RNA提取及RT-PCR
RT-PCR实验步骤
RT-PCR实验步骤一、总RNA提取1. 取200mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。
2. 震荡30s。
3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。
4. 12000×g，4℃离心，15min。
5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。
6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。
7. 12000×g，4℃离心，10min。
在管底部可见微量RNA沉淀8. 弃上清，加75%乙醇1ml，振荡。
9. 7500×g，4℃离心，10min。
10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5-10min。
11. 沉淀溶于20μlDEPC水，取1μl加入79μlDEPC水测OD260/OD28012. 计算浓度与纯度，-70℃保存。
二、逆转录合成cDNA第一链反应体系如下混匀快速离心一次反应条件如下-20℃ 冰箱冻存三、PCR反应混匀快速离心一次反应条件如下PCR产物-20℃冰箱保存取PCR产物8μl 加5×Loading Buffer 2μl 2%琼脂糖凝胶电泳120V。
100mA 30min 溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果。
RT-PCR实验方法总结1,2RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。
要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。
2. RT按要求做，一般不会出太大问题。
3. PCR，按常规。
但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。
如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。
rt-pcr反应步骤
rt-pcr反应步骤
RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种用于检测RNA的技本。
它可以将RNA转录成DNA，然后进行聚合酶链式反应来扩增特定的DNA片段。
以下是RT-PCR的一般步骤：
1. 样品处理，首先需要从样品中提取RNA。
这包括细胞或组织
的裂解以释放RNA，并使用适当的试剂将RNA纯化出来。
2. 逆转录，提取的RNA经过逆转录反应，使用逆转录酶（如
M-MLV逆转录酶）将RNA转录成相应的cDNA（互补DNA）。
3. PCR准备，为了进行PCR，需要将逆转录产生的cDNA与引物（primer）和DNA聚合酶（如Taq聚合酶）放入PCR反应管中。
引
物是一小段与目标DNA序列互补的DNA片段，它们将指导DNA聚合
酶在特定区域合成新的DNA链。
4. PCR扩增，PCR反应进行数个循环，每个循环包括三个步骤，变性、退火和延伸。
在变性步骤中，反应混合物被加热以使DNA解链。
在退火步骤中，引物与目标DNA结合。
在延伸步骤中，DNA聚
合酶在引物的引导下合成新的DNA链。
这些循环会使目标DNA片段
指数级增加。
5. 结果分析，最后，通过凝胶电泳或其他技术，可以分析PCR 反应产生的DNA片段，确定是否存在感兴趣的基因或RNA。
总的来说，RT-PCR是一个用于检测和定量RNA的强大技术，它结合了逆转录和聚合酶链式反应的步骤，可以在研究和临床诊断中发挥重要作用。
rt-pcr的步骤和注意事项
RT-PCR的步骤和注意事项RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和分析RNA的数量和表达水平。
下面是RT-PCR的基本步骤和一些需要注意的事项。
步骤1.提取RNA：RT-PCR的第一步是从样品中提取RNA。
常见的方法包括酚/氯仿提取法和商用RNA提取试剂盒。
2.逆转录：逆转录是将RNA转录成cDNA的过程。
逆转录反应需要逆转录酶和引物。
在逆转录反应中，RNA被逆转录酶逆转录为单链cDNA。
3.退火：将逆转录产生的单链cDNA进行退火，以得到双链cDNA。
退火的温度和时间应根据引物的特异性进行优化。
4.PCR扩增：将退火得到的双链cDNA作为模板进行PCR扩增。
PCR扩增需要DNA聚合酶和引物。
PCR扩增的温度和时间也应根据引物的特异性进行优化。
5.分析产物：将PCR扩增产物进行凝胶电泳分析或者实时荧光定量PCR分析，以检测和定量RNA的表达水平。
注意事项在进行RT-PCR实验时，有几个注意事项需要遵守：1.RNase污染：RNase是一种可以降解RNA的酶，极易污染实验室环境。
为了避免RNase污染，所有操作前都应使用RNase去除液对实验表面进行彻底清洁，并在操作过程中使用RNase-free的试剂和器具。
2.质控：在RT-PCR实验中应常规进行阴性对照和阳性对照。
阴性对照是用纯水代替RNA模板，而阳性对照是使用已知含有目标RNA的样品。
质控实验的结果应该符合预期，以确保实验的准确性和可靠性。
3.引物设计：引物是RT-PCR实验中非常重要的因素，合适的引物设计可以提高实验的特异性和灵敏度。
引物的选择应避免自身互补性，长度一般为18-24个碱基，GC含量在40-60%之间。
此外，引物的Tm值应相近，以确保PCR扩增的效果。
4.反应体系：RT-PCR反应体系的准备需要精确的计量。
反应的组分通常包括模板RNA，引物，逆转录酶，逆转录缓冲液，核苷酸混合液，PCR缓冲液，DNA聚合酶，dNTPs和MgCl2等。
RNA提取及RT-PCR
（2）随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed
cDNA synthesis) ： 根据许多可能的序列，合成出6-10个核苷酸长的寡 核苷酸短片段（混合物），作为合成第一链cDNA 的引物。 在应用这种混合引物的情况下，cDNA的合 成可以从mRNA模板的许多位点同时发生，而不 仅仅从3’-末端的oligo(dT)引物一处开始。
RNA检测 (1)测定样品在260 nm和280 nm的吸光值 按1OD=40 μ g/ ml RNA计算RNA的产量。 OD260/OD280在1.8-2.0 。 (2)进行琼脂糖凝胶电泳,确定RNA提取的情 况。
RNA降解 1、组织取出后没有马上处理或冷冻
2、样品或提取的RNA保存与-5—-20℃， 没有在
准备工作
RNA酶（Rnase）是导致RNA降解最主要的物质。 此酶非常稳定，在一些极端的条件下只可暂时失活， 但限制因素去除后又迅速恢复活性。常规高温高压灭 菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的Rnase完全失活。 1. 它广泛存在于人的皮肤上，因此制备RNA时必须 戴手套。 2. RNase 的又一污染源是取液器。根据取液器制造 商 的要求对取液器进行处理。一般情况下采用以 DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，可基 本达到要求。 3. 塑料制品、玻璃和金属物品的处理 （1） 塑料制品：尽量使用一次性无菌塑料制品。已标 明RNase-free的塑料制品，如没有开封使用过，通常不 必再处理。
（1） oligo(dT)引导的DNA合成法：利用真核 mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入 12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段， 由反转录酶合成cDNA的第一链。 缺陷：因为逆转录酶无法到达mRNA分子的5’ －末端，必须从3’－末端开始合成cDNA。对 于大分子量的较长的mRNA分子而言，特别麻 烦。
RT-PCR的步骤
RT-PCR的步骤引言逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）是一种常用的分子生物学技术，用于从RNA样本中扩增特定的DNA片段。
该技术可以检测和定量特定基因的表达水平，并在疾病诊断、药物研究等领域发挥重要作用。
本文将介绍RT-PCR的步骤及其基本原理。
步骤1. 提取RNA在进行RT-PCR之前，首先需要从细胞或组织中提取RNA。
常用的RNA提取方法包括酚-氯仿法、硅胶酸盐柱法等。
通过这些方法，可以将总RNA或特定种类的RNA从样本中纯化出来，为后续的实验步骤提供RNA样本。
2. 逆转录（RT）逆转录是将RNA转录为相应的cDNA（互补DNA）的过程。
逆转录反应中使用逆转录酶，该酶具有转录RNA为cDNA的能力。
在逆转录反应中，逆转录酶合成一个与RNA模板互补的cDNA链。
常见的逆转录酶包括M-MLV逆转录酶和SuperScript逆转录酶等。
3. PCR扩增PCR扩增是通过引物（寡核苷酸序列）将需要扩增的目标DNA片段进行反复循环扩增的过程。
在PCR反应中，每轮反应包括三个步骤：解链、引物结合和延伸。
通过不断循环这三个步骤，DNA片段将被指数级扩增。
4. 凝胶电泳PCR扩增后，我们需要将扩增产物进行凝胶电泳，以确认是否扩增成功，并确定目标DNA片段的大小。
在凝胶电泳中，将PCR产物加载到琼脂糖凝胶孔中，并施加电场，1使DNA片段在凝胶中迁移。
通过与已知大小的DNA分子量标准进行比较，可以确定PCR扩增产物的大小。
结论RT-PCR技术已经成为分子生物学领域中不可或缺的工具。
通过逆转录和PCR扩增，可以快速、准确地扩增RNA样本中感兴趣的DNA片段，为疾病诊断和基因表达研究提供了重要的技术支持。
了解RT-PCR的步骤和基本原理，有助于更好地应用该技术进行实验和数据解读。
2。
组织、细胞提取RNA步骤、方法、所需材料及RT-PCR步骤
RT-PCR步骤Rt-PCR实验步骤可参考附件一、实验器具与材料1、移液枪:1ml、200μl、20μl、10μl、2μl2、吸头：1 ml、200μl、20μl3、匀浆管：5ml4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个5、EP管：1.5ml、200μl、100μl6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）、1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇）7、量筒：50ml、250ml、500ml8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml9、试管架：5ml、1.5ml、20μl10、盐水瓶：250ml、500ml各两个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水11、铝制饭盒：4个12、塑料小饭盒：1个13、大瓷缸：2个14、锡箔纸：2卷15、卷纸：2卷16、三角烧瓶：带盖，稍大二、实验器具的处理与准备1、塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管）先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管）2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干）3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC）三、试剂配制1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。
2、75%乙醇：用无水乙醇加DEPC水配，然后放-20℃保存（其中DEPC水需先高压）3、异丙醇：放入棕色瓶中4、氯仿：放入棕色瓶中5、琼脂糖四、几种缓冲液的配制1、电泳缓冲液：Tris 54g硼酸 27.5g0.5M EDTA 20ml？PH：8.0蒸馏水 1000ml5×TBE （贮存液）再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取50ml贮存液+450ml水-→500ml工作缓冲液2、上样缓冲液：0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青FF30%甘油6×缓冲液，4℃保存五、琼脂糖凝胶的配制：1、1.0%：1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液，微波炉中火30秒至沸腾，熔化的琼脂糖冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后现进行电泳。
RT-PCR操作步骤
RT-PCR步骤
一、总RNA提取
1. 取200mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。
2. 震荡30s。
3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。
4. 12000×g，4℃离心，15min。
5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。
6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。
7. 12000×g，4℃离心，10min。
在管底部可见微量RNA沉淀
8. 弃上清，加75%乙醇1ml，振荡。
9. 7500×g，4℃离心，10min。
10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5-10min。
11. 沉淀溶于20μlDEPC水，取1μl加入79μlDEPC水测OD260/OD280
12. 计算浓度与纯度，-70℃保存。
二、逆转录合成cDNA第一链反应体系如下
混匀快速离心一次
反应条件如下
-20℃冰箱冻存
三、PCR反应
混匀快速离心一次
反应条件如下
PCR产物-20℃冰箱保存
取PCR产物8μl加5×Loading Buffer 2μl 2%琼脂糖凝胶电泳120V。
100mA 30min 溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果。
总RNA的提取与RT、Realtime-PCR
总RNA的提取与RT、Realtime-PCR一、实验原理RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。
获得高纯度和完整的RNA是很多分子生物学实验所必需的，如Northern杂交、cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于RNA的质量。
由于细胞内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA。
再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA与其他细胞组分分离，得到纯化的总RNA。
1．RNA提取的最大影响因素-RNA酶但是由于RNA酶（RNase）广泛存在且稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压等。
RNase催化的反应一般不需要辅助因子，因而RNA制剂中只要存在少量的RNase就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，所以RNA的制备过程中要抑制内源和外源的RNase活性，保护RNA分子不被降解。
外源性的RNase存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。
在其它分子生物学实验中使用的RNase也会造成污染。
这些外源性的RNase可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。
而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNase。
2．常用的RNA酶抑制剂*焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNase抑制剂。
它通过和RNase的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。
*异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNase抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNase失活。
它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNase有强烈的变性作用。
*氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNase结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNase的活性。
*RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。
RNasin是RNase的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNase结合，使其失活。
RNA提取-逆转录
RNA提取和RT-PCR1.准备工作：检查提RNA专用的枪头，EP管，以及PBS，Trizol，氯仿，酚氯仿，异丙醇，75%乙醇，DEPC水（0.1%）。
2.从4℃取出Trizol恢复室温，预冷离心机到4℃。
3.用室温的PBS把细胞洗一次，加入1ml Trizol裂解细胞，静置5分钟，反复吹打10次，收集到EP管内，-80℃可储存一个月（解冻时需要离心）。
4.向Trizol裂解液内加入200ul氯仿，上下用力颠倒混匀半分钟，静置3分钟。
5.4℃，12000g离心15分钟，此时可见细胞裂解液分三层：上层为水相的RNA；中层为DNA,脂类等；下层为细胞残渣，蛋白，多糖等。
6.转移上层的水相到新的EP管内，150ul吸三次，共450ul。
7.补充200ul的DEPC水，总体积即为650ul，加入等体积的酚氯仿，混匀，静置3分钟后，4℃离心，12000rcf,15分钟。
8.取上清500ul到新的EP管内，167ul吸三次。
加入等体积的异丙醇，混匀，静置10分钟后，4℃，12000g离心10分钟。
9.小心去掉上清，注意不要丢失RNA沉淀，加入1ml 75%乙醇, 上下颠倒，使沉淀块重悬起，加75%乙醇后4℃可储存一周， -20℃可储存一年。
10.4℃，12000g离心10分钟,小心去掉上清，尽量吸干管壁的液体，注意不要丢失RNA沉淀，若沉淀松动可再次离心。
晾干约15分钟，至管壁无液体。
11.加入适量体积（20-30ul）的DEPC水溶解RNA，58℃水浴10分钟。
12.取出3 ul定量，测量buffer: 10mM TrisCl(pH7.8)，根据定量结果进行逆=40µg/ml,A260/A2801.8~2.1）转录。
（1A26013.逆转录：a.根据定量结果取2μg RNA补充DEPC水至14μl；b.加入1μg oligod(T),70℃5min,取出后立刻冰上孵育5min；c.进行逆转录反应：在上一步反应管中直接加共40μl，42℃反应1h。
定用rt-pcr法获得目的基因的方法
定用rt-pcr法获得目的基因的方法
RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是通过逆转录转录RNA为cDNA，然后使用聚合酶链反应（PCR）放大cDNA的方法，可以用于检测和定量特定的基因表达水平。
下面是使用RT-PCR法获得目的基因的步骤：
1. RNA提取：首先从感兴趣的样品中提取总RNA。
常用的提取方法包括酚/氯仿法、商业RNA提取试剂盒等。
2. 反转录：使用逆转录酶将RNA转录为cDNA。
反转录酶常用的有逆转录酶和随机引物，可以选择单链RNA依据所需。
3. PCR反应设置：准备PCR反应混合物，其中包括目的基因的特异性引物、逆转录生成的cDNA、核酸酶水、缓冲液和聚合酶。
4. PCR扩增：进行PCR扩增反应，其循环条件和程序根据所使用的引物和目的基因的特性而定。
在每个PCR周期内，DNA的数量会指数倍增。
5. 凝胶电泳：将扩增产物进行凝胶电泳分析，以检测目的基因是否存在。
扩增产物大小可以通过分子量标准品来确定。
6. 结果分析：观察凝胶电泳图像，检测目的基因是否存在，根据产物的强度可以初步定量目的基因的表达水平。
需要注意的是，RT-PCR方法能够检测目的基因的转录水平，
但不能直接反映目的基因的蛋白质水平。
若需要获得目的基因的蛋白质表达信息，需要使用其他蛋白质检测方法如Western blotting等。
此外，RT-PCR的结果应该通过其他方法进行验证，例如实时定量PCR（qPCR）或基因组测序方法。
提取RNA,以及RT-PCR的问题整理
Trizol法提取组织总RNA:1、将组织置于匀浆器后，再以50-100mg（一般50mg足矣）组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
2、取出组织匀浆室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。
3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。
4、弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g 离心5分钟。
5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。
然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶10分钟。
RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。
RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。
要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。
2. RT按要求做，一般不会出太大问题。
3. PCR，按常规。
但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。
如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。
如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？问题：在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？请高手指教！解答：1.RT-PCR有两种做法：条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。
RNA提取,RT-PCR实验报告
RNA制备及其鉴定实验目的初步掌握组织总RNA制备的原理及其基本方法，掌握RNA纯度鉴定的基本方法。
实验原理细胞内的RNA通常与蛋白质结合，以核蛋白（RNP）的形式存在。
分离制备RNA时，首先必须破碎细胞，使RNP释放到溶液中并与蛋白质分离，然后将RNA同其他的细胞成分分离开并保证RNA的完整性。
本次实验我们选用了Trizol法分离提取小鼠肝组织的总RNA，Trizol法分离提取的RNA产率高、纯度好且不易降解。
评价RNA质量的标准是RNA的均一性和完整性。
均一的RNA取决于有效的去除RNA提取物中的DNA、蛋白质和其他杂质；完整的RNA取决于最大限度地避免纯化过程中内源性及外源性RNA酶对RNA的降解。
通常采用紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度，纯RNA的A260/A280=2.0，但由于所用的标本不同，此比值有一定的变化，一般在1.8~2.0之间，低于改值表明有蛋白污染，需进一步用酚/氯仿抽提。
RNA的完整性可通过琼脂糖电泳法进行鉴定。
完整的RNA电泳时，28S和18SrRNA经EB染色后，两条电泳条带的显色强度近似为2比1。
本实验中几个重要试剂的作用：Trizol试剂：Trizol的主要成分是苯酚、异硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸钠、β-巯基乙醇、醋酸钠、柠檬酸钠。
它的主要作用是1、裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。
2、使蛋白质变性，有利于DNA和RNA与蛋白质的分离。
3、抑制内源和外源RNase。
氯仿：氯仿的作用有多个方面，一、作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀并通过离心除去。
二、通过变性作用抑制RNase活性；三、通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；四、作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等），起到一定除杂作用。
异丙醇：异丙醇是沉淀核酸用的，作用和乙醇一样。
只不过用量要比乙醇少。
异丙醇是等体积，而乙醇一般需要2.5倍体积。
在水相很多，离心管容积有限，加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇沉淀。
rtpcr操作流程
rtpcr操作流程RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种用于检测RNA的技术，常用于检测病毒、细菌等微生物的存在。
下面将介绍RT-PCR的操作流程。
首先，准备实验所需的试剂和设备，包括RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、PCR试剂盒、热循环仪等。
确保所有试剂和设备都处于干净、无菌状态。
第二步是提取RNA样本。
将待检测的样本（如血液、组织等）加入RNA提取试剂盒中，按照试剂盒说明书的指导进行RNA提取。
提取后的RNA样本应该是纯净的，没有受到污染。
第三步是逆转录反应。
将提取得到的RNA样本加入逆转录试剂盒中，进行逆转录反应，将RNA转录成cDNA。
逆转录反应的条件和时间根据试剂盒的说明进行设置。
第四步是PCR扩增。
将逆转录反应得到的cDNA加入PCR试剂盒中，进行PCR扩增反应。
PCR扩增的条件包括温度、时间和引物浓度等，需要根据试剂盒的说明进行设置。
第五步是检测PCR产物。
将PCR扩增反应得到的产物进行凝胶电泳或实时荧光定量PCR检测，确定目标基因是否存在。
通过比对标准曲线或者与阳性对照样本进行比较，可以确定目标基因的表达水平。
最后，分析结果并进行数据处理。
根据PCR检测结果，可以判断样本中是否存在目标基因，以及其表达水平。
对数据进行统计分析，得出结论并撰写实验报告。
总的来说，RT-PCR操作流程包括RNA提取、逆转录、PCR扩增、检测PCR产物和数据处理等步骤。
正确操作每一步，严格控制实验条件，可以确保实验结果的准确性和可靠性。
RT-PCR技术在医学、生物学等领域有着广泛的应用，对于疾病的诊断和研究具有重要意义。
RTPCR具体步骤
RTPCR具体步骤RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种用于检测和测量特定RNA分子在样本或样本中的表达水平的实验技术。
下面是RT-PCR的具体步骤：1.提取RNA：首先从样本（可以是细胞或组织）中提取RNA。
这可以通过商业RNA提取试剂盒或经典的酚-氯仿提取法来完成。
提取的RNA可能含有DNA杂质，因此可以使用DNA酶I来去除DNA。
2.逆转录反应：将提取的RNA转录成互补的DNA（cDNA）的过程称为逆转录。
逆转录反应的目的是将RNA转录成cDNA，并将其中的信息保存下来，以便后续PCR反应中进行扩增。
逆转录反应通常在逆转录酶（例如M-MLV反转录酶）和随后使用的引物的存在下进行。
需要引物来诱导逆转录酶在RNA模板上合成第一链cDNA。
3.PCR反应：PCR是一种将特定DNA片段扩增到大量可检测水平的技术。
在RT-PCR中，PCR反应用于扩增从RNA转录的cDNA片段。
PCR反应需要一对引物，这对引物应是特异性的，可以选择性地放大感兴趣的RNA分子。
PCR反应通常包含DNA模板，引物，dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）和DNA聚合酶。
PCR反应包括一系列循环，每个循环都包括一定的时间和温度在一定的时间内。
4.聚合酶链反应：在PCR反应中，DNA聚合酶在每一个循环中以DNA末端为模板合成互补的DNA链。
每个循环包括退火，延伸和变性步骤。
在退火步骤中，引物结合到DNA模板上。
在延伸步骤中，DNA聚合酶合成新的DNA链，并以它们作为模板进一步合成更多的DNA链。
在变性步骤中，PCR反应的温度被升高以分离DNA链。
5.检测与分析：PCR反应产生的扩增产物可以通过凝胶电泳或其他检测方法进行分析。
凝胶电泳可以分离不同大小的DNA片段，并且扩增产物的相对量可以通过定量PCR（qPCR）进行测量。
qPCR使用荧光信号来检测PCR产物的积累，并通过与标准曲线相比较来确定特定的RNA分子在样本中的表达水平。
6.数据分析：通过分析PCR产物的相对量，可以根据比较样品之间的扩增产物浓度来确定特定RNA分子在样本中的表达水平。
RNA提取和RT
RNA提取和RT-PCR在做Northern等杂交实验、构建cDNA文库、获取能够编码真核生物蛋白的基因、取得RNA病毒基因时，会用到RNA提取和RT-PCR技术。
真核生物的基因组是DNA，为何不直接从DNA PCR取得咱们需要的基因呢？因为真核生物的基因含有大量的非编码区，称为内元（intron），真正编码蛋白的区段是被这些内元隔开的，这些编码区叫做外元（exon）。
真核生物的DNA转录成为RNA以后，通过剪切和拼接，去掉这些非编码区，才形成成熟的mRNA，由mRNA再翻译成蛋白质。
因此，假设是直接从真核生物的基因组DNA获取目的基因，克隆再表达，试图获取目的蛋白的思路是行不通的，因为获取的DNA里面会含有非编码区。
要表达真核生物的基因并表达出相应的蛋白，只能通过提取其mRNA并RT-PCR这条颇费周折的途径。
1．RNA的提取RNA的提取其实原理很简单：通过变性剂破碎细胞或组织，然后通过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再通过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。
可是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，因此实验中有很多地址需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。
1．1 分离高质量RNA成功的cDNA合成来自高质量的RNA。
高质量的RNA至少应保证全长而且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。
RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。
一样的RNA纯化方式是利用异硫氰酸胍／酸性酚的一步法。
一样没必要利用oligo(dT)选择性分离poly(A)+RNA。
不管起始模板是总RNA仍是poly(A)+ RNA，都能够检测到扩增结果。
另外，分离poly(A)+RNA会致使样品间mRNA丰度的波动转变，从而使信息的检出和定量产生误差。
可是，当分析稀有mRNA时，poly(A)+RNA会增加检测的灵敏度。
1．2 RNA提取的最大阻碍因素-RNA酶在所有RNA实验中，最关键的因素是分离取得全长的RNA。
而实验失败的要紧缘故是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。
RNA提取及RT-PCR
样本前处理—离散，均一，细胞集或细胞系
样品的前处理方式
液氮研磨 匀浆或液氮研磨 应用红细胞裂解液处理 蛋白酶K处理
样品处理Q&A
Q-1：样品量是否越多越好？ A-1：不是。在试剂盒规定内增加，若过度增加样品处理量会影响 最大量 预期得率 RNA得率；如增加样品起始量，则后续实验中各溶液量均要相 应按比例增加。 得 率 实际得率 RNA
DNA残留
M 1 2
蛋白残留
M 1 2
RNA相关知识及提取方法原理 RNA提取流程 RNA的评价与鉴定 RNA的保护
RNA的不稳定性
内因：核糖残基的2’和3’位置带有羟基，易被水解
外因：内源、外源RNA酶含量丰富，加热后仍能
够正确折叠恢复活性，不易失活
常用的RNA酶抑制剂
焦碳酸二乙酯（DEPC） 异硫氰酸胍
样品前处理、细胞裂解
TRNzol试剂法 RNAprep试剂盒法
取上清
加入吸附柱
操 作 流 程
沉淀
加缓冲液
洗涤 溶解RNA沉淀
漂洗
获得RNA产物
RNA洗脱收集
应用TRNzol-A+提取动物细胞RNA
细胞
氯仿 水相
细胞选择
纯化 RNA 基因组DNA
离心
贴壁细胞 悬浮细胞
加入裂解液 (TRNzol-A+)
中丰度
0.05-2μg
RNase
rRNA
tRNA
中丰度
低丰度
AAAAAA mRNA
细胞裂解原理
异硫氰酸胍/苯酚法
细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解， 使核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放
胍盐/β-巯基乙醇法
细胞RNA的提取及鉴定、RT-PCR检测p53基因的表达
实验报告实验题目：细胞RNA的提取及鉴定、RT-PCR检测p53基因的表达报告人：张铨合殷悦涵实验日期：2021.4.26一、实验原理1. 细胞RNA的提取及鉴定细胞内RNA通常与蛋白质结合，以核蛋白〔RNP〕的形式存在。
别离、制备RNA时首先须破碎细胞，使RNP释放到溶液中并与蛋白质别离，然后将RNA同其他的细胞成分别离开并保证RNA的完整性。
Trizol法别离提取的RNA产率高、纯度好且不易降解，它是一种总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。
由于RNase能迅速降解RNA，所以需创造一个无RNase的环境，在各个环节防止它的污染。
评价RNA质量的标准是RNA的均一性和完整性，采用紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度，纯RNA的A260/280=2.0，实验室条件下一般在1.7-2.0之间，低于该值说明有蛋白污染，需要进一步抽提。
2. RT-PCR检测p53基因的表达PCR是一种体外大量扩增特异DNA片段的分子生物学技术，利用序列作为引物，将两引物之间的特定DNA片段进行复制，经过屡次循环是模板上特定DNA 拷贝数呈指数级增长。
根本过程为变性、退火、延伸三个步骤循环往复进行，每一轮过后特定的DNA片段的分子数增加一倍。
RT-PCR将mRNA反转录合成cDNA后再经PCR进行大量扩增，实质上是对mRNA 的扩增，常利用此技术克隆cDNA或分析某一特异基因在组织细胞中的表达情况。
本实验先以Oligo引物来反转录合成细胞cDNA模板，然后采用p53特异性引物进行PCR扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳分析p53在两种肺癌细胞〔A549和H1299〕中的表达水平。
二、实验材料及设备材料：肺癌细胞A549〔野生型〕和H1299〔p53缺失型〕、p53引物、GAPDH 引物试剂：Trizol试剂、氯仿、异丙醇、无RNase水、乙醇、、Promega RT-PCR 试剂盒、2*TaqPCR mix 、DNA染料：GoldView、5*TBE、6*上样缓冲液、DNA分子量标准、琼脂糖耗材：Ep管、吸头、一次性手套、口罩设备：5415R型冷冻离心机、NanoDrop2000超微量分光光度计、高压消毒锅、恒温枯燥箱、制冰机、可调式取液器、PCR仪、电泳仪、电泳槽、紫外检测器、凝胶成像系统、冰箱三、实验步骤1. 细胞RNA的提取及鉴定〔一〕RNA提取取1*106个细胞与1.5mlEp管→加0.2ml氯仿摇匀→4℃，12000rpm离心15min分层→取上层水相入新的Ep管中参加等体积异丙醇，摇匀，室温静置10min →4℃，12000rpm离心10min，RNA沉淀→弃上清，加1ml75%乙醇洗涤沉淀→4℃，12000rpm离心5min→弃上清，晾干，用30μl无RNase水溶解沉淀〔二〕RNA浓度和纯度测定取2ulRNA溶液，用NanoDrop2000超微量分光光度计测定260nm和280nm 波长的OD值，并记录Abs260/Abs280比值及RNA浓度2. RT-PCR检测p53基因的表达〔一〕反转录合成cDNA1.RNA预变性：取一支0.2mlPCR管参加样品RNA2μg，以无水RNase水补足体积至9μl，70℃，10min，立即置于冰上。
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RNasin
氧钒核糖核苷复合物
SDS、尿素、硅藻土等
提取前的保护
材料样品中的RNA保护 RNA提取工作区RNase的清除 RNAstore
实验耗材/器皿的RNase清除
塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡4-10小时，再灭菌 玻璃器皿可在150℃烘烤4小时
塑料制品和枪头避免交叉污染
大鼠组织 脑 心脏 肾脏 肝脏 脾脏 肺
样品量 10 mg 10 mg
总RNA量（µg） ~8 ~ 10 ~ 35 ~ 40 ~ 35 ~ 10
OD260 / OD280 1.9-2.1 1.9-2.1
10 mg
10 mg 10 mg 10 mg
1.9-2.1
1.9-2.1 1.9-2.1 1.9-2.1
۞ 试验材料： Hela cell/106 ۞ 实验方法： TIANGEN公司 TRNzol-A+ A公司同类产品 ۞ 试验结果：
T
M
1 2 3 4
A
5 6
得率：TRNzol-A+得率与A公司同 类产品略高
纯度： 无明显DNA、蛋白残留 经TRNzol-A+纯度较高，
图片说明： M: TIANGEN Marker III A: A公司同类产品提取动物细胞结果 T: TIANGEN公司TRNzol-A＋提取动物细胞结果
有机相
pH5.7
PLG－手提RNA的有力帮手
Phase Lock Gel
相锁定凝胶
TRNzol-A＋试剂法提取
传统方法：有机溶剂抽提，得率高
等体积异丙醇沉淀 水相 75％乙醇洗涤沉淀 晾干溶解
RNA
柱纯化法：纯度高
RNA吸附柱 去蛋白液 漂洗 洗脱
RNAsimple kit
Application
两步法 引物 Oligo dT，随机引物，GSP 一步法 Oligo dT, GSP
高灵敏度 优点 依实验要求选择不同DNA聚 减少污染 合酶 适用 单个样品中检测几个mRNA 大量样品分析
RT反应体系
模板：总RNA，mRNA，体外转录的RNA
提取过程中的RNA保护
组织破碎 细胞裂解 实验人员
适当的破碎方法
适量的裂解液
正确的操作和防护措施
提取后及后续实验中的RNA保护
RNA保存过程——RNAsafe
RT-PCR实验——RNasin
TIANGEN公司 RNA提取试剂/盒
硅胶膜吸附法 磁珠法 沉淀法
DP419
DP315
RNAsimple 总RNA
彻底破碎 多次氯仿抽提
减少处理量，多次氯仿抽提
多次氯仿抽提，特殊试剂
RNA相关知识及提取方法原理 RNA提取流程 RNA的评价与鉴定 RNA的保护
RNA的评价与鉴定
电泳检测
1％琼脂糖，6V/cm，15min，上样1～3 ul
纯度（ OD260 /OD280 ）： 紫外分光光度计进行测量（选择正确的稀释倍数，确保OD260 值在0.1~1.0之间， 通常离心柱法稀释10倍左右；溶液裂解法稀释40－50倍） OD260 /OD280 < 1.9 ～2.1说明有大分子污染 OD260 /OD280 ＝ 1.9 ～2.1说明纯度很好 OD260 /OD280 > 1.9 ～2.1说明有部分降解 得率 紫外分光光度计进行测量； Yield＝ OD260×稀释倍数×40ng/ul
洗脱
用经DEPC处理过的水或专门的试剂来
洗脱或溶解RNA
Application－RNA提取比较
۞ 试验材料：大鼠肝脏/10mg 实验方法： TIANGEN公司 RNAprep Kit A公司某柱式RNA提取试剂盒 ۞ 试验结果： 得率：RNAprep得率比A公司产品
高15％左右
M
TIANGEN
中丰度
0.05-2μg
RNase
rRNA
tRNA
中丰度
低丰度
AAAAAA mRNA
细胞裂解原理
异硫氰酸胍/苯酚法
细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解， 使核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放
胍盐/β-巯基乙醇法
盐酸胍裂解样本，抑制RNase的活性
β -巯基乙醇变性蛋白
RNA分离原理
洗脱
用经DEPC处理过的水或专门的试剂来
洗脱或溶解RNA
应用RNAprep提取动物组织
胍盐、β-巯基乙醇
裂解
裂解细胞灭活RNase RNA在高盐低pH值条件下与硅胶膜结合
结合
RW1除去蛋白残留
在去除蛋白过程中利用DNase Ⅰ除去基
因组DNA
漂洗
RW除去盐离子 RNA在低盐高pH条件下被洗脱
RNA纯化 试剂盒
―从RNA提取到荧光定量PCR‖解决方案
―RT－PCR系统
TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD
RT－PCR
RT-PCR原理简介 RT-PCR技术中的关键点
RT-PCR原理简介
RT
RNA CDNA
PCR
目的 片段
两步法与一步法RT-PCR比较
提取 试剂盒
TIANamp 病毒 DNA/RNA 提取试剂盒
RNAprep pure 系列试剂 盒
DP438
DP405 TRNzol 总RNA提 取试剂
DP421 TRNzol-A＋ 总RNA提取 试剂
DP437 RNAplant plus 植物总 RNA提取试 剂
磁珠法病毒 DNA/RNA
提取试剂盒
处理样品量
样品处理Q&A
Q-2：如何保证研磨过程和匀浆中RNA不被降解？ A-2：研磨过程要迅速，同时尽量避免外源RNA酶污染；匀浆
过程中一定要保证组织和裂解液充分接触，尽量在匀浆
前将组织低温切割成小块加入裂解液中，可确保RNA不 被降解。
RNA质量要求
完整性
不能含有酶抑制剂 不能含有金属离子和有机溶剂 不能含有蛋白质，多糖，酯类 不能有DNA分子污染
应用TRNzol-A+系列注意事项 前处理
RNA降解 处理样品量 上清吸取，杂质去除 适量异丙醇 乙醇，盐离子残留
裂解 抽提
沉淀 洗涤
溶解
RNA不宜太干
样品前处理、细胞裂解
TRNzol试剂法 RNAprep试剂盒法
纯化
加入吸附柱
操 作 流 程
沉淀
加缓冲液
洗涤 溶解RNA沉淀
漂洗
获得RNA产物
RNA洗脱收集
沉淀法
介质吸附
吸附材料 阴离子交换树脂 硅基质 磁珠 纯化原理 低盐高pH值结合核酸 高盐低pH值洗脱 高盐低pH值结合核酸 低盐高pH值洗脱 磁性微粒挂上不同基团可 吸附并携带RNA
RNA相关知识及提取方法原理 RNA提取流程 RNA的评价与鉴定 RNA的保护
样品前处理——实验材料的选择
SD101 病毒检测 用RNA提 取试剂盒
TIANGEN公司 RNA相关试剂/盒
RNA样本保存试剂
RNA保护试剂
RNA纯化试剂盒
DP408
RNAstore 组织样本 保存液
DP409 RNAsafe （用于保存 RNA）
DP418 RNasin （用于RT等 下游实验）
DP412 RNAclean
RNA提取方法比较
方法 提取材料 毒性 操作时间 RNA质量
TRNzol系列
血液/细胞/动物组织
＋＋
2h
＋
RNAsimple
血液/细胞/动物组织 血液/细胞/动物组织 /植物/微量样本
＋＋
2h
＋＋
RNAprep系列
＋
30-40 min
＋＋
一些特殊组织的RNA提取
纤维组织
蛋白/脂肪含量高组织 核酸/RNase含量高组织 植物组织/真菌组织
漂洗
洗脱
得率控制
RNA提取得率比较
材料
人类全血 处理量 250ul
总RNA产量
0.5–1 ug
OD260 / OD280 1.9 - 2.1
材料 人白细胞 成纤维细胞
处理量 7×107 cells 1×106 cells
RNA得率 15-20 ug 5-7 ug
上皮细胞
1×106 cells
8-15 ug
RNA提取及RT-PCR技术
TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD
RNA提取
RNA相关知识及提取原理 RNA提取流程 RNA的评价与鉴定 RNA的保护
细胞中RNA的种类和含量
不同丰度 高丰度 组织名称 肝脏 脾脏 心脏 大脑 胚胎 肾脏 肺 膀胱 低丰度 骨 脂肪 高丰度 成纤细胞 人白细胞 酵母 拟南芥叶片 烟草叶片 玉米叶片 样品量 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 105 105 105 1mg 1mg 1mg 0.5-1μg 0.5-1.5μg 0.2-0.5μg 0.05-0.1μg 0-0.05μg 2-4μg AAAAAA 总RNA含量
洗脱
用经DEPC处理过的水或专门的试剂来
洗脱或溶解RNA
应用RNAprep提取动物组织
胍盐、β-巯基乙醇
裂解
裂解细胞灭活RNase RNA在高盐低pH值条件下与硅胶膜结合
结合
RW1除去蛋白残留
在去除蛋白过程中利用DNase Ⅰ除去基
因组DNA
漂洗
RW除去盐离子 RNA在低盐高pH条件下被洗脱
样品前处理、细胞裂解
TRNzol试剂法 RNAprep试剂盒法