LAPTM4B对人肝癌细胞SMMC―7721的细胞生长的研究

摘要：目的：探讨laptm4b对人肝癌细胞smmc-7721的增殖影响及其具体的分子机制。

结果：
结论：laptm4b通过上调周期蛋白cyclind1、cycline促进肝癌细胞的生长。

关键词：肝癌laptm4bcyclind1cycline
【中图分类号】r4【文献标识码】a【文章编号】1671-8801（2012）12-0009-02
原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，hcc）是最常见的恶性肿瘤之一，不仅它的发病率居于世界恶性肿瘤的第五位，位于中国恶性肿瘤的第二位[1]。

同时它的死亡率也位于世界恶性肿瘤的第四位。

但是目前对于hcc的发病机制尚不完全清楚，因此，给临床治疗带来了相当的困难[2]。

溶酶体相关四次穿膜蛋白质b（lysosome-associated protein transmembrane 4 beta），缩写为laptm4b，它是近几年被发现和研究的肝癌细胞中高表达的基因，目前关于它的功能报道，主要在于细胞增殖与分化方面[3]。

本实验主要探讨laptm4b 对人肝癌细胞smmc-7721的增殖影响及其具体的分子机制，为临床治疗肝癌提供新的靶点。

1实验材料与方法
1.1实验材料。

真核表达质粒pcdna3来自本实验室，laptm4b的cdna购自santacruze，蛋白laptm4b、cyclind1、cycline的抗体均购自abcam，流式细胞术检测试剂盒购自invitrogen，转染试剂lipo2000购自invitrogen，人肝癌细胞smmc-7721购自中科院细胞库。

1.2细胞的培养与转染。

按照atcc的方法培养细胞。

人肝癌细胞smmc-7721于含10%胎牛血清的dmem中培养，培养条件为5%co2，37℃恒温培养箱，2-3天传代一次。

按照invitrogen的转染试剂lipo2000的操作说明书，进行细胞的转染。

本研究的实验处理为：对照组即不做任何处理的肝癌细胞smmc-7721组，mock组即转染空载质粒pcdna3的细胞组，实验组即转染重组质粒pcdna3-laptm4b的细胞组。

1.3laptm4b基因的rt-pcr检测。

根据rt-pcr引物设计的数据库，上游：5-cctatcactctgccctgaac-3，下游：5-ccgtactgtgattcctggtaagat-3。

根据实验设计的不同分组，分别对细胞进行不同的处理。

转染24h后，提取细胞中的rna，然后逆转录为相应的cdna序列，根据设计的引物，检测目的基因的mrna表达水平。

同样的细胞处理，然后通过laptm4b的蛋白抗体检测目的蛋白的表达。

1.5mtt检测smmc-7721细胞的体外存活率的影响。

将人肝癌细胞smmc-7721按1×104/孔的密度植入96孔板中，每孔加入100ul细胞培养液培养过夜。

实验处理为空白对照组、空载质粒转染组、质粒pcdna3-laptm4b组。

72h后，于倒置显微镜下观察细胞的状态，然后在每孔中加入20μl的5mg/ml的mtt溶液，于5%co2，37℃恒温培养箱继续培养4h，然后小心吸去孔里的培养液，pbs洗一次细胞，每孔加入150μl dmso，置摇床上低速振荡10min。

在酶联免疫检测仪od595nm处测量各孔的吸光值。

同时设置调零孔、对照孔，将测得的od值代入公式，进而计算细胞的存活率。

细胞存活率=（处理组od值-调零组的od值）/（对照组od值-调零组的od值）×100%
1.6流式检测smmc-7721细胞的细胞周期变化。

按照atcc的方法培养细胞。

人肝癌细胞smmc-7721于含10%胎牛血清的dmem中培养，培养条件为5%co2，37℃恒温培养箱，2-3天传代一次。

按照invitrogen的转染试剂lipo2000的操作说明书，进行细胞的转染。

每组各取约1×106细胞，用胰酶消化1min成单细胞悬液，经冷乙醇固定12h，pbs洗3次，rnaasea消化30min，然后用碘化丙啶（propidiumiodide，pi）染色，细胞于流式细胞仪进行细胞周期定量分析。