双酶直接酶解米糠制备短肽的工艺优化
酶解_膜分离耦合技术制备米糠蛋白活性多肽的研究
第23卷第4期高校化学工程学报No.4 V ol.23 2009 年 8 月 Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities Aug. 2009文章编号：1003-9015(2009)04-0632-07酶解-膜分离耦合技术制备米糠蛋白活性多肽的研究丁青芝1, 马海乐1,2, 骆琳1, 滕超1, 贾俊强1(1. 江苏大学食品与生物工程学院, 江苏镇江 212013;2. 江苏省农产品生物加工与分离工程技术研究中心, 江苏镇江212013)摘要：为了探索米糠蛋白活性多肽的最佳酶法制备方法，进行了三种酶解-膜分离耦合反应模式制备活性多肽的研究。
结果表明，间歇反应条件下蛋白转化率为47.50%，生产效率为1.98g肽/AU酶，均为传统方法的1.27倍；连续补水反应模式蛋白转化率最高，即68.54%，分别是传统方法的1.84倍、间歇反应模式的1.47倍、连续补料反应模式的1.19倍；连续补料反应模式的蛋白转化率为57.61%，是传统制取方法的1.54倍，其生产效率最高，即11.46g肽/AU酶，分别是传统方法的7.37倍、间歇反应模式的5.79倍、连续补水反应模式的2.81倍。
上述结果显示，三种酶膜耦合反应模式都能强化反应过程、提高蛋白转化效率和生产效率。
就来源广泛的米糠蛋白而言，连续补料酶膜耦合反应模式是一种比较好的多肽制备方法，蛋白转化率和酶利用率均显著提高。
关键词：米糠蛋白；水解；酶膜耦合；蛋白转化率中图分类号：TS210.9；TQ936.16；TQ925.2 文献标识码：APreparation of Polypeptides from Rice Bran by Integration of Enzymatic Hydrolysisand Membrane SeparationDING Qing-zhi1, MA Hai-le1,2, LUO Lin1, TENG Chao1, JIA Jun-qiang1(1. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China; 2.Jiangsu ProvincialResearch Center of Bio-processing and Separation Engineering of Agri-products, Zhenjiang 212013, China)Abstract: In order to develop the optimum preparation method of polypeptides from rice bran with the protease Alcalase, three models of integration of enzymatic hydrolysis and membrane separation (IEM), such as the inter IEM (IIEM), the IEM with continuously supplying water (IEM-CSW) and IEM with continuously supplying raw material (IEM-CSRM), were studied. The results show that, using IIEM, the protein conversion ratio of the rice bran can be up to 47.50% with productivity of 1.98 g peptide·(AU protease)−1, both of them are 1.27 times as much as those obtained by the traditional method. Using IEM-CSW, the protein conversion ratio reaches 68.54%, which is about 1.84, 1.47 and 1.19 times of those of the traditional method, IIEM and IEM-CARM, respectively. The protein conversion ratio of IEM-CSRM is 57.61%, which is 1.54 times of that of the traditional method; moreover, IEM-CSRM has the highest polypeptides productivity of 11.46 g peptide·(AU protease)−1, which is 7.37, 5.79 and 2.81 times of those of traditional method, IIEM and IEM-CSW, respectively. It may be concluded that reaction process can be strengthened and the protein conversion and productivity can be enhanced by each of the three IEM models studied. As for using wide-source rice bran as raw material, the IEM-CSRM is an effective polypeptides preparation method due to its high conversion ratio of protein and utilization efficiency of protease.Key words: rice bran protein; hydrolysis; integration of enzymatic hydrolysis and membrane separation(IEM);conversion ratio of protein收稿日期：2008-01-24；修订日期：2008-07-11。
制备米糠蛋白降血压肽最佳用酶的筛选
制备米糠蛋白降血压肽最佳用酶的筛选于靖;翟爱华【摘要】试验以筛选制备米糠蛋白降压肽最佳用酶为目的。
选用碱性蛋白酶、碱性蛋白酶Alcalase 2.4 L、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K和双酶复合水解米糠蛋白,以血管紧张素转化酶（ACE）抑制率为主要指标,筛选出制备米糠蛋白降压肽的最佳用酶。
结果表明,米糠降压肽ACE抑制率的大小与酶的种类及配比有关,筛选出碱性蛋白酶Alcalase为试验用酶,在酶解温度45℃,加酶量3 000 U.g-1,酶解pH8.5,米糠蛋白底物浓度3%酶解2 h时达到最大抑制率为71.1%。
%The aim of this study was to select the best enzyme for rice bran protein.Rice bran protein was enzymolysised by alkali protease,Alcalase 2.4 L,neutralprotease,papain,trysase,chymotrypsin,proteinase K and double enzyme composite to produce antihypertensive peptides,with ACE inhibiting rate as major indicator.The results indicated that ACE inhibiting rate of antihypertensive peptides in rice bran was related to the kind of enzyme and their ratio,and the best enzyme was alkali protease,the enzyme hydrolysis conditions were：hydrolysis temperature 45 ℃,the enzyme addition 3 000 U·g-1,pH8.5,substrate concentration 3%,hydrolysis time 2 h,its highest inhibiting rate reached 71.1%.【期刊名称】《黑龙江八一农垦大学学报》【年(卷),期】2012(024)004【总页数】5页(P57-60,109)【关键词】米糠蛋白;血管紧张素转化酶抑制肽;蛋白酶【作者】于靖;翟爱华【作者单位】黑龙江八一农垦大学食品学院,大庆163319;黑龙江八一农垦大学食品学院,大庆163319【正文语种】中文【中图分类】S482近年来国内外研究表明，食物蛋白质酶解产物中的一些短肽具有广泛的生理调节功能[1-3]，特别是具有降压活性的降压肽已成为生物活性肽研究领域的重要方面。
双酶法制糖工艺流程及控制介绍PPT课件
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玉米由 4部分组成（干物质百分比）
Pericarp 表皮 5%
Bran, Fiber, Gluten Feed 麸皮，~87%纤维， 麸质饲料
Endosperm 胚乳 82%
~88%Starch and ~8%Gluten ~88%淀粉和~8%蛋白
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淀粉的分子结构
葡萄糖 (C6H12O6) MW = 180
直链淀粉
• 占淀粉的20-30% • DP : 2,000-6,000 • 直链淀粉都是由α- 1,4葡萄糖苷键连接的
支链淀粉
• 占淀粉的70-80% • DP : 300,000-3,000,000 • 支链淀粉绝大多数由α- 1,4葡萄糖苷键连
Germ 胚芽 12%
Solubles, ~30%Oil 可溶物，~30%油
Tip Cap 顶尖1%
~79%纤维
Horny, Hard Endosperury, Soft Endosperm 粉状，软质胚乳（绝大多数是淀粉）
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（5分钟，105℃+90分钟，95℃）
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减少色素的产生和精制的费用。
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5.5 杜邦与梅花集团共6享资料，仅供内部参6.考5，请勿与第
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好的液化的标准：
合理的DE值控制，糊精的分子量分布均匀。 碘试颜色合格，没有蓝色和紫色。 蛋白凝聚好，结块大且紧密。 液体澄清透明，透光率高。 液化结束后，及时杀灭或抑制淀粉酶的残余活性。
米糠蛋白提取工艺优化及其特性研究
温焕斌1, 曹晓虹1 , 李翠娟1 , 韩永斌1 , 顾振新1* , 茅晓慧2
( 1. 南京农业大学 农业部农畜产品加工与质量控制重点开放实验室, 江苏 南京 210095; 2. 常州市五星街道农副产品公司, 江苏 常州 213016)
摘 要: 以米糠为原料, 研究影响米糠蛋白提取率的因素, 采用响应面法优 化其提取 工艺。结果表 明: 米 糠脱脂处理 有 利于蛋白的提取; 在提取温度 43 、时间 1 7 h 和液料比 11 mL g- 1 的条件下, 米糠蛋白提取率 达 37 12% , 其纯度 为 77 68% 。米糠蛋白特性分析显示: 米糠蛋白中 23 和 35 ku 的小分子组分占 45% 以上, 具有 良好的溶解性、乳化性、起泡 性、持水性和持油性。
光度计( UV 2802 型, 上海尤尼柯仪器公司) ; 微电脑控制多用电泳仪( DYY 10C 型, 北京六一仪器厂) ; 电 泳槽( DYY !型, 南京大学化学仪器厂) ; GEC DOC EQ 凝胶成像分析系统( 美国 Bio Rad 公司) 。
1 3 试验方法 1) 米糠蛋白提取工艺: 称取 50 g 米糠, 置于三角瓶中, 按一定的液料比加水, 调节 pH 至 8 5, 于
第 31 卷第 2 期 2010 年 6 月
扬州大学学报( 农业与生命科学版) J ournal of Yangzh ou U nivers ity ( A gricu lt ural and Lif e Science Edit ion)
V ol. 31 N o. 2 Jun. 2010
米糠蛋白提取工艺优化及其特性研究
分散器在 12 000 r min- 1下分散 2 min, 1 500 r min- 1离心 5 min, 测量液体总高度和乳化层高度。 乳化性 Ec = ( H 1 / H 0 ) ∀ 100% , 式中 H 1 为乳化层高度( cm ) , H 0 为离心管液体总高度( cm) 。
双酶法水解米糠淀粉的工艺研究
０ ． ２ ％， Ｄ Ｅ值 为 ２ ４ ． ３ １ ％； 最佳糖化 工 艺条件 为糖化 酶 添加 量 ２ ０ ０ ｕ ／ ｇ ， 温度 ６ ０ ｏ Ｃ， ｐ Ｈ ４ ． ０ ， 糖化 时间６ ｈ ， 最 大 Ｄ Ｅ值 为 ９ ８ ． ９ ６ ％ 。该工 艺使 米糠 中淀粉 的提 取 率达到 了 ８ ９ ％， 并基 本都 水 解 为 了还原 糖 ， 可作 为 纳 豆 芽孢杆 茵液 态发 酵的优 质碳 源 。 关键词 米糠淀粉 水解 ｏ 【 一淀粉酶 糖 化酶
合物。约占稻谷质量 的 ５ ％一 ８ ％ Ｊ 。米糠是一种可
再生的、 廉价的、 数 量 巨大 的低 值 生 物质 原 料 ， 其 富 含 淀粉 、 纤维素 、 蛋 白质 、 脂肪、 糖类 、 维 生 素 和 矿 物
质等各种营养物质 Ｊ ， 米糠 中以淀粉含量最高 ， 约为
３ ３ ％， 如 能将其 全部 转 化 为葡 萄糖 ， 则 可作 为 纳 豆 菌 液 态发 酵碳 源 的 优 质 原 料 。另 外 还 有 研 究 显 示 ， 经 纳 豆 菌发 酵后 的米糠 提取 物 及上 清 液具 有很 好 的抗 氧化 、 抗 衰 老 和 调 节 肠 道 功 能 的 作 用 Ｊ 。 因此 ，
件。
纳 豆 芽孢 杆 菌 （ Ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｎ ａ ｔ ｔ ｏ ） 是 从 日本 的传 统 发 酵食 品纳 豆 中发 现 并 分 离 出来 的一 种 益 生 菌 ， 其
代 谢产 物纳 豆激酶 具有 十分有 效地 溶栓 效果 Ｉ ２ Ｊ ， 而
双酶分步酶解谷朊粉制备短肽的研究
谷朊 粉 又 名 小 麦 面 筋 蛋 白 ， 谷朊 粉 中蛋 白质 质
短肽 ， 保 证 产 品功能 特性 ， 使 谷 朊 粉短 肽 制备 成 本 增 加 。因此如 何 简 化 工 艺 的 同时 获 得 高 水 解 度 、 高 得
率、 低分 子 质量 的谷 朊 粉 短 肽成 为 生 产 工艺 中需 要 解 决 的技术难 题 。 本 研究 以谷朊 粉 为 原 料 ， 通 过 一 系列 单 一 酶 和
本 文通过 比较酶 种 类、 加 酶量 、 底物 浓度 、 酶 解温度 、 酶 解 时 间对短 肽得 率 和 水解度 的 影响 ， 采用
二 次 回归正 交旋 转组合 设计优 化 分步 酶解 制备谷 朊粉 短肽 的 最佳 工 艺。在 复合 蛋 白酶 （ Ｐ ｒ ｏ ｔ ａ ｍ ｅ ｘ ） 水 解谷朊粉 ９ １ ． ５ ０ ｍｉ ｎ后 加入 中性 蛋 白酶 （ Ｎ ｅ ｕ ｔ ｒ ａ ｓ ｅ ） 继续酶解 １ ２ １ ． ５ ０ ｍ ｉ ｎ ， Ｐ ｒ ｏ ｔ ａ ｍ ｅ ｘ添加 量 为 ６ ６ ５ ． ０ ０ Ｕ ／ ｇ底 物 ， Ｎ ｅ ｕ ｔ ｒ ａ ｓ ｅ 添加 量 为 ５ ２ ９ ０ ． ０ ０ Ｕ ／ ｇ底 物 ， 水 解 温度 ５ ０ ℃， 质 量浓度 １ ２ ％， 在此 条件下 ， 短肽得 率为 ６ ９ ． ８ ８ ％， 水 解 度
条件 温和 ， Ｔ Ｃ Ａ—Ｎ Ｓ Ｉ 和Ｄ Ｈ高， 纯度 高 ， 分子量 集 中分布 于 １ ０ ０ ０ Ｄ ａ以下 等特 点。 关键 词 谷朊 粉短 肽 复合 蛋 白酶 中性 蛋 白酶 文献标 识码 ： Ａ 分步酶 解 中图分 类号 ： Ｔ Ｓ ２ ０ １ ． ２ 文 章编 号 ： １ ０ ０ ３— ０ １ ７ ４ （ ２ ０ １ ７ ） ０ ９— ０ １ ３ ９— ０ ８
酶解法制备米糠营养食品的研究
酶解法制备米糠营养食品的研究米糠是一种含有重要营养和药用功能物质的天然植物类食品原料。
近年来，随着植物营养食品技术的发展，运用米糠营养食品成为营养专家的新的研究兴趣所在，也是食品行业的重要研究课题。
因此，怎样有效地从米糠中制备安全营养丰富的营养食品，以满足消费者的营养需求成为当前的研究热点。
酶解法是一种常用的植物营养素萃取制备方法。
它基于酶介导的物质转化，能够有效提取食物原料中的有效营养组分，并尽可能保留食物原料的营养和药用价值，得到营养价值更高的产物。
有越来越多的研究报道酶解法制备米糠营养食品的技术途径，具有较高的实用价值。
首先，要制备米糠营养食品，需要经过野外采集和加工等工艺。
野外采集的米糠要求新鲜，经过筛洗、剥皮、分级等处理，使其达到食品质量要求。
然后，应选取适宜的酶剂和酶处理条件，处理过的米糠由糠质及营养组分转变为比现有米糠品质更高的优质营养食品原料。
其次，经过液体酶处理后的米糠糊精液可以通过蒸煮、烘干、模切、铝箔包装等工艺加工成营养丰富的零食或膨化食品等营养食品。
此外，可根据研究要求和酶处理的条件，选取有效的米糠提取剂，酶辅助提取高纯蛋白质和其他有价值的多种营养素，得到高品质的营养价值食品。
最后，酶解法制备米糠营养食品还可在发酵后，引入各种其他食物原料，从而生产出具有独特口感、滋味和营养价值的植物蛋白、多种维生素和矿物质，发挥其独有的药物功效等功能效益，制备出满足消费者营养需求的新型植物营养食品。
总之，酶解法制备米糠营养食品的技术，不仅有效保留了米糠营养成分，而且运用起来比较方便，能够有效地开发米糠的营养价值，从而为消费者提供更丰富的营养料理选择。
酶解法制备米糠营养食品的研究
米糠营养食品是一种由稻米糠精制而成的新型优质营养食品，其具有
稻米饭类营养特征、粗粮类结构体特征、粉类加工特征和丰富的营养
价值。
目前，米糠营养食品正以其极佳的营养价值和适宜的口味数量
等特点，受到了消费者的欢迎。
鉴于此，研究采用酶解法制备米糠营养食品，旨在发挥米糠营养价值，研发出低糖、低淀粉、低过敏，结构细腻、口感良好、营养价值高的
米糠营养食品，为消费者的健康及低糖、低脂和低胆固醇食品需求提
供新思路和良好的方案。
针对此目的，研究优先考虑利用淀粉酶、蛋白酶(如草酶活性)等酶及非酶促性酶在升温、加压和pH控制等条件下，进行酶解。
研究发现，在不影响稻米糠籽衣表面质地特征及结构粒度的条件下，淀粉酶、蛋白
酶和非酶促性酶可有效降低米糠籽衣中淀粉、蛋白质及过敏原含量，
使米糠清淀粉、蛋白质和过敏原含量控制在一定的水平，有利于控制
米糠营养食品质量及口感。
此外，此次研究还考虑米糠在营养成份分析及最终食品制备中应用木
糖醇抗逆转酶抗氧化体系进行保鲜，避免米糠食品浓缩配方中易氧化
物质如油脂氧化等。
综上所述，通过酶解法制备米糠营养食品是有效提升米糠营养价值及
改善多种不良特性的重要手段，为消费者在享受营养健康的同时享受
米糠食品的高营养价值及可口口感提供了另一种健康美食的选择。
酶解法制备米糠膳食纤维
2007年7月第22卷第4期中国粮油学报Journal of the Chinese Cereals and O ils A ss ociati onVol.22,No.4Jul.2007酶解法制备米糠膳食纤维许 晖 孙兰萍 张 斌(蚌埠学院食品与生物工程系,蚌埠 233030)摘 要 对米糠中膳食纤维的酶解法制备工艺进行了研究。
通过单因素试验、正交试验和极差分析,得出了酶法制备米糠膳食纤维的最佳工艺参数。
结果表明,在混合酶(α-淀粉酶与糖化酶质量之比为1∶2)用量0.4%、70℃处理45m in,蛋白酶用量0.3%、50℃处理45m in时,膳食纤维得率较高,膳食纤维中的酸性洗涤纤维含量达68.54%。
因此,该酶法工艺为米糠膳食纤维的制备提供了依据。
关键词 米糠 膳食纤维 混合酶 蛋白酶 我国是世界上种植水稻的主要国家,水稻的产量很高,然而在水稻加工过程中作为副产品的米糠却没有得到有效地利用,据统计我国米糠年产量约在1000万t左右,是一种量大面广的可再生资源,目前国内产品化的高附加值米糠制品还比较少,大部分都被用作畜禽饲料,只有10%～15%的米糠被用来榨油或进一步提取植酸钙、肌醇、谷维素等价值较高的产品。
因此,米糠的深加工及充分开发利用在国内具有重要的意义。
其实米糠中含有丰富的膳食纤维,可占米糠干基的35%～50%,此外还含有蛋白质、脂肪、维生素等营养成分,具有很高的营养价值[1],因此开发利用米糠具有广阔的市场潜力。
膳食纤维的功效随着科学研究的深入而逐渐被人们认识,现在被人们称为“第七营养素”[2],最新研究表明,增加饮食中膳食纤维的含量可以减少冠心病、肥胖症、高血压、糖尿病的发病率,减轻长期大量饮酒对胰脏的损伤,降低血液中胆固醇的含量提高肾切除者对氮的排泄功能,摄取适当比例的水溶性和水不溶性膳食纤维,可以改善肠的吸收功能预防结肠癌[3-5],此外在清除外源有害物质方面也有着独特的功能和效果[6]。
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中国农业科学 2009,42(5):1744-1750 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2009.05.030收稿日期：2008-08-19；接受日期：2008-11-18基金项目：国家“十一五”科技支撑计划（2006BAD05A01-13）、广东省自然科学基金团队项目（6200586） 作者简介：俞明伟（1983－），男，浙江嘉兴人，硕士，研究方向为食品营养与功能。
E-mail ：yumingwei2000@ 。
通信作者张名位（1967－），男，湖北荆州人，研究员，博士，研究方向为生物活性物质与功能食品。
E-mail ：mwzhh@双酶直接酶解米糠制备短肽的工艺优化俞明伟1,2，张名位1，孙远明2，张 雁1，魏振承1，张瑞芬1，唐小俊1，池建伟1（1广东省农业科学院生物技术研究所/农业部功能食品重点开放实验室，广州 510610；2华南农业大学食品学院，广州 510642）摘要：【目的】建立在中低温度下直接酶解米糠制备短肽的优化工艺。
【方法】采用二次回归正交旋转组合设计优化直接酶解米糠制备短肽的工艺条件，其中总糖含量测定采用蒽酮比色法，水解度（degree of hydrolysis，DH）采用pH-stat 法，蛋白质回收率采用凯氏定氮法。
【结果】确定直接酶解米糠制备短肽最佳工艺条件为：米糠先经糖酶（viscozyme）反应2 h 去除糖类杂质，然后用碱性蛋白酶（alcalase）和胰蛋白酶双酶水解，最适pH 8.2，温度45℃，alcalase 与胰蛋白酶酶活比59﹕41，总酶活5 750 U/g 底物，水解时间3 h。
在此条件下，DH 为23.04%，蛋白质回收率为84.33%，酸溶性多肽（TCA-SN）为68.40%，短肽分子量主要集中在1 000 D 以下。
【结论】在中低温和偏中性（pH 8.2）条件下，采用碱性蛋白酶和胰蛋白酶双酶直接酶解米糠制备短肽，与先提取蛋白后酶解制备短肽的方法相比，具有操作步骤简单、蛋白质利用率高等特点，是一种制备米糠肽的新途径。
关键词：米糠；肽；酶解工艺；水解度；蛋白质回收率Study on Optimal Hydrolysis Process for Preparing Rice Bran ShortPeptides with Two EnzymesYU Ming-wei 1,2, ZHANG Ming-wei 1, SUN Yuan-ming 2, ZHANG Yan 1, WEI Zhen-cheng 1,ZHANG Rui-fen 1, TANG Xiao-jun 1, CHI Jian-wei 1(1Key Laboratory of Functional Food, Ministry of Agriculture/Bio-Technology Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510610; 2College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642)Abstract: 【Objective 】 To establish an optimal enzymatic hydrolysis process for short peptides directly from rice bran under low and medium temperature. 【Method 】 Quadratic regression orthogonal rotational combing design was used to determine the optimal enzymatic hydrolysis process. Anthrone colorimetry’s method was used to measure the carbohydrates content, pH-stat method to measure the degree of hydrolysis and Kjeldahl’s method to measure the recovery of protein. 【Result 】 The optimum enzymatic hydrolysis conditions for short peptides were: reaction time of viscozyme for removing carbohydrate was 2 hours firstly, then protease hydrolysis with alcalase and trypsin was carried out at pH 8.2, temperature 45, the activity ratio between alcalase and ℃trypsin was 59﹕41, the total enzyme activity was 5 750 U/g substrate, and 3 hours. Under such conditions the DH was 23.04%, the recovery of protein could reach up to 84.33%, TCA-SN was 68.40%, and the molecular weight of peptides was mainly concentrated at below 1 000 D. 【Conclusion 】 It is a better approach with convenient operation and high recovery of protein for preparing rice bran short peptides compared to traditional ways of extracting protein first and then preparing short peptides with enzymatic hydrolysis.Key words: rice bran; peptides; enzymatic hydrolysis process; degree of hydrolysis; recovery of protein0 引言【研究意义】米糠蛋白属于植物源蛋白，其肽易于被人体吸收利用，其氨基酸组成与FAO/WHO 的推荐模式相近[1]。
由于米糠蛋白的低过敏性，其水解制备肽后可在食品中广泛应用。
因此研究米糠中短肽的5期俞明伟等：双酶直接酶解米糠制备短肽的工艺优化 1745提取工艺具有重要意义。
【前人研究进展】前人对米糠蛋白的利用研究集中在追求蛋白高提取率和高水解度上。
王立等[2]在pH 12下米糠蛋白提取率达到87.62%，但过高pH，导致蛋白质含盐过多以及部分变性；王雪飞等 [3]比较了多酶酶解回收蛋白质，回收率达62.04%，但由于是单一酶作用，蛋白质回收率低；金世合等[4]考察了复合糖酶对蛋白质提取纯度的影响，纯度达80.20%，总糖仅3.7%。
【本研究切入点】目前直接酶解米糠制备短肽未见报道。
另外鉴于传统碱溶酸沉方法带入过多的无机盐，高pH导致蛋白质变性等问题，有必要找到一种反应条件偏中性，操作简单，步骤简洁，高蛋白质回收率的制备米糠短肽的新方法。
【拟解决的关键问题】本研究采用二次回归正交旋转组合设计优化双酶直接酶解米糠制备短肽的工艺条件，以期在获取米糠肽高水解度的前提下，保证蛋白质高回收利用率，同时要求肽液中糖类杂质含量少，为米糠肽的高效制备提供新方法。
1 材料与方法1.1 试验材料与试剂1.1.1 材料 新鲜全脂米糠：水稻品种为‘粤香占’，由广东省农业科学院水稻研究所提供，蛋白质含量为13.92%，脱脂后蛋白质含量为16.91%。
1.1.2 试剂胰蛋白酶（trypsin）、中性蛋白酶（neutral protease）、木瓜蛋白酶（papain）、碱性蛋白酶（alcalase）、糖酶（viscozyme），诺维信公司；考马斯亮蓝-G250、牛血清蛋白、葡萄糖标品，上海伯奥生物科技有限公司；三氯乙酸、95%乙醇、磷酸、盐酸、氢氧化钠、硫酸铜、硫酸钾、铬酸钾、浓硫酸等，均为国产分析纯；Sephadex G-25凝胶，Pharmacial 公司；标准品蓝色葡聚糖凝胶-2000、L-酪氨酸、VB12、溶菌酶、牛血清蛋白，上海伯奥生物科技有限公司。
1.2 试验方法1.2.1 米糠酶解工艺 脱脂米糠→加水（料水1﹕10）→加糖酶水解2 h（pH 3.5，45℃）→调节pH 4.5→离心→加水（料水比1﹕10）→加蛋白酶（调pH，温度）→水解→离心（3 800 r/min，10 min）→洗涤沉淀→合并上清液→3 000 D分子量膜过滤→浓缩→干燥→米糠短肽。
1.2.2 膜过滤参数压力1.5 kg·cm-2，透过量为33.5 ml·min-1，透过分子量3 000 D。
1.2.3 糖酶去糖效果试验 为了去除直接酶解制备肽中过多的糖类杂质，试验通过添加糖酶来探讨糖酶对米糠中总糖去除效果的影响。
糖酶添加量为5 µl·g-1米糠，pH 3.5，时间2 h，温度45℃，料水比1﹕10。
试验比较了未添加糖酶直接酶解米糠（处理Ⅰ），先添加糖酶后加蛋白酶酶解米糠（处理Ⅱ）和未加糖酶先提蛋白质后用蛋白酶酶解（处理Ⅲ）3种方法对肽液中糖类杂质含量影响。
1.2.4 蛋白酶筛选与组合试验 分别选用上述4种蛋白酶对米糠中蛋白质进行单酶水解。
各酶基本性质和酶解时间及酶添加量见表2。
参考单酶酶解效果，采用双酶混合对米糠蛋白进行水解，以碱性蛋白酶为主酶，分别与中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶组合（表3）。
1.2.5 双蛋白酶水解条件单因子试验鉴于直接以米糠为酶解对象，酶解底物浓度过高，导致水料比过小出现料液浓度过大而黏稠，不利于其中蛋白质溶出和作用位点的暴露，故试验中统一采用料水比为1﹕10，即底物浓度1.69%，分别考虑蛋白酶酶解时间、pH、温度、加酶量和酶活比为影响因子。
根据单酶筛选试验结果，选择碱性蛋白酶和胰蛋白酶组合。
（1）酶解时间设定双蛋白酶反应温度45℃，pH 8.0，酶活添加量5 000 U/g底物，碱性蛋白酶和胰蛋白酶酶活比3﹕2，酶解处理时间分别为30、60、90、120、150、180、210和240 min。