![中国不同人群线粒体DNA遗传多样性研究进展](https://img.taocdn.com/s3/m/d7d65fd4aff8941ea76e58fafab069dc502247ac.png)
• 54 •国际遗传学杂志202丨年2月15日第44卷第1期丨nt J Genet Feh. 15,2021,V〇1.44,N〇.1•综述•中国不同人群线粒体DNA遗传多样性研究进展贾曼莎于景翠哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心150081通信作者:于景翠,Email:yujingcui@【摘要】线粒体DNA ( mitochondrial DNA, mtDNA )是特殊的遗传物质,具有母系遗传、高突变率、高拷贝数和无重组特性,广泛应用于进化遗传学、法医学和分子诊断等领域。
对nitDNA遗传标记的研究可以反映一个群体的母系脉络特征,有助于推断群体的母系起源、分析迁移轨迹以及不同群体间的系统发育关系。
本文将以达斡尔族为切入点,对达斡尔族人群mtDNA多样性作一综述;并追踪mtDNA遗传多样性在其他人群中的研究进展,为丰富中国人群的遗传信息资源提供重要资料。
【关键词】达斡尔族;线粒体D N A;母系遗传;单倍群;遗传多样性DOI :10.3760/cma.j .cn231536-20200915-00090Research progress in mitochondrial DNA genetic diversity of different populations in ChinaJia Mansha, Yu JingcuiScientific Research Center, the Second Affiliated Hospital o f H arbin Medical University, Harbin 150081,ChinaCorresponding author: Yu Jingcui, Email:*******************【Abstract 】Mitochondrial DNA (mitochondrial DNA, mtDNA) is a special genetic material thathas the characteristics of maternal inheritance, high mutation rate, high copy number and no recombination. It has been applied extensively in fields involving evolutionary genetics, forensic science and moleculardiagnosis. The study of mtDNA genetic markers can reflect matrilineal characteristics of a population, helpto infer the matrilineal origin of the population, analyze the migration trajectory and the phylogenetic relationship between different populations. This article takes the Daur as an entry point to summarize the mtDNAdiversity of the Daur population, track the research progress in mtDNA genetic diversity in other populations, and provide important information for enriching the genetic information resources of the Chinese population.【Key words 】Daur; Mitochondrial DNA; Maternal inheritance; Haplogroup; Genetic diversityDOI :10.3760/231536-20200915-00090中国是一个多民族国家,在辽阔的版图上共 同生活着56个民族。
多种遗传标记在一起同母异父半同胞关系鉴定中的综合应用
![多种遗传标记在一起同母异父半同胞关系鉴定中的综合应用](https://img.taocdn.com/s3/m/6113bd76492fb4daa58da0116c175f0e7cd119cf.png)
·遗传与出生缺陷·多种遗传标记在一起同母异父半同胞关系鉴定中的综合应用陈婷婷 孙丽娟 马娅萍 杜应雄 叶峻杰作者单位:650021昆明,云南省人口和计划生育科学技术研究所司法鉴定中心,国家卫生计生委西部孕前优生重点实验室,云南省生育调节与少数民族优生重点实验室通讯作者:叶峻杰(yejunjie111@126 com)【摘要】 目的 探讨多种遗传标记在一起同母异父半同胞关系鉴定中的综合应用。
方法采用常染色体STR遗传标记、Y染色体STR遗传标记、线粒体DNA遗传多态性对甲和乙进行基因分型,根据分型结果,采用IBS法、ITO法和判别函数法进行半同胞关系的判定。
结果依据常染色体STR基因分型结果,IBS法评分结果无法判断甲与乙之间存在全同胞关系;通过ITO法和判别函数法分析计算,提示甲与乙存在半同胞亲缘关系;进一步依据Y染色体STR基因分型结果,排除了甲和乙来源于同一生父,同时线粒体DNA高变I区多态性检测结果提示甲与乙来自同一生母,支持甲与乙为同母异父半同胞关系。
结论综合应用多种遗传标记和判定方法对同母异父半同胞关系的鉴定有着重要的意义。
【关键词】 遗传标记; 同胞关系鉴定; Y STR; 线粒体DNA 同胞关系分为同父同母的全同胞关系(fullsibling,FS)和同父异母或同母异父的半同胞关系(halfsibling,HS)。
在同胞关系鉴定实际案件中,为了获得可靠的鉴定结论,除了常染色体短串联重复(shorttandemrepeat,STR)遗传标记的检测外,还要增加其他遗传标记的检测以获得更多可靠的判定依据。
本文在实际工作中受理一起同胞鉴定案例,由于当事人叙述无法判别两个被鉴定人是否为全或半同胞关系,根据案件的具体情况在进行常染色体STR遗传标记检测后,运用状态一致性评分法(identitybystate,IBS)、ITO法和判别函数法多种判定方法,并联合Y染色体STR遗传标记和线粒体DNA(mitochondrialDNA,mtDNA)序列分析对案件中被鉴定人的关系进行综合分析判断,获得了可靠的结论。
中国藏族群体mtDNA控制区多态性
![中国藏族群体mtDNA控制区多态性](https://img.taocdn.com/s3/m/b424482bb80d6c85ec3a87c24028915f804d841e.png)
中国藏族群体mtDNA控制区多态性唐晖;马万山;刘雅诚;刘莹;翁海瑜;侯一平【期刊名称】《中国法医学杂志》【年(卷),期】2003(018)001【摘要】对不同民族人群进行mtDNA序列分析,可以揭示不同群体mtDNA多态性特点,有助于mtDNA分析技术的法医学应用。
本文作者用PCR产物直接测序法,对中国西藏那曲地区藏族42名无关个体的mtDNA控制区进行全序列测定,并对其进行统计学分析。
【总页数】2页(P40-41)【作者】唐晖;马万山;刘雅诚;刘莹;翁海瑜;侯一平【作者单位】北京市公安局法医检验鉴定中心,北京,100085;四川大学基础与法医学院,四川,成都,610041;北京市公安局法医检验鉴定中心,北京,100085;北京市公安局法医检验鉴定中心,北京,100085;四川大学基础与法医学院,四川,成都,610041;西藏自治区公安厅,西藏,拉萨,850000;四川大学基础与法医学院,四川,成都,610041【正文语种】中文【中图分类】D919【相关文献】1.中国青海藏族、汉族mtDNA控制区遗传多态性 [J], 穆豪放;陈峰;熊新;张博;阎春霞;陈腾;邓亚军2.重庆地区汉族群体mtDNA控制区多态性研究 [J], 曹洋;万立华;刘春;黄映雪;胡淑辉3.中国广东汉族群体mtDNA控制区的多态性 [J], 孙宏钰;欧宁峰;陆惠玲;蔡贵庆;陈丽娴;伍新尧4.中国海南黎族群体mtDNA控制区多态性 [J], 马万山;唐晖;刘雅诚;刘莹;易升生;潘远义;雷国庆;朱金生5.中国西藏拉萨藏族群体mtDNA环区HVR-Ⅰ序列多态性研究 [J], 冯强;温有锋;任甫;苏荣健;席焕久因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
不同检材mtDNA检验结果的分析
![不同检材mtDNA检验结果的分析](https://img.taocdn.com/s3/m/04b743cdc0c708a1284ac850ad02de80d4d806ba.png)
不同检材mtDNA检验结果的分析任贺;唐晖;刘军;马万山;刘雅诚【期刊名称】《中国法医学杂志》【年(卷),期】2003(018)001【摘要】1 案例资料。
案例1 1999年2月,邹某(男,70岁)被刺致死。
提取嫌疑人的黑色皮衣(已清洗处理)检验,仅在袖口里衬发现一处绿豆大小的可疑血迹。
经种属检验为人血后,对其和死者血液进行mtDNA序列分析。
结果显示:皮衣里衬血与死者血的mtDNA均有如下改变,即16126A→G,16223G→A,16234C→T,16249A→G,16362A→G,16519T→C,00073A→G,00263A→G,00309.1C。
STR分型仅检出4个小片段基因座。
综合分析STR 分型与mtDNA测序结果,最终认定黑色皮衣上的血迹为邹某所留。
【总页数】2页(P59-60)【作者】任贺;唐晖;刘军;马万山;刘雅诚【作者单位】北京市人民警察学院,北京,100088;山西医科大学法医学院,太原,030001;北京市公安局法医检验鉴定中心,北京,100085;四川大学基础与法医学院,成都,610041;北京市人民警察学院,北京,100088;北京市公安局法医检验鉴定中心,北京,100085;北京市公安局法医检验鉴定中心,北京,100085【正文语种】中文【中图分类】D919【相关文献】1.4810份临床检材细菌检验结果分析 [J], 刘亚俊;姜冰;李雅萍2.1560例临床检材细菌检验结果分析 [J], 江艳丽3.8种不同检材提取DNA的结果分析 [J], 张永晨4.不同生物检材在毒品检测中的适用 [J], 刘艳5.不同生物检材在毒品检测中的适用 [J], 刘艳因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
两种柑橘线粒体DNA的获得与AFLP分析
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园 艺 学 报 2003,30(4):389~393Acta H orticulturae S inica两种柑橘线粒体D NA的获得与AFLP分析曹庆芹 伊华林 邓秀新3(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室,园艺林学学院,武汉430070)摘 要:为了研究柑橘种属间线粒体基因组的遗传多样性以及温州蜜柑胞质雄性不育的分子基础,采用了两个柑橘品种‘国庆1号’温州蜜柑和无核‘冰糖橙’的胚性愈伤组织作为提取线粒体的材料。
不连续蔗糖梯度超速离心法纯化线粒体。
提取的线粒体完整,具很强的荧光活性。
mtDNA片段在20kb左右,且无降解。
叶绿体探针rubisco L、核探针45s rRNA S outhern blotting没有检测到叶绿体DNA与核DNA,而线粒体探针apt6杂交获得一条5kb大小的带,说明用此提取方法可获得无污染的mtDNA。
4对AF LP引物共得到98条带,其中14条带有多态性。
关键词:柑橘;线粒体DNA;S outhern blotting;AF LP中图分类号:S666 文献标识码:A 文章编号:05132353X(2003)0420389205线粒体有自己的一套基因组,为半自主的遗传系统,能够编码呼吸传递链上一些重要酶的组分及膜蛋白等。
模式植物拟南芥的线粒体基因组DNA测序已经完成,且现已知有52种酶是线粒体DNA编码的〔1〕。
除拟南芥线粒体基因组研究较为清楚外,其它植物,尤其是木本植物线粒体基因组的研究,出于生态学或驯化瓶颈的目的,主要是追踪树木线粒体遗传物质的漂流〔2~4〕,以及研究胞质基因组的遗传分化。
而其它农作物的研究大多集中于线粒体DNA与胞质雄性不育的关系这一领域〔5〕。
大部分被子植物线粒体属母性遗传,线粒体DNA相对于核基因组来说要稳定得多,作为分子进化研究的手段具有重要作用。
在柑橘等果树植物中曾有关于温州蜜柑的雄性不育是由核质互作引起的报道〔6〕。
由于木本植物黄化苗不易获得,无疑为提取线粒体DNA增加了难度。
mtDNA多态性研究
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2.mtDNA代谢时间显著短于核DNA 2.mtDNA代谢时间显著短于核DNA 由于代谢过程中被损伤与破坏的线粒体需要不 断补充,这一速度的加快为碱基的突变提供了较 多的机会,而且一旦突变发生就将迅速的传递下 去。 3.mtDNA受溶变剂的作用 3.mtDNA受溶变剂的作用 由于mtDNA不为蛋白质压缩,所以线粒体在进行 由于mtDNA不为蛋白质压缩,所以线粒体在进行 氧化磷酸化和许多代谢反应时,一些自由基和一 些代谢中间产物就在其中积累,这些物质都是强 的诱化剂,致使mtDNA突变率增高。 的诱化剂,致使mtDNA突变率增高。
mtDNA多态性研究的缺点: mtDNA多态性研究的缺点: 多态性研究的缺点
1.mtDNA分子结构多样性问题 1.mtDNA分子结构多样性问题 虽然线粒体基因组大小和结构在脊椎动物十分 保守,在15.7-19.5kb之间,基因排列紧密,为闭 保守,在15.7-19.5kb之间,基因排列紧密,为闭 合环状分子,但在整个真核生物界中,线粒体基 因组大小和结构还是有很大差异的,这种差异可 能是由于原始的线粒体基因组在选择压力作用下, 有向小基因组和大基因组两个方向进化的可能, 因此,不同物种的mtDNA进化途径和速率就会存在 因此,不同物种的mtDNA进化途径和速率就会存在 差异,这样,用mtDNA对高分类阶元(界、门、纲 差异,这样,用mtDNA对高分类阶元(界、门、纲 等)物种进行系统进化研究就会比较复杂,所以, 线粒体基因不适合用于深层进化关系的研究。
3.线粒体DNA有无重组 3.线粒体DNA有无重组 线粒体DNA
线粒体基因组重组由Puhalla等在1967研究链孢霉缓慢 线粒体基因组重组由Puhalla等在1967研究链孢霉缓慢 生长品系和正常品系异接体时发现的,随后Thomas和 生长品系和正常品系异接体时发现的,随后Thomas和 Wilkie报道了酵母线粒体基因组有重组发生,但这些结论 Wilkie报道了酵母线粒体基因组有重组发生,但这些结论 仅是依据表型上的变异而得出的。80年代后期线粒体遗传 仅是依据表型上的变异而得出的。80年代后期线粒体遗传 重组在植物、真菌、原生生物普遍存在的事已为人们所认 识,但仍有很多人否认动物mtDNA有重组发生。 识,但仍有很多人否认动物mtDNA有重组发生。 Thyagarajann等于1996年用实验方法证明哺乳动物线粒 Thyagarajann等于1996年用实验方法证明哺乳动物线粒 体抽提物具有同源重组活性,并推测与mtDNA损伤修复有 体抽提物具有同源重组活性,并推测与mtDNA损伤修复有 关。1997年,Hyman工作组利用PCR技术进行体外验,再次 关。1997年,Hyman工作组利用PCR技术进行体外验,再次 向世人展示线粒体基因组重组在动物细胞内是可能发生的。 另外,多年的研究已经证明,与DNA代谢有关的酶 另外,多年的研究已经证明,与DNA代谢有关的酶 ,如核 酸内切酶、拓扑异构酶等,也存在于线粒体细胞核中,说 明动物线粒体基因组在一定程度上是相当活跃的, 因此 同源重组也是有可能发生的。
DNA测序常见问题分析及解决办法
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客户自己提供2ug纯化好的质粒
PCR产物定量
极低
重新电泳检测已纯化的PCR产物,确认有足够的量,或提供PCR原液由公司进行纯化
测序结果正常,与预期不符
找不到引物
质粒模板
检测是否为空载体,从其互补链上寻找,克隆位点离测序引物太近,长插入片段未测通。
PCR模板
不可能找到所用的测序引物,短片段可以从互补链上找到另一段的引物,长片段由于测不通,无法找到相应序列想得到全序列,短片段可以从两端进行测序,长片段需要经克隆后进行测序。
现象
可能原因
是否收费
收
不收
反应无信号或全部杂峰
引物与模板结合不好(引物或模板原因)
不收
质粒抽提未成功
质粒太大或活化方式不好、转化不好
不收
鉴定质粒或PCR浓度
建议50ul(pcr)/20ul(质粒)去离子水溶解
不收
帮助客户设计引物和序列拼接
不收
300bp以前中断或衰减
高级结构GC结构重复序列
PCR除外
收
客户提供引物导致测序结果不理想
引物不纯
收
质粒抽提成功率60%以下(大单)
质粒太大或活化方式不好、转化不好
质粒抽提不成功的,加收3元/质粒
验证实验结果,两次结果
一致
收2次费
不一致
收1收费
PCR原液纯化后
无反应结果
引物与模板结合不好(引物或模板原因)
收纯化费
不收测序费
测反向互补序列,AC结构不影响测序
严重的重复结构
测反向互补序列
模板特性决定的
根据具体情况决定
信号极弱或无信号
信号极弱或无信号
模板质量差
DNA测序结果分析
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学习通常一份测序结果图由红、黑、绿和蓝色测序峰组成,代表不同的碱基序列。
测序图的两端(本图原图的后半段被剪切掉了)大约50个碱基的测序图部分通常杂质的干扰较大,无法判读,这是正常现象。
这也提醒我们在做引物设计时,要避免将所研究的位点离PCR序列的两端太近(通常要大于50个碱基距离),以免测序后难以分析比对。
我的课题是研究基因多态性的,因此下面要介绍的内容也主要以判读测序图中的等位基因突变位点为主。
实际上,要在一份测序图中找到真正确实的等位基因多态位点并不是一件容易的事情。
由于临床专业的研究生,这些东西是没人带的,只好自己研究。
开始时大概的知道等位基因位点在假如在测序图上出现像套叠的两个峰,就是杂合子位点。
实际比对了数千份序列后才知道,情况并非那么简单,下面测序图中标出的两个套峰均不是杂合子位点,如图并说明如下:说明:第一组套峰,两峰的轴线并不在同一位置,左侧的T峰是干扰峰;第二组套峰,虽两峰轴线位置相同,但两峰的位置太靠近了,不是杂合子峰,蓝色的C峰是干扰峰通常的杂合子峰由一高一略低的两个轴线相同的峰组成,此处的序列被机器误判为“C”,实际的序列应为“A”,通常一个高大碱基峰的前面1~2个位点很容易产生一个相同碱基的干扰峰,峰的高度大约是高大碱基峰的1/2,离得越近受干扰越大。
一个摸索出来的规律是:主峰通常在干扰峰的右侧,干扰峰并不一定比主峰低。
最关键的一点是一定要拿疑似为杂合子峰的测序图位点与测序结果的文本序列和基因库中的比对结果相比较;一个位点的多个样本相比较;你得出的该位点的突变率与权威文献或数据库中的突变率相比较。
通常,对于一个疑似突变位点来说,即使是国际上权威组织大样本的测序结果中都没有报道的话,那么单纯通过测序结果就判定它是突变点,是并不严谨的,因一份PCR产物中各个碱基的实际含量并不相同,很难避免不产生误差的。
对于一个未知突变位点的发现,通常还需要用到更精确的酶切技术。
DNA测序分析常见问题整理
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酒精峰
特征:酒精峰位于序列的200bp-300bp碱基之间,图谱被“透明 抬高,其同样不影响其它序列的可靠性。
DNA测序分析常见问题整理
荧光物质污染
● 现象:红色峰异常高。 ● 原因:未知大分子荧光物质污染,恰好是红色,被软件误认为红色峰。 ● 对策:依次更换水、缓冲液、甲酰胺、测序胶、毛细管;清洗或更换胶 引导块、针筒。
DNA测序分析常见问题整理
有机物污染(瀑布效应)
● 现象:基线从高处突然下降。 ● 原因:有机物进入毛细管,受 激发产生一定波长的荧光,抬高 基线。 ● 对策:依次更换水、缓冲液、 甲酰胺、测序胶、毛细管;清洗 或更换胶引导块、针筒。
DNA测序分析常见问题整理
四、困难模板对测序结果的影响
① 特殊结构 ② Ploy结构 ③ 高GC ④ 重复序列 ⑤ 回文结构
Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzers
DNA测序分 析常见问题 整理
DNA测序分析常见问题整理
测序结果—峰图
四色图谱:每一种颜色对应一种碱基 A T CG
DNA测序分析常见问题整理
影响测序质量的主要因素
引物 DNA模板 纯化 困难模板 机器影响
DNA测序分析常见问题整理
“钉子”峰
● 现象:四色并存突然拔起的 尖峰,峰形锐利。 ● 原因:毛细管内有气泡、灰 尘、尿素结晶等,对激光全反射 。 ● 对策 – 灌胶时,避免气泡产生; – 上样前,样品先离心; – 毛细管、检测窗口保持清洁; – 胶内有尿素结晶时,注意不要 吸进注射器; – 样品纯化干净。
正常模板与噪音
PCR正常终止
PCR正常终止 后面的噪音峰
mtdna分子量
![mtdna分子量](https://img.taocdn.com/s3/m/70b5182eb94ae45c3b3567ec102de2bd9605deb5.png)
mtdna分子量
摘要:
1.mtdna 分子量简介
2.mtdna 分子量的计算方法
3.mtdna 分子量在研究中的应用
4.总结
正文:
1.mtdna 分子量简介
mtdna(线粒体DNA)是一种环状的双链DNA 分子,位于细胞质中的线粒体内。
mtdna 分子主要负责线粒体的基因表达调控,是细胞能量代谢的关键调控因子。
mtdna 分子量是指mtdna 分子的质量大小,通常以其中的碱基对数量来衡量。
2.mtdna 分子量的计算方法
mtdna 分子量的计算可以通过测序技术得到。
首先需要从细胞中提取mtdna,然后进行测序。
测序结果中的碱基对数量可以作为mtdna 分子量的计算依据。
通常情况下,mtdna 分子量在1.2-1.3×10^6 个碱基对之间。
3.mtdna 分子量在研究中的应用
mtdna 分子量在研究中具有重要意义。
首先,它可以作为线粒体基因组大小和复杂性的一个衡量指标。
其次,通过对不同物种、不同组织、不同发育阶段的mtdna 分子量进行比较,可以研究线粒体基因组的演化规律和功能特性。
此外,mtdna 分子量还可以作为研究线粒体疾病、代谢性疾病等相关疾病的分子基础。
4.总结
mtdna 分子量是线粒体DNA 分子质量大小的一个衡量指标,具有重要的研究价值。
线粒体DNA和Y染色体主要基因的研究进展
![线粒体DNA和Y染色体主要基因的研究进展](https://img.taocdn.com/s3/m/e58bff1dae45b307e87101f69e3143323868f571.png)
线粒体DNA和Y染色体主要基因的研究进展线粒体DNA(mtDNA)和Y染色体是人类继承的两个独特的遗传元素。
mtDNA位于线粒体中,是一个环形分子,编码一些重要的蛋白质和RNA分子,参与能量代谢过程。
而Y染色体则只在男性中存在,编码一些性别决定和性发育相关的基因。
对于mtDNA的研究,早在1960年代,科学家就发现了mtDNA的存在,并意识到其在人类进化和疾病中的重要作用。
随着分子生物学和基因测序技术的发展,人们开始更深入地研究mtDNA的遗传机制、突变和多样性等方面。
研究表明,mtDNA在遗传上呈现出母系传递的特点,即儿子只能从母亲那里获得其mtDNA,而不会从父亲那里继承。
这一遗传特性使得mtDNA有着很高的稳定性,可以用于人类的起源和进化研究。
基于mtDNA的研究,科学家发现了一系列人类的祖先线ages,如L1、L2、L3等,这些研究结果不仅揭示了人类起源和迁徙历史,也为人类起源突变的起源和多样性的形成提供了重要证据。
mtDNA的突变也与许多疾病的发生和发展相关,如癌症、心脑血管疾病等。
通过研究mtDNA突变与疾病的关系,科学家可以进一步了解疾病的机制,并为疾病的诊断和治疗提供新的思路。
在Y染色体的研究方面,最重要的发现之一是1997年科学家完成了第一个完整的人类Y染色体的测序,从而得以准确地了解其中的基因组成。
通过这项工作,人们发现了很多和男性特有特征相关的基因,如性决定基因SRY、抵抗疾病基因等。
Y染色体的研究不仅可以帮助我们了解性别决定和性发育的分子机制,也有助于研究男性特有疾病,如肾脏疾病、肌肉疾病等。
除了研究Y染色体和mtDNA的遗传机制和功能,科学家们还利用这两种遗传元素进行人类世系分析、犯罪学鉴定等方面的研究。
通过对Y染色体和mtDNA的多态性位点进行测序和分析,可以构建人类族群的家系树,追溯人类的迁徙和分化历史。
Y染色体和mtDNA的特定突变也可以用于犯罪学鉴定,如鉴定两个人是否具有共同的父系或母系血缘关系。
线粒体DNA的进化与分子生态学研究
![线粒体DNA的进化与分子生态学研究](https://img.taocdn.com/s3/m/035cbec7710abb68a98271fe910ef12d2af9a9cb.png)
线粒体DNA的进化与分子生态学研究线粒体是细胞中的一种细胞器,被认为是细胞的能量工厂。
线粒体DNA (mtDNA)是线粒体内的一种DNA,与细胞核DNA不同。
它只有一条环状分子,约有16,569个碱基对,编码了13种蛋白质、22种tRNA和2种rRNA。
在过去的几十年中,mtDNA的进化和分子生态学研究得到了广泛的关注。
首先,mtDNA进化的研究一直是遗传学家关注的焦点。
mtDNA有较高的速度和多样性,易于研究。
由于患病、遗传基因变异和其他原因,mtDNA会发生突变。
这些突变通常是由线粒体细胞自主复制和传递给子代。
因此,mtDNA可以用于分析物种原始进化过程的重要性。
通过比较 mtDNA 在不同物种之间的序列差异或在同一物种的不同群体之间的变异情况,我们可以了解生物种群的进化和遗传联系。
其次,mtDNA可以用来研究物种分布和生态系统的动力学。
由于mtDNA编码细胞内能量的产生所必需的基因,线粒体DNA的变异率通常比核DNA更高。
定义在物种内和个体之间的mtDNA基因型差异为遗传多样性,可以用它来评估物种或生态系统的动态变化。
例如,某些物种在过去没有受到人类干扰,其遗传多样性通常比在被捕猎、采伐或生态系统变化中受到影响的物种要高。
多种线粒体DNA的变异自然选择作用对物种适应性的构建,线粒体DNA 进化还可能与生物学知识相关的术语,例如基因流、漂移和缩小等进化过程。
最后,mtDNA还可以用于鉴定同时存在于不同物种或个体的遗传特征。
这种方法通常称为分群或物种鉴别。
通过针对mtDNA分子特定区域的PCR扩增、序列分析和系统发育树的构建,我们可以研究不同物种之间的遗传相似性和差异性,并经常应用于动物、微生物和植物物种的鉴定。
总之,mtDNA的进化和生态学研究在解释和预测物种适应性、生态系统功能、保护生物多样性、生物演化和分类学等领域具有重要的理论和实际意义。
随着高通量测序技术和多种线粒体DNA解析方法的发展,未来将有可能更深入地了解线粒体的进化和多样性。
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2009年遗传细胞学实验教学中心 皮妍 yanpi@
测序结果:3-205
测序结果:3-105
测序结果:3-108
测序结果:4-105&108
测序结果:4-205
测序结果:5-108
测序结果:5-105
* 注 特殊实验结果说明
结果
非单克隆
说明
所挑取的克隆不是单克隆,峰图表现为插入位点之后的
峰图是套峰,可通过重新挑取单克隆解决。
失败 poly结构 测序失败,不再返工。 样本本身存在单碱基重复,测序遇到poly结构后峰图变
乱,如果所得序列不够用,一般建议反向测序。
高级结构 从测序峰图上判断,样品存在高级结构,导致高级结构
后信号突然衰减、峰图变乱,如果所得序列不够用,一般建议反向测序。
序列分析结果: 红色为载体序 列的一段,中 间黄线标识的 为插入序列
去掉载体序列后的插入序列
NCBI上的比对结果(1):
NCBI上的比对结果(2):
NCBI上的比对结果(3):
部分序列的进化分析:
单核苷酸多态:
序列分析软件:Vector NTI 10 序列分析网址:
开设实验课程的目的主要是让大家了解实验的原理和操作过程,并 对实验结果进行合理的分析,为将来进入科研实验奠定基础。 一次实验的失败是为了下一次实验的成功! 希望大家在遗传学实验课程中都有所收获!