1.1DNA重组技术的基本工具(动画很经典)
1.1DNA重组技术的基本工具
1、下列黏性末端属于同种内切酶切割而成的 是 A ① T C G ② A A T T C
A G C T T A A
A G G T T C C A G
③
④
A G C T T C A G
A、①②
B、①③ C、①④ D、②③
2、下列哪一种酶是基因工程的工具酶 A、DNA连接酶 C、RNA酶 B、DNA酶 D、运载体
需要
是否需要模版
不需要
限制酶：磷酸二酯键
解旋酶：氢键
限制酶切割后有两种不同的结果，一种产 生黏性末端，一种产生平末端。那么恢复它们的 连接时，所用DNA连接酶是否可以不加选择？
E.coliDNA连接酶：连接黏性末端 T4DNA连接酶：连接黏性末端和平末端
3、基因的运输工具——运载体
作为载体没有切割位点将怎样？ 假如目的基因导入受体细胞后不能复制将 怎样？ 目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？ 如果载体对受体细胞有害将怎样？
理：基因重组
操作水平：DNA分子水平 结 果：定向地改造生物的遗传性状， 获得人类所需要的品种。
思考
在自然界中有一些生物的DNA可能进入另一 种生物的细胞中。我们有没有学过相关的实 例？ 现今存在的生物为什么没有在长期的进化过 程中被外源DNA的入侵而灭绝，仍能保持一 种稳定状态？ 怎样才能使外来的DNA失效从而保护自身？
限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗？以下是四种不 同限制酶切割形成的DNA片段：
(1) …CTGCA
…G （4） …G …CTTAA (7) GT…
(2) …AC
(3) GC…
…TG CG… (5) G… (6) …GC ACGTC… …CG
1.1 DNA重组技术的基本工具(个人原创精品2015年)
基因工程培育抗虫棉的简要过程：
苏云金芽孢杆菌 提取 抗虫基因 与运载体DNA拼接 普通棉花(无抗虫特性) 棉花细胞(含抗虫基因) 棉花植株(有抗虫特性)
导入
• 上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？
二、基因工程的基本工具
1. 限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
1、来源： 原核生物 2、作用部位： 磷酸二酯键 3、特点： 特异性--能够特异性识别DNA分子中特 定的核苷酸排列顺序，并能切开特定部 位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键 P
P G A
磷酸二酯键 即脱氧核糖、磷酸之间的连接
限制性核酸内切酶作用的化学键
G A A T T C G C T T A A G C
P P
G A
磷酸二酯键
即脱氧核糖、磷酸之间 的连接
二、基因工程的基本工具
1. 限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
1、来源： 原核生物 2、作用部位： 磷酸二酯键 3、特点： 特异性--能够特异性识别DNA分子中特 定的核苷酸排列顺序，并能切开特定部 位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键
质粒、 λ 噬菌体衍生物 、动植物病毒
Thank You!
4、末端种类： 黏性末端和平末端 5、常见的限制酶： EcoRI和SmaI
ECORⅠ限制酶的作用
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ECORⅠ限制酶的作用
CTTCATG AATTCCGTAG AATTCCCTAA GAAGTACTTAA GGCATCTTAA GGGATT
CTTCATG GAAGTACTTAA
AATTCCCTAA GGGATT
②载体DNA必须有一个或多个限制酶切点。
③具有某些标记基因，便于进行筛选,如抗菌素的抗 性基因等。 ④质粒的存在对宿主细胞无影响。
课件6：1.1 DNA重组技术的基本工具
1.1 DNA重组技术的基本工具（工欲善其事，必先利其器）
1、限制性核酸内切酶（限制酶）—“分子手术刀” （1）来源:主要从原核生物中分离出来。
1.1 DNA重组技术的基本工具（工欲善其事，必先利其器）
1、限制性核酸内切酶（限制酶）—“分子手术刀” （2）作用
识别双链DNA分子 的某种特定核苷酸 序列，并且使每一 条链中特定部位的 两个核苷酸之间的 磷酸二酯键断开。
六核苷酸，平端切口
1.1 DNA重组技术的基本工具（工欲善其事，必先利其器）
1、限制性核酸内切酶（限制酶）—“分子手术刀” （4）结果
1.1 DNA重组技术的基本工具（工欲善其事，必先利其器）
2、DNA连接酶—“分子缝合针”
与DNA有关的四种酶
酶的种类
作用底物
限制酶
DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA解旋酶
Alu I
‥ ‥A G C T ‥‥ ‥ ‥T C G A ‥ ‥
Bam H I
‥ ‥G G A T C C ‥‥ ‥ ‥C C T A G G ‥‥
四核苷酸，平端切口 六核苷酸，粘端切口
Bgl I Eco R I
‥ ‥A G A T C T ‥‥ ‥ ‥T C T A G A ‥‥
‥ ‥G A A T T C ‥‥ ‥ ‥C T T A A G ‥‥
形成单链DNA
1.1 DNA重组技术的基本工具（工欲善其事，必先利其器）
3、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
（1）载体的作用 （2）载体需要具备的 条件 （3）常见的载体
重组质粒
1.1 DNA重组技术的基本工具（工欲善其事，必先利其器）
3、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
（1）载体的作用
DNA重组技术的基本工具
DNA重组技术的基本工具DNA重组技术是一种重要的分子生物学技术，用于改变基因组中的DNA序列，使之具有特定的功能。
这项技术的应用范围广泛，可以在基础研究、医学诊断、药物开发等领域发挥重要作用。
DNA重组技术的基本工具包括DNA片段的制备、限制性内切酶、DNA连接酶、质粒和载体等。
首先，DNA片段的制备是DNA重组技术的第一步。
通过PCR（聚合酶链反应）或限制性内切酶切割，可以从某个DNA源中获取特定的DNA片段。
PCR是一种体外扩增技术，可以将特定的DNA序列进行快速放大。
限制性内切酶是一类特殊的酶，可以识别特定的DNA序列并在该序列上切割DNA链。
通过PCR和限制性内切酶的组合应用，可以制备出需要的DNA片段。
其次，限制性内切酶是DNA重组技术中的重要工具之一。
限制性内切酶可以特异性地切割DNA链，并产生一定的粘性或平滑的DNA末端。
这些末端的特性决定了DNA片段连接的方式。
常用的限制性内切酶有EcoRI、BamHI、HindIII等。
当两个DNA片段具有相同的限制性内切酶切割位点时，它们可以通过限制性内切酶的连接来形成一个新的DNA分子。
接下来，DNA连接酶也是DNA重组技术中必不可少的工具之一。
DNA连接酶能够将两个DNA片段在适当的条件下连接在一起。
常用的DNA连接酶有T4 DNA连接酶和DNA聚合酶。
通过合适的实验条件和适当的连接酶，可以使两个DNA片段有效地连接成为一个整体。
此外，质粒和载体也是DNA重组技术中的重要工具。
质粒是一种小环状DNA分子，在细菌细胞中存在，并能自我复制。
载体则是质粒或其他DNA分子，用于携带所需的DNA片段。
通过将需要插入的DNA片段连接到载体上的限制性内切酶切割位点上，并将该载体转化至宿主细胞中，就可以实现外源DNA的导入。
在实际应用中，DNA重组技术的基本工具往往是共同配合使用的。
通过PCR或限制性内切酶的组合，可以制备出所需的DNA片段；通过限制性内切酶的连接和DNA连接酶的应用，可以将不同的DNA片段连接起来形成一个新的DNA分子；通过质粒和载体的应用，可以将需要插入的DNA片段导入到宿主细胞中实现转化。
1.1DNA重组技术的基本工具
3、基因进入受体细胞的运载体
天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体 吗？为什么？ 作为运载体的条件： （1）必需有一个或多个限制酶的切割位点 ，以便目的基因可以插入到运载体上去，而 且这些位点所处的位置，还必须是在质粒本 身需要的基因片段之外，这样才不至于因目 的基因的插入而失活。 （2）必需具备自我复制的能力，或整合到 受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步 复制。
C
A
A T T C
T
T A A G
DNA重组技术的基本工具
“分子手术刀”——限制性核酸内切酶
黏性末端 黏性末端
DNA重组技术的基本工具
限制性核酸内切酶
1.特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，在特定 的切点切割。 2.结果：产生黏性末端（碱基互补配对）、平末端。 3.举例：大肠杆菌的一种限制酶（EcoRⅠ)能识别 GAATTC序列，并在G和A之间切开形成黏性末端， SmaⅠ能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切割形成平 末端 。 4.分布：主要在微生物中,特别在原核生物中迄今 从不同的微生物中分离出了约4000种限制酶。
DNA重组技术的基本工具
• 要想获得某个特定性状的基因必须要用限制 酶切几个切口？可产生几个黏性末端？ 要切两个切口，产生四个黏性末端。 • 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶 来切割，会怎样呢？ 会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性 末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA 分子了。
1、限制性核酸内切酶——“分子手术刀 ”
为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的 DNA？ 因为微生物在长期的进化过程中形 成了一套完善的防御机制，对于外源入 侵的DNA可以降解；含有某种限制酶的细 胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶 的识别切割序列，或者通过甲基化酶将 甲基转移到所识别序列的碱基上，使限 制酶不能将其切开。
高中生物人教版选修三同步导学：1.1 DNA重组技术的基本工具(理解+掌握+应用)
1．1DNA重组技术的基本工具1．基因工程突破了生殖隔离，实现了不同种生物间的基因重组。
2．不同生物基因能拼接在一起的理论基础是DNA分子都是由4种脱氧核苷酸构成的规则的双螺旋结构。
3．外源DNA导入受体细胞表达的理论基础是密码子的通用性。
4．限制性核酸内切酶的作用特点是识别双链DNA分子特定的核苷酸序列，并在特定位点上切割。
5．限制酶和DNA连接酶的作用部位都是两个核苷酸间的磷酸二酯键。
6．在基因工程中使用的载体除质粒外，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
基因工程的概念及其诞生与发展[自读教材·夯基础]1．基因工程的概念2．基因工程的诞生和发展(1)基础理论的重大突破：①DNA是遗传物质的证明；②DNA双螺旋结构和中心法则的确立；③遗传密码的破译。
(2)技术发明使基因工程的实施成为可能：①基因转移载体和工具酶相继发现；②DNA合成和测序技术的发明；③DNA体外重组得到实现及重组DNA表达实验获得成功。
(3)基因工程的发展与完善：1983年，世界第一例转基因烟草培养成功，基因工程进入迅速发展阶段。
1988年PCR 技术的发明，使基因工程进一步发展和完善。
1．通过分析基因工程的概念，讨论基因工程的原理是什么。
提示：基因重组。
2．将人的胰岛素基因导入大肠杆菌体内，通过大肠杆菌能大量生产人胰岛素。
请分析人胰岛素基因能在大肠杆菌体内表达的理论基础是什么。
提示：生物共用一套遗传密码。
[跟随名师·解疑难]1．对基因工程概念的理解操作环境操作对象操作水平基本过程结果生物体外基因DNA分子水平剪切→连接→导入→表达定向地改造生物的遗传性状2．基因工程的原理和理论基础(1)原理：基因重组。
(2)理论基础：①拼接：不同生物DNA的基本组成单位相同，都是4种脱氧核苷酸；空间结构相同，都是规则的双螺旋结构。
②表达：生物界共用一套遗传密码，相同的遗传信息在不同生物体内表达出相同的蛋白质。
基因工程操作的基本工具1．限制性核酸内切酶(1)来源：主要从原核生物中分离出来。
1.1DNA重组技术的基本工具
酸连接成链（形成磷酸二脂键）
真核 细胞 原核 细胞
A
G
C
T
T
G
C
A
解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？
片段 ，要把相关的目的 基因是具有遗传效应的DNA______ 基因提取出来，首先需要什么工具？
关键步骤一的工具： 基因的剪刀——限制酶
一、 “分子手术刀” —— 限制性核酸内切酶（限制酶） 主要是从原核生物中分离纯化出来的一种 1.来源 酶。能将外来的DNA切断，由于这种切割 和种类：
据此分析,这两种限制性内切酶在该 DNA 分子上的限制酶切位 点数目分别是： Hind Ⅲ _____个， BamHⅠ_____个。
问题：为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？你能推 测这类酶存在于原核生物中的作用是什么吗？
这些细菌的DNA分子中
要么不具备这种限制酶的识别切割序列，
或者通过生化反应将所识别序列的碱基结构改变，使限制酶 不能将其切开。
例：在DNA测序工作中,需要将某些限制性内切酶的 限制酶切位点在DNA上定位,使其在成为 DNA 分子 中的物理参照点。这项工作叫做“限制酶图谱的构 建”。 假设有以下一项实验:用限制酶 Hind Ⅲ 、 BamHⅠ和二者的混合物分别降解一个4kb (1kb即 1千个碱基对)大小的线性 DNA 分子,降解产物分别 进行凝胶电泳,在电场的作用下,降解产 物分开,如下 图所示:
实例1
培育转基因大肠杆菌的简要过程：
人体组织细胞
（能分泌胰岛素）
提取
普通大肠杆菌
(不能分泌胰岛素) 大肠杆菌
(含胰岛素基因)
胰岛素基因
与运载体DNA拼接 导入
转基因大肠杆菌
(能分泌胰岛素)
1.1 DNA重组技术的基本工具0
切割位点：磷酸二酯键
举 例：EcoRI限制酶能识别 GAATTC序列，并在G和A 之间切开 结果：形成两种末端
限制性内切酶
限制 酶
黏性末端和平末端
限制酶在原核生物中有什么作用？
• 限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA 侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保而达到保护自 身的目的。 • 限制酶不会将自己的DNA 切割吗？ • 含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具 备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化 酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶 不能将其切开。
1.1 DNA重组技术的基本工具
高二生物组
DNA重组技术的基本工具
• 限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
• DNA连接酶——“分子缝合针”
• 基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
分布：主要在原核生物中 作用特点：特异性，即识别特定核 苷酸序列，切割特定的两个 核苷酸之间的磷酸二酯键。
• DNA连接酶与DNA聚合酶一样吗？为什么？
议一议
1、从化学组成来看，载体应含有什么成分？ 双链DNA 2、能否用SARS病毒作为基因载体？ 不能 3、作为载体，若没有切割位点将怎样？ 不能进行DNA的重组 4、携带目的基因的载体是否进入了受体细胞， 如何鉴定？ 载体上应有标记基因 5、假如目的基因导入受体细胞后不能复制， 将怎样？ 可能造成基因丢失
DNA连接酶——“分子缝合针”
• 种类：两种：
一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为E·coli连接酶。 一种是从T4噬菌体中分离得到，称为T4连接酶。
• 特点：
E·coli连接酶只能连接黏性末端；
T4连接酶既可“缝合”黏性末端，又可“缝合”平末端。
1.1DNA重组技术的基本工具 (2)
专题1 基因工程1.1 DNA重组技术的基本工具一、学习目标1.说出基因工程的概念。
2.认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。
3.说出DNA重组技术所需三种基本工具的作用。
二、学习重点和难点1.学习重点：DNA重组技术所需的三种基本工具的作用。
2.学习难点：基因工程载体需要具备的条件。
三、学习过程考点一：基因工程的诞生1.实例引入，结合章首文字思考什么是基因工程？并填写下列表格：2.基因工程是在哪些学科的基础上发展起来的？3.哪些基础理论知识和相关科学技术的发展催生了基因工程？（1）基础理论：（2）科学技术：【即时训练】下列何种技术能有效地打破物种的界限,定向地改造生物的遗传性状,培育新的农作物优良品种 ( ) A．基因工程技术 B．诱变育种技术 C．杂交育种技术 D．组织培养技术考点二：DNA重组技术的基本工具※限制性核酸内切酶——“分子手术刀”阅读教材P4—5相关内容，思考并讨论：4.DNA重组技术的基本工具有哪些？工具酶是什么？5.限制性核酸内切酶（限制酶）从哪里获得？有什么作用？有何特性？切割后会产生哪些结果？（1）来源：主要从中分离纯化出来的。
（2）特点：具有。
即能识别DNA分子的某种核苷酸序列，使中部位的两个之间的磷酸二酯键断开。
（3）作用位点：（4）作用结果：或【即时训练】下列四条DNA分子，彼此间具有粘性末端的一组是（）A．①②B．②③C．③④D．②④※DNA连接酶——“分子缝合针”阅读教材P5—6相关内容，思考并讨论：6. DNA连接酶的作用对象是什么？作用位点是什么？作用结果是什么（1）作用对象：（2）作用位点：（3）作用结果：将存在的两个DNA片段连接成7.两种DNA连接酶的来源和作用有何不同？（1）E.coliDNA连接酶——只能连接（2）（既能连接黏性末端又能连接）※基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”阅读教材P6相关内容，思考并讨论：8.基因工程中使用的载体有哪些？最常用的是哪一种？（1）载体种类：、、等（2）最常用的载体：9.质粒的化学本质是它存在于哪些生物体内？10.作为运载目的基因的载体必须要具备哪些条件？a.能在宿主细胞内并。
DNA重组技术的基本工具(动画很经典) - 副本
细菌
供体细胞
取出DNA
取出质粒 用限制酶切断DNA
将重组DNA导 入受体细胞
用连接酶连 接目的基因
扩 增
自主学习
阅读课本4-5页“限制性核酸内切酶——分子 手术刀”的相关内容，填写下表
来源 种类 作用
主要从原核生物中分离纯化而来 已经分离出大约4000种 1、识别双链DNA分子的某种特定核 苷酸序列 2、使每一条链中特定部位的两个核 苷酸之间的磷酸二酯键断开。
• 基因工程培育抗虫棉的简要过程：
苏云金芽孢杆菌
提取
普通棉花(无抗虫特性)
与运载体DNA拼接，导入
抗虫基因
棉花细胞(含抗虫基因)
表达
棉花植株(有抗虫特性)
• 培育抗虫棉需要哪些工具？
专题一
基因工程
§1 DNA重组技术的基本工具
DNA 重组技术的基本工具
“分子手术刀” ──限制酶 “分子缝合针” ──DNA连接酶 “分子运输车” ──基因进入受体细胞的载体
GATCC— G—
（2）请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性 末端。
20-21版：1.1 DNA重组技术的基本工具（步步高）
1．1DNA重组技术的基本工具一、基因工程的概念和诞生1．基因工程的概念2．基因工程的诞生(1)理论基础①DNA是遗传物质的证明。
②DNA双螺旋结构和中心法则的确立。
③遗传密码的破译：所有生物共用一套遗传密码。
(2)技术支持①基因转移载体的发现：质粒有自我复制能力，并且可以在细胞间转移。
②工具酶的发现：陆续发现了多种限制酶、连接酶以及逆转录酶。
③DNA合成和测序技术、体外重组技术的发明和实现。
④重组DNA表达实验的成功。
(1)通过基因工程产生的变异是不定向的()(2)通过基因工程改造成的生物为新物种()(3)基因工程的原理是基因重组()答案(1)×(2)×(3)√二、基因工程操作的两种工具酶1．限制性核酸内切酶——“分子手术刀”来源主要来自原核生物种类约4 000种特点识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列切割特定核苷酸序列中的特定位点作用断裂特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键结果产生黏性末端或平末端2.DNA连接酶——“分子缝合针”(1)作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
(2)种类种类来源特点E·coli DNA连接酶大肠杆菌只能“缝合”具有互补黏性末端的双链DNA片段，不能“缝合”双链DNA片段的平末端T4DNA连接酶T4噬菌体既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端(1)DNA重组技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体()(2)DNA聚合酶也可以用作DNA重组技术的工具()(3)限制酶在原来的原核细胞内对细胞自身有害()(4)DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键，形成重组DNA()(5)E·coli连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端()(6)限制酶和解旋酶的作用部位相同()答案(1)×(2)×(3)×(4)×(5)×(6)×归纳总结与DNA相关的五种酶的比较名称作用部位作用结果限制酶磷酸二酯键将DNA切成两个片段DNA连接酶磷酸二酯键将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯键将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端DNA (水解)酶 磷酸二酯键将DNA 片段水解为单个脱氧核苷酸 解旋酶碱基对之 间的氢键将双链DNA 分子局部解旋为单链，形成两条长链下图中的图1和图2分别表示的是Eco R Ⅰ限制酶和Sma Ⅰ限制酶的作用示意图。
原创16：1.1 DNA重组技术的基本工具
C．①②⑤
D．②④
4．作为基因的运输工具──载体，必须具备的条件之一及理由是( D )
A．具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达
B．具有标记基因，以便为检测目的基因的表达提供条件
C．能够在宿主细胞中复制并稳定保存，以便于进行筛选
D．能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因
5．关于基因工程的叙述，正确的是( C ) A．基因工程是指非同源染色体上非等位基因重组 B．基因工程是指同源染色体上等位基因重组 C．基因工程是指一种生物的基因转接到另一种生物的DNA分子上 D．基因工程是指同种生物的基因转接到同种生物的其他个体DNA上 6．下列关于限制性核酸内切酶的说法，正确的是( B ) A．限制性核酸内切酶的作用部位是特定核苷酸形成的氢键 B．一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列 C．不同的限制性核酸内切酶切割DNA后都会形成黏性末端 D．限制性核酸内切酶广泛存在于各种生物中，微生物中很少分布
（2）RNA水平检测重组体 主要是检测目的基因是否能发挥其功能，即是否转录出相应的mRNA分子。
（3）从蛋白质水平进行检测： 抗原—抗体杂交。 例如，对于导入某种鱼的抗冻蛋白基因的转基因番茄，需要先通过栽培获 得果实后，再与天然产品比较，确定其是否具有了抗冻性状。
小节：
1.工具酶 “分子手术刀” ——限制性内切核酸酶 “分子缝合针” —— DNA连接酶
1.1DNA重组技术的基本工具
运载体必须具备什么条件？
5、运载体DNA分子大小应适合，以便提取 和在体外进行操作，太大就不便操作。
P7：3、天然DNA分子可以直接 用作基因工程运载体吗？ 自然存在的质粒DNA分子并不完全具 备上述条件，往往都要进行人工改造 后才能用于基因工程操作。
运载体存在于许多细菌和酵母菌中，作为运载体几个条 件的具体表现： 最常用的是大肠杆菌的质粒。 独立于细菌拟核DNA之外 1、复制原点： 的一种可以自我复制、 说明能复制并能带着 双链闭环的裸露DNA分子
限制酶作用过程：
注意观察限制酶切割的部位
重播
限制酶的切点：
磷酸二酯键
磷酸和脱氧 核糖之间的 化学键
磷 酸 二 酯 键
根据限制酶作用特点分析：
P7：2、原核生物限制酶为什么不剪
切本身的DNA？
原核生物本身的DNA分子中一般不 具备这种限制酶的识别切割序列。
限制酶所识别的序列有什么特点
大多数由6个核苷酸组成，少数4、5或8个。 呈碱基互补对称，无论是奇数个还是偶数个碱 基，都可以找到一条中轴线，其两侧的双链 DNA上的碱基是反向对称重复排列的。
GAA TTC CTT AAG
CCAGG GGTCC
中轴线两侧分别切开
（大肠杆菌)
黏性末端
(粘质沙雷氏菌)
序列中轴线处切开
平末端
将切下来DNA片段拼接成新的DNA分子， 可用什么酶？
二、DNA连接酶——”分子缝合针 “
DNA连接酶的作用过程
探讨1：DNA连接酶连接的是什么部位？
限制酶切割后有两种结果：黏性末 端或平末端。恢复它们的连接时， 所用DNA连接酶是否可以不加选择？
”
一、限制酶——”分子手术刀 “
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限制性核酸内切酶
• 主要是从 原核生物中分离纯化出来 的一种酶。 • 识别双链DNA 分子的某种 特定的核苷酸序列 ，
• 并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间 磷酸二酯键 断开。 的 • 形成两种末端
粘性末端
平末端
“分子缝合针” —— DNA连接酶 1、种类：
两类
E· coli DNA连接酶
DNA聚合酶的作用
A T A T T A T A G C
DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶
A
A T
T
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课本知识回顾 基因工程又叫做 基因拼接技术 或 DNA重组技术。通俗地说，就 是按照人们的意愿，把一种生物 基因 的某种 提取出来，加以 修饰改造 然后放 ， 到另一种生物的细胞里， 改造生物的遗传性状。 定向地
7
EcoRI限制酶的作用
大肠杆菌的一种限制酶(EcoRⅠ)只能识别GAATTC 序列，并在G和A之间切开。 在G与A之 间切割 中轴线
EcoRI限制酶的切割
黏性末端
被限制酶切开的DNA两条 单链的切口，带有几个伸出的 核苷酸，他们之间正好互补配 对，这样的切口叫黏性末端。
黏性末端
SmaI限制酶的作用
专题1 基因工程
基因工程是指按照人 们的愿望，进行严格 的设计，并通过体外 DNA重组和转基因等技 术，赋予生物以新的 遗传特性，从而创造 出更符合人们需要的 新的生物类型和生物 产，因 此又叫做DNA重组技术。
第1节
安徽省含山中学
王冰
问题探讨
人工改造
的
练习
• 在基因工程中，切割运载体和 含有目的基因的DNA片段，需 使用（ ） A. 同种限制酶 B. 两种限制酶 C. 同种连接酶 D. 两种连接酶
练习
不属于质粒被选为基因运载体的理由是
A、能复制 B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 （ D）
D、它是环状DNA
练习
3) 基因工程是在DNA分子水平上进行设计施 工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱 基互补配对的步骤是 （ C） A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞
连接黏性末端
T4 DNA连接酶
连接黏性末端和平末端
2、作用部位：
磷酸二酯键
基因进入受体细胞的载体
通常有三种:
质粒 λ 噬菌体衍生物 动植物病毒
作为载体的条件： 能自我复制；有切割位点； 有遗传标记基因；对受体细胞无害、易分离 在进行基因工程操作中,真正被用作载体的质粒都是 在 天然质粒 基础上进行过
手术刀
培育抗虫棉 缝合针 需要哪些基 运输工具 本工具 ?
自主学习
阅读课本4-5页“限制性核酸内切酶——分子 手术刀”的相关内容，填写下表
来源 种类 作用
主要从原核生物中分离纯化而来 已经分离出大约4000种 1、识别双链DNA分子的某种特定核 苷酸序列 2、使每一条链中特定部位的两个核 苷酸之间的磷酸二酯键断开。
SmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。
在G与C之 间切割
中轴线
SmaI限制酶的切割
当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA 两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。
平末端
平末端
寻根问底
你能推测限制酶存在于原核生物中的 为什么限制酶不剪切细菌本身的 DNA？ 作用是什么吗？ 通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶 原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物 在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机 的细胞，其 DNA分子中不具备这种限制酶 制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细 的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲 菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会 基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶 利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的 不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某 安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切 种限制酶也不会使自身的 DNA 被切断，并 割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的 且可以防止外源 DNA的入侵。 目的。
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阅读课本第5页“分子缝合针”——DNA连接 酶的相关内容，填写下表
类型
来源
功能
相同点 差别
E· coliDNA连接酶 大肠杆菌 恢复磷 只能连接黏性末端 酸二酯 能连接黏性末端和 T4DNA连接酶 T4噬菌体 键 平末端(效率较低)
DNA连接酶的作用
把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将 脱氧核糖和磷酸连接起来催化形成磷酸二酯 键
载体的种类
②病毒：λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。
最常用运载体——质粒
质粒——裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体（即拟核
DNA）之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。
有标记基因的存 在，可用含青霉 素的培养基鉴别。
能复制并带着 插入的目的基 因一起复制
有切割位点
实际上在基因 工程操作中， 真正被用作载 体的质粒，都 是在天然质粒 的基础上进行 过人工改造的。
目的基因
GATC— —
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阅读课本第6页“分子运输车”——运载体 的相关内容，填写下表
1）作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中
载体的作用
2）在受体细胞内对目的基因进行大量复制 1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。
载体的必 要条件
2）具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。 3）具有某些标记基因，便于进行鉴定和选择。 4）必须是安全的 ，对受体细胞无害。 5）载体DNA 分子应大小适中，以便于提取和操作 ①细菌的质粒
↓
末端。
— GATC —„„— GATC — — CTAG↑—„„— CTAG↑—
↓
目的基因
↓
用酶Ⅱ切割
（3）在DNA连接酶作用下，上述两种不同限制酶切割后形 成的黏性末端能否连接？为什么？ 可以连接。因为由两种不同限制酶切割后形成的黏 性末端是相同的（或是可以互补的）
— GATC—„„— —CTAG —„„—CTAG
作用结 果
形成两种末端：黏性末端或 平末端
脱氧核苷酸的结构
5’ 4’ 3’ 1’ 2’
磷酸二酯键
5’
A
1’
5’端
3’端
4’
3’ 2’
3’,5’-磷 酸二酯 键
5’ 4’ 3’
G
1’ 2’
5’端 3’端
限制酶的识别序列
仔细观察各限制酶 识别的特定序列有 何 特点？
限制酶所识别的序列的特点是： 呈现碱基互补对称，无论是6个 碱基还是4个碱基，都可以找到 一条中心轴线，中轴线两侧的 双链DNA上的碱基是反向对称 重复排列的 ，称为回文序列
形成DNA的一条 链
DNA复制
小试身手
限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制 性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。在质粒上有 酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶Ⅱ的切点。 （1）请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。
—G GATC C— 用酶Ⅰ切割 —G GATCC— — C CTAG↑G— （ 2）请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性 —CCTAG G—
DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
DNA连接酶 DNA聚合酶
相 同 点
作用实质
化学本质
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质 不需要 在两个DNA片 段之间形成磷 酸二酯键 需要
只能将单个核苷 酸连接到已有的 DNA片段上，形 成磷酸二酯键
模板 作用对象
不 同 点
作用结果 用途
形成完整的重 组DNA分子 基因工程
DNA连接酶的缝合作用
可把黏性末端之间的 缝隙“缝合”起来， 两DNA片段要具有互补 的黏性末端才能拼起来
注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口， 但不能连接单链DNA！
DNA连接酶的缝合作用
T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来， 但效率较低
DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？
D、目的基因的检测和表达
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