细胞凋亡2014年10月

ATP
Cyt.c Apaf-1活化
CARD
AIF
caspase-independent apoptosis
Caspase-9 Pro-Caspase-3
Apoptosome
Cyt.c Apaf-1活化
+
Pro-caspase-9
Caspase-3
凋 亡
凋亡的执行
Caspase依赖的细胞凋亡 (Cysteine，aspartic acid，protease)
Bcl-2蛋白抑制凋亡的机制：
■ 抑制线粒体PT孔开放，Cyt.c 、AIF释放↓ ■ 结合和灭活Apaf-1，阻断caspase-9活化 ■ 特异性结合细胞色素C ■ 维持细胞钙稳态
促凋亡基因（Bax, Bak, Bid, Bim, Bad)
其蛋白与抗凋亡蛋白相互作用，使抗凋亡蛋白抑 制凋亡的作用丧失，引发线粒体膜崩解
（乳腺癌、肝癌、膀胱癌、肺癌、胶质瘤等也存在Bcl-2高表达）
■ Rb 和p53基因缺失或突变
细胞细胞周期异常、凋亡率↓ 细胞无限制生长
肿瘤发生
■病毒的癌基因
HBV编码的HBX是Caspase-3的强效抑制物，与肝癌发生密 切相关
2．自身免疫病（Autoimmune diseases）
针对自身抗原的 B 或 T 免疫细胞未被及时清除， 机体产生针对自身抗原的体液免疫和细胞免疫， 导致器官组织损伤。
p53促凋亡机制：
-- 与Bcl-2基因相互作用，下调 Bcl-2的表达 -- 诱导凋亡的相关蛋白（Bax等）表达，并触 发细胞色素C释放和caspase活化 -- 诱导死亡受体Fas表达
•
（Diseases associated to apoptosis）
与细胞凋亡异常相关的疾病 凋亡不足 凋亡过度
细胞凋亡及检测技术
病理学教研室 徐 曼
概述 细胞凋亡的调控 细胞凋亡与疾病
细胞凋亡的检测
• 概述
悉尼· 布雷诺尔
罗伯特· 霍维茨
约翰· 苏尔斯顿
2002年诺贝尔生理与医学奖获得者
一、细胞死亡的模式
■ ■
Necrosis = 细胞病理性死亡 Apoptosis = 细胞自发性死亡
apoptosis
2 凋亡的过程及机制
凋亡诱导因素 死亡信号
凋亡的启动 凋亡相关基因激活
Caspases激活、 DNase激活
凋亡的执行
巨噬细胞吞噬分解凋亡细胞
细胞凋亡信号转导的一般特征：


信号转导系统具有多样性
细胞凋亡与细胞增殖、分化过程中的信号转导系统 存在部分共同的通道 细胞内同一信号激活的多条途径存在互通的交叉点
发育异常 气管-食管瘘、房（室）间隙缺
凋亡与疾病
肿瘤
肝癌、恶性血液肿瘤、乳腺癌
、膀胱癌、肺癌、胶质瘤、前
列腺癌等 发育异常 先天性消化道、胆道、肛门狭 CNS
损、唇（腭）裂、短肢畸形、
尿道下裂以及多囊肾等 Alzheimer病、Parkinson 病、
窄或闭锁、动脉导管未闭、两
性畸形、甲状舌骨囊肿等 免疫系统 系统性红斑狼疮、糖尿病、类 风湿性关节炎、桥本甲状腺炎 、多发性的硬化症等 免疫系统
双向调控基因
c-myc、Belx
Bcl-2基因
（B cell lymphoma/leukemia-2）

广泛存在于造血细胞、上皮细胞、淋巴细胞、 神经细胞及多种瘤细胞
Bcl-2家族已发现15个成员，可分为3个亚族： Bcl-2亚家族：抑制细胞凋亡 Bax亚家族：促进细胞凋亡 BH3亚家族：促进细胞凋亡
细胞坏死
强烈刺激 多个细胞 早期即丧失 增大肿胀 稀疏成网状 肿胀破坏 破坏外溢 破裂成碎片 有 随机降解 ATP减少 膜损害、自由基损害
凋亡的生理学意义:
■胚胎发育期去除某些细胞 ■成人组织激素依赖性退化：子宫内膜、乳腺 ■维持内环境稳定
去除潜在有害的自身反应性淋巴细胞
■参与防御反应
细胞毒T细胞
凋亡过多或不足→→疾病：
肿瘤 艾滋病 缺血性损伤（心肌梗死、脑卒中） 病毒感染
二 、凋亡时细胞的主要变化 1. 形态学改变
（The morphologic characteristics of apoptosis）
• • • •
凋亡细胞（实体细胞）与周围细胞脱接触 细胞固缩（Condensation）、核固缩和发芽 胞膜空泡化（Blebbing） 凋亡小体（Apoptotic small body）
㈡ 干预凋亡信号转导
㈢ 调节凋亡相关基因
㈣ 控制凋亡相关酶学机制 ㈤ 防止线粒体跨膜电位的下降
• 细胞凋亡的检测
早期检测
1、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）
2、线粒体膜势能（mt）的检测 3、细胞色素C的定位检测 4、Caspase-3活性的检测 5、细胞内氧化还原状态改变的检测 6、凋亡相关蛋白TFAR19的表达和细胞定位分析
Apoptotic HeLa cells were stained with FITC-AnnexinV + PI
流式细胞术检测：
• 线粒体膜势能（mt）的检测

细胞色素C + Apaf-1 + caspase9前体—凋亡体 召集并激活caspase3→ →细胞凋亡 Apaf-1：凋亡蛋白酶活化因子
线粒体途径
（ mitochondrial pathway）
Ca2+ NO 缺氧 活性氧 应激
Bid
Caspase-8
PT开放
Cyt.c +
Apaf-1
△m↓ 、膜通透性↑
CTL致大量肝细胞凋亡，爆发性肝功能衰竭 ★ HBV、 HCV感染 刺激免疫细胞产生TNF-α
肝细胞凋亡或坏死
细胞凋亡在疾病防治中的意义
㈠ 合理利用凋亡相关因素
1.诱导靶细胞凋亡
抑制Bcl-2抗凋亡作用 增强促凋亡基因作用 增强P53促凋亡作用
放疗来自百度文库化疗
高热、高温
2.减少细胞凋亡 ：
NGF、促生长因子、抗氧化剂

凋亡的起始阶段：
•
•
膜受体（死亡受体）途径
线粒体途径
（1）死亡受体途径
（death receptor pathway）

死亡受体（death receptor, DR） 肿瘤坏死因子受体超家族成员，跨膜蛋 白，与相应配体结合传递细胞信号 Fas(CD95), TNFR1
参与死亡受体信号转导的接头蛋白： 死亡结构域（ death domain, DD）蛋白
肌萎缩性侧索硬化症、色素性
视网膜病，脊肌肉萎缩、早老 性痴呆 免疫缺陷病、AIDS
（一）细胞凋亡不足（Apoptosis inhibition） 1. 肿瘤（Tumor）
■ bcl-2基因过表达,细胞生理性死亡减少
85%滤泡状和20%弥漫性B细胞淋巴瘤
肿瘤发生
染色体 t（14;18）易位
IgH基因与bcl-2基因拼接 bcl-2基因活化 细胞凋亡速率↓ 肿瘤发生
理化因素
抑制性因素（Inhibitors）
射线、高温、强酸、 细胞因子 IL-2、NGF等 强碱、应激、抗癌药 激素 ACTH、睾丸酮、雌激素
激素和因子 糖皮质激素、TNF
免疫性因素 CTL分泌的粒酶 病原体因素 HIV、HCV
其它
Zn2+、苯巴比妥、半胱氨
酸蛋白酶抑制剂、EBV、 牛痘、病毒、中性氨基酸
在凋亡启动阶段发挥作用

凋亡效应亚类Caspase蛋白酶： Caspase3， Caspase6， Caspase7
在凋亡执行阶段发挥作用
Caspase的作用
•
• • • •
水解粘附分子，使细胞与周围组织脱离 活化DNA酶，使DNA片段化 水解DNA多聚酶，抑制核酸合成 降解Rb蛋白，使细胞周期停滞 剪切细胞内结构蛋白
ICAD（抑制性 CAD）
CDA进入细胞核内降解DNA
细胞凋亡

正常情况下， CAD (caspase-activated DNase)与抑制物ICAD-DFF-45结合，存在 于胞质中，无活性
Caspase活化后降解ICAD， CAD激 活并入核降解DNA使其片段化

活化的CAD 在核小体的连接区将DNA切断， 形成约200bp整倍数的核酸片段
Effector caspase
Pro-caspase-3 caspase-9 Caspase-3 Pro-caspase-9 Pro-caspase-6 Pro-caspase-7
Caspase-6
caspase-7
剪切细胞内结构蛋白
Pro-caspase-2
caspase-2
CAD（ caspase活化DNA酶）
■细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻
■大分子合成 TFAR-19 高表达
•细胞凋亡的调控

凋亡相关因素

凋亡的过程及机制
凋亡相关基因

1、影响细胞凋亡的因素
（The mainly induced factors of apoptosis）
Table：Influence factors of apoptosis 诱导性因素（Inducers）
细 胞 凋 亡
(扫描电镜)
(扫描电镜)
(透射电镜)
正常细胞
凋亡细胞—凋亡小体
2. 生化改变 （The biochemical characteristics of apoptosis ）
■DNA片段化
（DNA ladding pattern）
核酸内切酶激活
核小体连接区DNA降解
180～200bp整数倍的DNA片段
Concept of apoptosis:
体内外生理或病理因素触发细胞内死亡 程序→细胞死亡
细胞坏死与细胞凋亡的区别
细胞凋亡与细胞坏死的区别
特征
诱导因素 受累范围 膜完整性 细胞体积 染色质 细胞器 溶酶体 细胞形状 炎症反应 DNA分解机制
细胞凋亡
生理及弱刺激 单个细胞 保持到晚期 减小、固缩 凝聚成半月形 无明显变化 保持完整 形成凋亡小体 凋亡小体被吞噬 核小体间解离 基因活化 （新蛋白质合成） 核酸内切酶激活
Caspase非依赖的细胞凋亡
（Caspase-independent apoptosis）
■凋亡诱导因子（AIF） 线粒体蛋白AIF释放到胞质内与抑制凋亡的因 子结合，从而促发凋亡
■钙超载
钙超载引起凋亡机制
胞浆[Ca2+] ↑
■激活核转录因子，加速凋亡相关基因的转录 ■在ATP参与下暴露出核小体间连接区，有利于核酸内切酶切割DNA ■激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶，降解DNA链 ■激活谷氨酰胺转移酶，使细胞骨架分解→凋亡小体
晚期检测
1、DNA片断化检测 2、TUNEL法 3、细胞凋亡的形态学检测
• 磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）
• Phosphatidylserine(PS) 正常位于细胞膜的内侧，在凋亡早期从细胞膜的内 侧翻转到膜表面
• Annexin-V： Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性 结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、R-PE）标 记后作为探针，利用流式细胞仪、荧光显微镜以及 共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。
细胞凋亡
3、细胞凋亡的调控基因
（Regulated mechanism of apoptosis）
表1
功能 抑制凋亡基因 促凋亡基因
细胞凋亡的调控基因
基因
Bcl-2 Bcl-XL、A1/Bfl-1、Bcl-w、Bcl-G和Mcl-1等 P53、Bax、Bad、Bak、Bid、Bim、Bik、Bok、 Bcl-B、Bcl-Xs、Krk、Mtd、Nip3、Nix、Noxa等

FADD：Fas相关死亡结构域 FasL + Fas +FADD →
→细胞凋亡
FADD的C端与 Fas胞内段结合， N端与caspase8 酶原交联
（2）线粒体途径
线粒体释放细胞色素C→
→细胞凋亡
PT孔开放→线粒体跨膜电位↓，细胞色 素C释放
促凋亡蛋白Bax促PT孔开放 抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl抑制PT孔开放
（二）细胞凋亡过度（Apoptosis excess） 1.心肌缺血与缺血-再灌注损伤 ■特点 ▲缺血早期以凋亡为主，晚期以细胞坏死为主。
▲在梗死灶的中心以坏死为主，梗死灶周边以凋亡为主；
▲轻度缺血以凋亡为主，重度缺血以坏死为主； ■机制 ▲氧化应激 ▲Fas通路
▲p53基因转录增加
2.病毒性肝炎 ★ HCV感染肝细胞 高表达Fas 病毒刺激CTL 高表达FasL

Caspase 的特点： 以酶原的形式存在，激活后水解形成大小 两个亚单位
■
Caspase激活形式
剪切
Pro-caspase： NH2末端结构域 、20KD亚基、 10KD亚基 大小亚基结合（二聚体） caspase激活（四聚体）
Caspase家族的分类

凋亡启动亚类Caspase蛋白酶： Caspase8， Caspase 9，Caspase10