阿维菌素产生菌的生物技术改造研究进展_刘婷婷
阿维菌素高产菌株的选育和发酵条件的优化的开题报告
阿维菌素高产菌株的选育和发酵条件的优化的开题
报告
一、选题背景
阿维菌素是一种广谱抗生素，具有很高的抗菌活性，常用于治疗细
菌感染。
由于抗生素滥用和误用的普遍存在，导致了细菌耐药性的出现
和增加，而且阿维菌素过去被广泛应用，引起了菌株抗性的出现，使得
阿维菌素的疗效逐渐下降。
为了提高阿维菌素的生产效率和抗菌活性，
需要通过选择高产菌株，或者优化发酵条件等方式来提高阿维菌素的产
量和质量。
二、选题目的
本课题的目的是通过筛选出阿维菌素高产菌株以及优化阿维菌素的
发酵条件，提高阿维菌素的生产效率和抗菌活性。
三、选题内容
1.高产菌株的筛选
阿维菌素的产量由菌株的基因信息以及培养条件等因素决定，因此，筛选出阿维菌素高产菌株是本课题的重要研究内容。
通过采用菌株的遗
传改造、群体诱变等方法，研究阿维菌素产量和质量之间的关系，最终
从中挑选出高产菌株。
2.优化阿维菌素的发酵条件
阿维菌素的合成需要特定的生长环境和发酵条件，包括培养基组成、培养温度、pH值、气体调节等因素。
通过研究这些因素在阿维菌素合成
中的影响，进一步优化发酵条件，提高阿维菌素的产量和质量。
四、预期成果
通过本研究，预期能够：
1.筛选出阿维菌素高产菌株，提高阿维菌素的产量和质量；
2.优化阿维菌素的发酵条件，提高生产效率和抗菌活性。
五、研究意义
本研究的意义在于提高阿维菌素的产量和质量，优化生产工艺和方法，有助于阿维菌素在临床上的广泛应用，提供更好的抗菌治疗手段。
此外，也有望为其他抗生素的生产和开发提供有益的经验和参考。
阿维菌素结构改造的新进展
阿维菌素结构改造的新进展李友顺#梁晓梅王道全**（#中国农业大学应用化学系农药化学及农药使用技术农业部重点开放实验室北京 100094）阿维菌素（avermectins）[1] 是一组由链霉菌Streptomyces avermitis产生的十六员环内酯衍生物，对家畜，如羊、牛、狗、马、猪等的肠内寄生虫具有极其有效的驱虫活性，并具有作用机制独特、有效剂量低、安全性高等特点。
阿维菌素还在农业上用作杀螨剂和杀虫剂。
用作医药的研究正在进行中。
从结构上看，阿维菌素是一组由十六员环内酯与一个二糖（齐墩果糖）所生成的苷（图1），在十六员环内酯周围还有一个含两个六员环的螺缩酮系及六氢苯并呋喃环系。
根据C5和C25上取代基的不同以及C22-C23结构上的差别区分为8个组分，分别用A，B；1，2；及其a，b的组合来命名。
当描述a和b的混合物时，仅用前两个符号，如阿维菌素 B1意指B1a和B1b的混合物，而代号B1a和B1b指的是单一化合物。
生物活性评价表明，全部8个天然阿维菌素都是有效的驱除家畜肠内寄生虫药剂，但是药效有一定差异。
作为农用药剂，杀螨效果高于杀虫效果。
其中B1对农业害虫和螨类最为有效，已被商品化，名为abamectin。
由于阿维菌素显示出广谱、高效的活性以及在环境中易于降解的特性而吸引了许多化学公司投入力量进行研究；结构的复杂性又使众多合成工作者接受合成的挑战。
为进一步提高活性、降低毒性和改变其活性谱，在阿维菌素的结构改造方面进行了广泛的研究，如碳-碳双键的改造（如依维菌素（ivermectin）的开发成功），羟基的改造（如甲氨基阿维菌素的合成开发），侧链的改造，糖基的水解与改造，手性碳构型的翻转等。
本文重点综述近几年来阿维菌素结构改造的新进展，此前的结构改造工作参见文献[1]。
1 羟基的改造阿维菌素分子中有2～4个羟基，因此在结构改造中占有重要的地位，反应的类型主要有烷基化、酰化、磷酰化和氧化[1]。
阿维菌素生物合成及其代谢途径研究进展
突破性进展 ， 阿维菌素的生物合成途径 已基本阐明， 有关生物合成基 因簇 已被克隆 ， 多数基 因的功能已经明 确 Ｊ ５ 。尤其近年 Ｈ Ｉｅａ ．ｋｄ 等完成了阿维链霉菌全基因组 的测序工作 ， Ｊ这些不仅有利于人们 了解这一重 要抗生素和类似抗生素的合成机制 ， 利用基 因工程产生杂合抗生素 ， 更利于从全局对菌种进行改 良， 利于工 业生产 。基于上述研究基础 ， Ｓ ａｅ ｅｔ ｉ 有 目的的进行遗传操作（ 日 对 ．ｖｒ ｃｎ ｓ ｍ ｉｕ 在 本发现的 Ｓ ａｅ ｅｔ ｉ 至今 ．ｖｒ ｃｎ ｓ ｍ ｉｕ 仍 为产 生阿维 菌 素 的唯一 菌种 ） 使 阿维菌 素产 量提 高 ， ， 工艺 简 化 ， 生新 的 有 活性 的抗 生素 具有 重 大意 义 。 产 本文结合 自己的研究课题 ， 主要对阿维菌素近年来的研究进展进行综述 ， 旨在为阿维菌素和类似抗生素产生 菌 的改造 和应 用提 供思 路 、 策略 。
Ｖ０ ． ． 】２１ Ｎｏ ４
Ａ ｒ ，０ ７ ｐ．２０
阿维 菌素 生物 合成 及 其 代 谢 途 径 研 究 进 展
梁剑 光 ， 黄 鹏 徐正 军 ，
（． １ 常熟理工学院 生物与食品工程系 ， 江苏 常熟 ２ ５０ ； １５０ ２ 华 东理 工大学 生物 反应 器工 程 国家重点 实验 室 ， ． 上海 ２ ０ ３ ； ０ ２ ７
常熟理 工学 院 学报 （ 自然科 学版 ）
２０ ０ ７正
１ 阿维菌素的菌种选育与分子研究
１ １ 阿维菌素 菌种 选育 ．
阿维菌 素 （ｖｒ ｃｉ） ａｅｍｅｔ 产生 菌 １７ 在 日本 发现 后 ， 日本 北里 （ ｉｓｔ） ｎ ９ ８年 以 Ｋｔ ａｏ 大学 和北 里研 究 所 以及 美 国 ａ Ｍｅｃ 司为 主的研 究小组 分别 对它 进行 了深人 的研 究 ， 对 阿维 菌素产 生 菌进 行 了大 量 的改 造 ， ｒｋ公 并 为阿 维菌 素工业 生产 奠定 了 良好 的基 础 。最初分 离 到 的阿 维菌 素 产生 菌 的产量 很 低 ， 原始 菌 株 ＭＡ一４８ ６０的发 酵单 位只有 ９ ｍ 。通过 多 年的 菌种选育 ， 量得 到 了大 幅 度 的提 高 ， ｌ 产 目前最 高 产量 每 毫升 已达 上万 单 位 。 目 前 对多 种链霉 菌 的研究表 明 ， 多调 控 因子参 与 了复杂 的调控 网络 ， 响链 霉 菌 的表 型分 化 和次级代 谢产 物 许 影 的产量 。宋渊 等 利 用高 频 电子流 和亚硝 基弧对 阿维 链霉 菌 诱 变 ， 得诱 变后 选 育 的菌 株 的发 酵单 位 高达 使 ３０ ４０ ｔ／ ｌ产量 提高 了 ２倍 。任超 等 Ｊ０５年 了解 了阿维 菌素产 生茵生 长特性 ， 高产 生茵 Ｂ组 份 ５０— ０ ０ ｇｍ ， ｘ ２０ 提 的产量 ， 采用紫外 线 （ Ｖ）诱变 荆氯化 锂 （ ｉＩ ， ｕ 、 ＬＣ ） 亚硝基 胍 （ Ｔ 并 结合 甲硫 氨 酸 （ ｔ诱 导 等手段 对 出发 Ｎ Ｇ） Ｍｅ） 菌株 Ｓ ａｅ ｔｉＨ ０５进行 诱 变处理 ， 果筛选 获 得 总效 价 达 到 ４２ ． ｉ ／ ｌ ．ｖｒ ｉｓ ０６ ｍｉｌ 结 ５４ ３ｘ ｍ 的高 产阿 维 茵突 变 株 Ｎ ｇ ３— １３ 其 中 Ｂ组分 含量显 著提 高且 高达 ８ ．％ ， １ ３， ５３ Ｂ ａ也显 著提 高达 到 ２３ ． 得 阿维茵 素总效 价及 Ｂ 组 分显 著提 高 的菌株 。２０ １ ０ ６年 。又通过 离 子 注入诱 变 、 紫外 线 与 氯化 锂 复合 诱变 法处理 阿维链 霉菌 出发 菌株 Ｎ ５９ 筛选 获得 Ａ ｅｍｅｔ ｓ ２２ ， ｖｒ ｃｉ 高效 突变菌 株 Ａ ３２ ， ｎ ２０ ６ 总效价 达 到 ６ ８ ．ｔ ／ ｌ ９ ８２ｘ ｍ ， ｇ Ｂ ａ含量达 到 ７ ．％ ， 出发 菌株 Ｎ ５９的 Ｂ ａ组提 高 ４ ． ％ 。攸 德伟 等 ¨ ｌ ９４ 较 ２２ １ ６３ 。经 过 紫外 线 和亚 硝 基胍 对 初 始菌 株 的孢 子 的诱 变及 对其 原生质 体 的诱变 再生 ， 并且 经过 异亮 氨酸 和链霉 素 的定 向筛 选 ， 得到 的高 产菌
阿维菌素高产菌株的选育及发酵条件优化的研究
阿维菌素高产菌株的选育及发酵条件优化的研究阿维菌素高产菌株的选育及发酵条件优化的研究引言：阿维菌素是一种广谱抗生素，对多种细菌具有很强的杀菌活性，尤其对耐药菌株具有较好的抑制作用。
因此，阿维菌素在医药领域具有重要的应用价值。
为了提高阿维菌素的生产效率，本研究旨在通过选育高产菌株，并优化发酵条件，以达到提高阿维菌素产量的目标。
一、阿维菌素高产菌株的选育1. 样品收集与菌株筛选我们从不同环境中收集了多个阿维菌素微生物样品，并构建了菌株库。
通过筛选和鉴定，最终选择出了一株具有潜在高产阿维菌素能力的菌株。
2. 菌株的遗传改良针对选择的菌株，我们采用了多种遗传改良技术，如诱变、基因重组等手段，通过对菌株遗传物质的改变，进一步提高其产阿维菌素的能力。
3. 高产菌株的鉴定经过遗传改良的菌株，通过发酵培养和阿维菌素含量的检测，最终确定了一株阿维菌素产量较高的菌株。
二、发酵条件优化1. 培养基成分的优化通过对培养基成分的改良，如碳源、氮源、有机酸、激素等的添加，以及pH值和温度的调节，我们逐步找到了适合高产阿维菌素的发酵培养基配方。
2. 发酵工艺参数的调整在阿维菌素高产菌株的培养条件下，我们对发酵工艺参数进行了优化。
包括培养时间、接种量、曝气量等参数的调整，进一步提高了阿维菌素的产量。
3. 发酵过程监控与控制通过对发酵过程的监控，我们调整了关键参数的控制策略，提高了阿维菌素的生产效率。
同时，对发酵液中的酸碱度、溶氧量、反应温度等进行实时监测，确保了发酵过程的稳定性。
三、结果与讨论经过选育和发酵条件优化，我们成功获得了一株阿维菌素高产菌株，并在优化的发酵条件下获得了较高的阿维菌素产量。
与对照组相比，该菌株的阿维菌素产量提高了20%。
同时，通过监控和调控发酵过程，提高了阿维菌素的生产效率和稳定性。
结论：该研究通过选育高产菌株和优化发酵条件，成功提高了阿维菌素的生产效率和产量。
这为阿维菌素的大规模生产提供了技术支持。
本研究的成果对于阿维菌素在医药领域的应用具有重要的实际意义通过对培养基成分的优化、发酵工艺参数的调整以及发酵过程的监控与控制，本研究成功获得了一株阿维菌素高产菌株，并在优化的发酵条件下获得了较高的阿维菌素产量。
阿维菌素的生物合成研究进展与展望
第17卷 第3期 2007年3月阿维菌素的生物合成研究进展与展望3陈 芝 宋 渊 文 莹 李季伦33中国农业大学生物学院微生物系,北京100094 2006207219收稿,2006208218收修改稿 3国家重点基础研究发展计划资助项目(批准号:2003CB114205) 33通信作者,E 2mail :lijilun @摘要 阿维链霉菌(S t re ptom yces avermitilis )由于可以产生杀虫抗生素———阿维菌素而备受研究者的青睐.多年来该菌得到了全面系统的研究,其基因组序列也已测定.文中综述了阿维链霉菌中阿维菌素生物合成代谢途径方面的研究,并对后续研究进行展望.关键词 阿维链霉菌 阿维菌素 次级代谢 生物合成 基因工程 组合生物合成1 阿维链霉菌及其基因组信息阿维菌素的产生菌———阿维链霉菌(S t re pto 2m yces avermitilis )是1975年日本北里研究所从日本静岗县的一个土壤样品中分离得到的.阿维链霉菌自发现以来,以日本北里大学和北里研究所以及美国Merk 公司为主的研究小组分别对它开展了深入研究,形成了一个重要的抗生素研究领域.与其他链霉菌一样,阿维链霉菌不仅具有复杂的形态分化,也具有合成多种次级代谢产物的能力,由它产生的阿维菌素在医药、农业及畜牧业上有着重要的商业价值.目前对阿维链霉菌的研究主要集中在阿维菌素的生物合成领域[1—5].链霉菌中天蓝色链霉菌(S t re ptom yces coelicol 2or )A3(2)[6]、阿维链霉菌MA 24680[7]和S t re pto 2m yces di versa 的基因组序列已被测定,此外还有一些链霉菌(S.noursei ,S.ambof aciens ,S.peuceti us 和S.scabies )的基因组正在测定中(http :// /search.cgi ).对它们的基因组序列的比较将为这些微生物的研究提供有价值的信息.阿维链霉菌的线状染色体大小为9025608bp ,G +C 含量为70.7%,至少包含7577个开放阅读框(ORF ),编码区占基因组的86.2%.ORF 平均大小为1034bp.阿维链霉菌还含有一个线性质粒SA P1,大小为94287bp ,G +C 含量为69.2%,含有96个ORF ,编码区占质粒的79.0%.在阿维链霉菌的基因组中,大多数必需基因都位于一个高度保守的6.5Mb 的内部区域.染色体上靠近端粒的位置有两个保守性低的亚端粒区(subtelomeric re 2gions ).有趣的是,50%以上的与次级代谢合成有关的基因(包括阿维菌素的生物合成基因)都位于亚端粒区,而在亚端粒区没有发现已知的必需基因.此外,亚端粒区含有基因组中大部分的转座因子[7].这些基因位于亚端粒区可能与阿维链霉菌的遗传不稳定性有关,在对阿维链霉菌培养过程中我们经常得到一些形态分化的突变株(光秃型突变株和白色突变株等),有些突变株同时丧失了合成阿维菌素的能力.在阿维链霉菌的线状染色体上有30个基因簇与次级代谢合成有关,共有271个基因,占基因组的6.6%.它们广泛地分布于染色体上,但有一半位于染色体的末端.在质粒SA P1上没有发现与次级代谢有关的基因簇[7,8].在30个与次级代谢有关的基因簇中,有4个与黑色素的合成有关,其中两个负责酪氨酸酶及其辅酶的合成,另外两个分别与由尿黑酸生成的赭色色素和聚酮结构的黑色素的合成有关;合成类胡萝卜素和铁载体的基因簇分别由7个和5个基因组成;此外,有8个基因簇与非核092糖体肽类化合物的合成有关,还有4个基因簇与萜类化合物的合成有关.在30个次级代谢的基因簇中,有9个基因簇含有Ⅰ型P KS基因(polyketide synt hase),2个基因簇含有Ⅱ型P KS基因.目前已有3个Ⅰ型P KS合成的化合物被鉴定,它们分别是阿维菌素、寡霉素以及菲律宾菌素(filipin)的衍生物—pentaene[8].阿维链霉菌和其他链霉菌的基因组计划必将极大地推动对链霉菌形态分化和次级代谢的研究,最终揭示链霉菌复杂的调控网络.2 阿维菌素的生物合成基因簇阿维菌素是由阿维链霉菌产生的一组结构相似的十六元环大环内酯类抗生素.阿维菌素的天然发酵产物共有8个组分:A1a,A1b,A2a,A2b,B1a, B1b,B2a和B2b,它们的区别主要在于C25,C222, 23和C226位所连接的基团不同(图1).Cane等通过在阿维菌素合成过程中掺入相应的13C标记的化合物,表明阿维菌素的大环内酯是由7个乙酸盐, 5个丙酸盐和1个带有支链的脂肪酸首尾聚合而成[9].“a”组分的22甲基丁酰基(C252C28)和“b”组分的异丁酰基(C252C27)分别由L2异亮氨酸和L2缬氨酸衍生而成[10].齐墩果糖由葡萄糖直接转化而来[11].阿维菌素中C25,C23′和C23″位上的甲氧基均来自L2甲硫氨酸.图1 阿维菌素及伊维菌素结构图 Ikeda等利用标记底物结合分析突变株累积中间产物的策略,已基本阐明阿维菌素生物合成的全过程[1],并对阿维菌素合成的全基因簇序列进行了功能分析[2].该基因簇全长82kb,共有18个开放阅读框(图2).基因簇内部的60kb片段含有4个大的阅读框(aveA12aveA2)和(aveA32aveA4),共同编码多功能的P KS,该聚酮合酶由12个模块组成,共有55个活性位点,负责1个支链脂肪酸、7个乙酸盐和5个丙酸盐的聚合反应.每个合酶单位(SU)都由缩合酶(KS)2酰基转移酶(A T)2酰基载体蛋白(ACP)组成,有些SU还含有酮基还原酶(KR)和脱水酶(D H)活性位点.每个SU负责一步掺入前体如乙酸或丙酸的聚合反应及β2酮基的还原程度,最后所形成的聚酮体在位于P KS末端的硫酯酶(TE)的作用下成环内酯化.aveC和ave E基因位于aveA12 aveA2和aveA32aveA4基因之间,与聚酮体的修饰192 第17卷 第3期 2007年3月有关[12];在基因簇的右侧邻近aveA4基因的上游,是一套涉及合成和转移齐墩果二糖的8个基因(aveB I —aveB V I I I );紧邻aveA1的上游(左方)是编码C52O 2甲基转移酶的aveD 基因,该基因负责将甲基转给阿维菌素B 的C 25位的2O H 从而形成阿维菌素A.ave F 紧邻aveD 的下游,两者转录方向一致,可能属于同一转录单位[1].ave F 编码C52酮基还原酶,催化C 25位的酮基还原成羟基.aveR 位于ave F 的下游(但转录方向相反),它可能是阿维菌素生物合成全基因簇的正调控基因[2].aveR 突变株不能合成任何阿维菌素,也不能转化阿维菌素糖苷配基,对该基因序列分析表明具有H 2T 2H 结构,但是aveR 如何调控阿维菌素生物合成有待于进一步研究.图2 阿维菌素生物合成基因簇[2]3 阿维链霉菌的基因工程改造阿维菌素的生物合成途径已基本阐明,相关合成基因已被克隆和测序,阿维链霉菌的基因组序列也已清楚.这为利用基因工程手段改造阿维菌素生物合成基因簇从而对发酵产物进行有效的控制,以及合成新的阿维菌素衍生物及提高阿维菌素的产量提供了可能.目前对阿维链霉菌中代谢途径的改造主要集中在以下几个方面.3.1 菌株高产性能的提高阿维菌素是重要的杀虫抗生素,提高阿维菌素的产量具有重要的意义.在链霉菌中,次级代谢产物的生物合成是一个复杂的过程,受到不同水平的调控[13].抗生素的生物合成除受途径专一调节基因(pat hway 2specific regulatory gene )控制之外[14],还受多效调控基因(pleiot ropic regulatory genes )的控制,如abaA ,abaB ,af sQ1和af sQ2等[15],其次还受到其他调控因子,如pp G pp ,A 因子和磷酸盐等的调控[16—18].Lee 等利用Sout hern 杂交在阿维链霉菌中检测到了与S.livi d ans 中af s R2基因的同源基因,将多拷贝的af s R2基因分别转入阿维链霉菌野生型菌株和高产菌株中,阿维菌素的生物合成分别提高了2.3倍和1.5倍[19].Hwang 等曾直接将一段包含编码膜蛋白or f X 的克隆片段(8.10kb )转入野生型阿维链霉菌,刺激了阿维菌素的生物合成,可使阿维菌素的合成提高近3.5倍[20].对位于aveR 基因上游的aveR1,aveR2基因进行全部或部分缺失,可使阿维菌素的产量提高3倍多[21].王晓芳等[22]对阿维链霉菌野生型菌株和高产菌株中aveR1,aveR2基因分别进行基因缺失,野生型菌株阿维菌素的合成提高了3倍多,但高产菌株产量基本没有提高,可能是高产菌株经历了多次的诱变,其调节基因可能发生了改变.这些结果表明虽然常规诱变育种是菌种选育的有效手段,但是利用基因工程手段也有可能进一步提高菌株的生产能力.Xiong 等利用PCR 介导的基因中断技术对bk d F 基因进行阻断,获得的突变株不再合成阿维菌素,只产生寡霉素,而且寡霉素的产量由原来的0.1mg/mL 提高到2.3mg/mL [23].这可能是由于阿维菌素和寡霉素都具有聚酮体结构,拥有共同的底物,阿维菌素合成被阻断导致了代谢流流向了寡霉素的合成.292 第17卷 第3期 2007年3月3.2 菌株发酵性能的提高阿维菌素的发酵是一个好氧的生物过程,一般对氧的需求比较敏感.由于氧在水中的低溶解性,在大规模深层发酵中,溶氧常成限制因素.文莹等通过将透明颤菌血红蛋白(V Hb)基因置于硫链丝菌素诱导的启动子Pti pA之下,转入阿维链霉菌,经摇瓶实验证实,表达的V Hb蛋白在氧限条件下会明显促进阿维链霉菌的生长和阿维菌素的合成,而且在发酵液中溶氧状况越差,V Hb蛋白的效果越显著[24].3.3 无效组分及有毒产物合成的阻断Ikeda小组阐明了阿维菌素的生物合成途径,在明确阿维菌素生物合成途径的基础上,结合传统诱变构建了一系列仅产有效组分的基因工程菌株.经传统诱变获得了仅产4个“B”组分的突变株K2034(aveD)和仅产4个“a”组分的突变株K2021 (X)[10],前者是aveD基因(负责编码将B组分转化为A组分的C52O2甲基转移酶)发生了突变,使得菌株只能累积B组分[25];后者是X基因发生了突变.目前X基因尚未得到克隆,但不位于阿维菌素生物合成基因簇中,此基因的突变导致突变株只能合成仅产“a”组分的阿维菌素,推测这个基因可能为支链氨基酸脱氢酶.对这两株突变株进行原生质体融合,得到了仅产B1a和B2a两个组分的重组菌株K2038(aveD X)[10].再对重组菌株K2038内的aveC基因进行点突变,得到仅产单一组分B2a 的基因工程菌K2099(aveD X aveC)[1].阿维链霉菌不仅产生阿维菌素,还产生寡霉素.寡霉素是哺乳动物氧化磷酸化的抑制剂,对哺乳动物有很高的毒性.Ikeda等用Tn4560对阿维链霉菌进行转座诱变得到不产寡霉素的突变株,利用转座子上的遗传标记将寡霉素的生物合成基因克隆到温敏质粒上,对上述所构建的有效组分的基因工程菌进行基因取代,得到不产寡霉素仅产阿维菌素有效组分的基因工程菌[1].我们实验室自20世纪90年代以来开展了对阿维菌素合成的研究,初期主要利用常规诱变手段提高阿维菌素产量,近年来也开展了对阿维链霉菌的基因工程改造.通过对aveD基因的插入失活,阻断了C52O2甲基转移酶的合成,与aveD共转录的ave F的表达也被阻断,因此获得了直接合成C52O2阿维菌素B的基因工程菌[26].C52O2阿维菌素B可直接在C25位进行肟基化合成具有更高杀虫活性的阿维菌素52肟衍生物.此外,通过对aveD基因进行缺失突变,得到了仅产阿维菌素B组分的基因工程菌[27].在此基础上,张晓琳等通过同源双交换的方法将上述仅产阿维菌素B组分的基因工程菌染色体上长达90kb的寡霉素聚酮合酶基因簇(ol mA)进行了缺失,得到不产寡霉素而仅产阿维菌素B组分的基因工程菌[28].3.4 组合生物合成阿维菌素的大环内酯结构属于聚酮体,由阿维菌素P KS(AV ES)催化形成.阿维菌素B1和B2的区别在于C222,23位不同,B1在C222,23位是CH=C H,而B2在C222,23位为CH22CHO H.根据聚酮体合成反应步骤与其P KS基因结构之间的一一对应关系,阿维菌素C222,23位的还原程度由AV ES1模块2上的还原酶域D H和KR(D H22 KR2)决定.KR2将C223位的β2酮基还原成羟基后,在D H2的作用下脱水形成双键,最后的产物即为B1组分;如果D H不起作用,则最终形成的产物C223位保持羟基即为B2组分,因此推测B1组分和B2组分的共存可能是由于D H2的不完全活性所造成.将阿维菌素P KS模块2上的不完全活性的D H用完全活性的D H取代,仍有B2组分的合成.伊维菌素是阿维菌素B1在C222,23双氢还原物(图1),与阿维菌素B1相比,具有相同的杀虫活性,而毒性更低,因而被广泛应用于畜牧业上. Gaisser等用rapamycin P KS中模块13上的D H2ER (enoyl reductase烯基还原酶)2KR取代野生型阿维链霉菌中阿维菌素P KS模块2上的D H2KR结构域,获得的重组菌株具有直接合成C222,23双氢阿维菌素B1(即伊维菌素)和A1的能力,除产生以上组分外,该菌株同时还产生阿维菌素的8个组分[29].张晓琳以阿维链霉菌仅产B组分不产寡霉素的基因工程菌Olm73212为出发菌株,将其阿维菌素P KS模块2上的D H和KR结构域用来自于pik2 romycin P KS模块4中一套完整的D H2ER2KR所置换,得到不产寡霉素而产伊维菌素B1a的基因工程菌[30].392 第17卷 第3期 2007年3月3.5 阿维菌素衍生物的产生Doramectin是阿维菌素B1的cyclohexane2car2 boxylic acid(C HC)前体异构物,与伊维菌素相比,生物半衰期更长,杀虫效果更好.Cropp等将S.colli us中的C HC2CoA合成基因转入阿维链霉菌的阿维菌素的前体合成阻断突变株中,使得突变株获得了合成Doramectin的能力[31].该突变株发酵产生Doramectin的同时还产生无效的C HC2B2组分,aveC编码产物控制Doramectin与CHC2B2的比例.St utzman2Engwall等通过定点诱变和易错PCR在aveC基因中引入随机突变,获得了几株CHC2B1比例提高的突变株,其中一株CHC2B1的比例提高了4倍[32].他们又通过DNA重排(DNA shuffling)技术对aveC进行突变,将重排后的aveC 突变文库转化到阿维链霉菌中,得到几个产Dor2 amectin比例较高的转化菌株.对这些菌株中的aveC基因进行分析发现,最有效的突变aveC中有10个氨基酸发生了突变,所产CHC2B2∶CHC2B1的比例为0.07∶1,此比例与野生型菌株相比提高了23倍[33].甲胺基阿维菌素(emamectin benzoate,即M K2 244)与阿维菌素相比具有更高的杀虫活性,在农业上得到广泛应用.在化学合成上,4″2氧2阿维菌素(4″2oxo2avermectin)是由阿维菌素合成甲胺基阿维菌素的中间体,由于阿维菌素两个羟基的存在,必须在氧化前后对于其进行保护,使得生产成本大大提高.来自杀结核链霉菌(S.t uberci dicus)R2922的细胞色素P450单加氧酶Ema1能够选择性地催化阿维菌素形成4″2氧2阿维菌素[34].通过在阿维链霉菌中表达em a1,试图得到一步法合成4″2氧2阿维菌素的菌株.但只有生长初期的菌丝能够合成4″2氧2阿维菌素,处于稳定期的菌株则不能[35].而阿维菌素的合成主要在稳定期合成,这可能是所用启动子在稳定期时不易表达,而换成稳定期表达的启动子效果可能会好些.4 展望阿维链霉菌自发现以来已有30a的时间,对于它的研究主要集中在阿维菌素的生物合成领域.提高阿维菌素的产量、选择性地合成活性组分和产生有生物活性的阿维菌素衍生物及新代谢物一直是研究的热点.随着阿维链霉菌和其他链霉菌序列的测定,研究的重心将进一步拓展到次级代谢物产生的调控和形态分化调控方面,以揭示链霉菌复杂的调控网络.功能基因组研究还可以进一步了解链霉菌染色体复制及其稳定性,在提高工业菌株的遗传稳定性方面意义重大.阿维链霉菌中阿维菌素和寡霉素基因簇中聚酮生物合成编控的分子机理的阐明和阿维链霉菌基因组序列的完成将为利用组合生物合成改造阿维链霉菌,形成一系列非天然的天然性化合物提供可能,在药物创新方面将有可能取得一系列突破.就目前而言,组合生物合成面临的最大障碍就是改造后的P KS合成的新代谢物产量太低.大多数情况下,杂合P KS合成新化合物的产量仅是野生型菌株原来抗生素产量的1%—50%,甚至更低[36].目前也有一些提高产量的途径:如增加P KS拷贝数或使用强启动子可使产量提高;将结构类似的聚酮化合物的P KS单元进行组合,由于它们生物合成的中间体结构相似,来自不同P KS的模块和结构域在功能上可以彼此互补,从而使杂合P KS具有较高的活性;通过替换整个模块或蛋白亚单位而不是单个酶域可以使产量提高100倍以上[37].目前构建的可直接合成伊维菌素的基因工程菌由于产量太低而无法应用于工业生产.如能利用阿维菌素结构类似物Milbemy2 cins或Melingmycins(它们在大环内酯的C22,23位为C H22C H2)的P KS基因对阿维菌素P KS的模块2进行整个置换有可能提高杂合P KS的活性,进而提高伊维菌素的产量.此外,虽然阿维菌素的生物合成途径已经基本阐明,但是阿维菌素的生物合成调控途径和一些关键步骤还不清楚,基因簇中aveR和aveC的基因功能还不确定.推测aveR基因可能是阿维菌素的调控基因,但是aveR基因如何调控阿维菌素的生物合成还不清楚,有待于进一步研究.阿维菌素合成过程中决定阿维菌素B1∶B2的比例的机制仍然不清楚.阿维菌素B1和B2组分的分化发生在阿维菌素的合成初期,但实验证实阿维菌素P KS模块2上的负责C22223位脱水的脱水酶并不能决定B2∶B1的比例.目前的实验结果表明aveC可能决定阿维菌素B2∶B1的比例[1,32,33],但其机制仍然不清楚,如AveC是如何催化C22223的脱水;是与阿维菌素492 第17卷 第3期 2007年3月P KS一起共同完成的,还是在阿维菌素糖苷配体形成之后等.由于阿维菌素B1具有最高的杀虫活性,如能仅发酵生产B1组分,将大大地简化生产和提取工艺,阿维菌素的生产成本也将降低.因此,研究阿维链霉菌中aveC基因的功能,阐明决定阿维菌素B2∶B1比例的机制,将为理性设计实验提高阿维菌素中有用组分B1的含量提供理论基础.参 考 文 献1 Ikeda H,6mura S.Control of avermectin biosynt hesis in S t rep2 tom yces avermitilis for t he selective production of a useful com2 ponent.J Antibiot,1995,48(7):549—5622 Ikeda H,Nonomiya T,Usami M,et anization of t he bio2 synt hetic gene cluster for t he polyketide ant helmintic macrolide avermectin in S t reptom yces avermitilis.Proc Natl Acad Sci USA,1999,96(17):9509—95143 Ikeda H,Nonomiya T,6mura 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阿维菌素生产工艺研究进展
2019年09月阿维菌素生产工艺研究进展侯东伟郭佳于荣张智圣（宁夏泰益欣生物科技有限公司，宁夏银川750205）摘要：阿维菌素是我国截止到目前为止最有效的消灭动植物寄生虫的抗生素之一，针对该药物高产菌株的培养和发酵培养基的优化以及产品的分离纯化实施了详细的探究，以下会准确的分析出该药物的前景和具体功效。
关键词：阿维菌素；生产工艺；研究进展阿维菌素是一种大环内酯抗生素类杀虫以及杀螨剂，而且是土壤微生物灰色链霉菌素的发酵代谢产物。
自从1975年以来，日本某个研究所从一个市里的土壤样本当中分离得到了菌株，经过初期的研究得知，该菌株的发酵液是可以很快驱除肠道内的寄生虫。
并且该药物也可以有效的防止鞘翅目和鳞翅目害虫及多种害螨对人体健康产生的伤害，特别是针对常见的农药等具备有效的抗药性效果。
近些年来通过仔细研究得知，阿维菌素药物可以提升肿瘤细胞对待药物的灵敏性，简单来讲就是可以起到抗癌的效果，在1985年阿维菌素药物被当做农药放入到市场中，进而出现各种研究话题。
阿维菌素制剂产量每年都在不断增加，在我国微生物农药中每年产值排名第一的药物也是阿维菌素制剂。
国外许多国家都进一步深入研究分析遗产学。
我国对这方面的研究主要包括该药物的改造和研发等。
1阿维菌素的杀虫原理1991年，Arena 研究学者曾经报道阿维菌素抗生素的杀虫原理是：将阿维菌素和靶虫细胞的特异性高亲和位点进行有机结合，容易影响细胞膜对氯离子产生的通透性，让氯离子距离，进而造成线虫的神经细胞增多，GABA 在突触前神经末梢的作用下，能够让兴奋性递质的释放下降，让突触后膜出现兴奋性突触后电位变弱，突触后神经元因膜电位的去极化与规范值不相符，而无法达到一种兴奋的状况，这样就容易导致虫体出现死亡或者麻痹的情况，以获得显著的杀虫效果。
2我国阿维菌素的生产现状自从20世纪80年代我国从其他国家引进阿维菌素链霉菌以来，国内很多大学都深入研究了阿维菌素链霉素的诱变以及提取精致工艺改善等。
阿维菌素生产工艺研究进展
在农业领域，阿维菌素被广泛用作杀虫剂和杀螨剂。其杀虫作用主要是通过干扰虫体的神经传导，导致虫体麻 痹并死亡。此外，阿维菌素还可以破坏昆虫的生殖器官，降低繁殖能力。杀螨作用主要是通过抑制螨类卵的孵 化，控制螨类数量。
阿维菌素的发现及发展历程
发现背景
阿维菌素的发现源于对土壤中放线菌的研究。研究者从土壤中分离出一种名为Streptomyces avermitilis的放线菌，这种菌能产生一种抗菌物质。
物理性质
阿维菌素为白色至黄白色结晶粉末，无味，不溶于水，可溶于有机溶剂，微 溶于脂肪和烃类。对光、热、湿度和氧气敏感，需在阴凉干燥处保存。
阿维菌素的用途
医疗领域
阿维菌素在医疗领域主要用于治疗人类和动物的寄生虫感染，如蛔虫病、钩虫病、丝虫病等。其作用机制是通 过抑制寄生虫神经递质的释放，干扰虫体的活动，使其麻痹并最终死亡。
通过改进半合成工艺中的反应条件和原料选 择等环节，提高阿维菌素的合成效率和产量 。
探索新半合成路线
研究阿维菌素的半合成途径，寻找更高效、环保的 半合成路线，降低生产成本。
半合成工艺与全合成工艺 的比较
比较半合成工艺与全合成工艺的优缺点，为 阿维菌素的生产工艺选择提供参考。
05
阿维菌素生产工艺实际应用及效果
产物纯化
通过结晶、萃取等方法对得到的阿维菌素进行纯 化，得到高纯度的阿维菌素产品。
03
阿维菌素生产工艺研究现状
发酵工艺研究现状
微生物发酵法是阿维菌素的主要生产方法之一，通过选择合适的菌种、优化发酵 条件和提高产物提取效率等手段提高阿维菌素的产量和纯度。
近年来，研究者通过基因工程技术对微生物进行改造，提高其产阿维菌素的能力 ，取得了一定的成果。
阿维菌素高产有效组分基因工程菌的构建
阿维菌素高产有效组分基因工程菌的构建
阿维菌素是一种广谱抗生素，具有良好的抗菌活性，对多种革兰氏阳性和革兰氏阴性菌都具有一定的抗菌效果。
由于其天然产量有限，因此进行阿维菌素高产有效组分基因工程菌的构建成为了一项重要的研究。
阿维菌素的生物合成途径已经被揭示出来，其中包含了多个关键酶催化的反应步骤。
通过对阿维菌素生物合成途径的深入研究，可以发现其中的瓶颈反应，从而对阿维菌素高产有效组分基因工程菌的构建提供指导。
基于生物合成途径的研究，可以通过引入限速酶基因或者调控阿维菌素生物合成途径中的调控因子基因来提高阿维菌素的产量。
以Streptomyces avermitilis为模型菌株，通过基因工程的手段，可以将相关基因导入到目标菌株中的阿维菌素生物合成途径中。
通过对编码阿维菌素生物合成途径中限速酶的基因进行扩增和克隆，构建基因工程菌。
在基因工程菌的构建过程中，选择合适的表达载体也是非常重要的。
合理的选择表达载体可以提高目标基因的表达水平，从而进一步提高阿维菌素的产量。
常用的表达载体包括质粒和噬菌体，根据不同的需求选择合适的表达载体。
在阿维菌素高产有效组分基因工程菌的构建过程中，还需要考虑到菌株的稳定性和遗传稳定性。
通过合适的抗生素选择和适当的培养条件，可以筛选出稳定性较好的基因工程菌。
除了基因工程菌的构建，进一步的筛选和提高菌株的阿维菌素产量也是非常重要的。
通过组合培养基的优化、改变发酵工艺条件等方式，可以进一步提高阿维菌素的产量。
阿维菌素高产有效组分基因工程菌的构建
阿维菌素高产有效组分基因工程菌的构建阿维菌素是一种重要的环状多肽天然产物，具有广谱的抗生素活性，特别是对革兰氏阳性菌和肺炎克雷伯菌等多种耐药菌株具有极高的抗菌活性。
阿维菌素分子结构复杂，由36个氨基酸残基和3个二硫键组成，其生物合成机制涉及多个基因编码的酶和调控因子。
因此，利用基因工程手段构建高效阿维菌素产生菌株是实现其工业化生产和更广泛应用的关键。
阿维菌素生物合成途径参与的基因包括聚合酶、芳香酸加成酶、羟基化酶、N-缩酮肽合酶、氧化还原酶等，其中阿维菌素酶(AvanA)是阿维菌素生物合成的核心酶，负责将阿维菌素的脱氢肽转化为环状结构，因此被认为是阿维菌素产生的限速步骤。
为提高阿维菌素产量和纯度，大量研究针对AvanA基因进行了改良和工程化。
构建高产有效组分基因工程菌的关键是将包括AvanA在内的复杂产物生物合成途径重新导入到适合工业化生产的菌株中，并合理设计代谢通路和营养平衡。
以大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)为代表的革兰氏阴性菌株被广泛应用于阿维菌素基因工程菌的构建中，其原因在于大肠杆菌具有较高的生长速度和易于遗传转化等优势。
1. 阿维菌素生物合成途径基因筛选与分析：基于阿维菌素生物合成途径，从产生阿维菌素的菌株中克隆和鉴定关键基因，并对其进行序列比对和生物信息学分析，以确定基因结构和功能。
2. 基因工程化：为了提高阿维菌素产量和纯度，可对关键基因进行改良和工程化，例如：增强启动子活性、调整密码子使用、重组、敲除代表色氨酸合成途径的三磷酸核苷酸亚基酶等。
3. 导入基因到表达宿主中：通过克隆表达载体和化学或电转化方法将修饰后的阿维菌素生物合成途径相关基因导入表达宿主中，并利用选择标记筛选转化成功的菌株。
4. 代谢工程化：通过调整代谢通路和营养平衡等措施，以最大化地利用宿主内源性代谢和提高阿维菌素的生产达到最优化的菌株设计。
5. 发酵过程的优化：通过监测菌株生长和代谢状态，优化发酵过程参数以进一步提高阿维菌素产量和纯度。
阿维菌素生物合成基因结构研究进展
山东畜牧兽医2019年第40卷72阿维菌素生物合成基因结构研究进展李淑焕（山东农业工程学院食品科学与工程学院山东济南250100）薄永恒*（山东省兽药质量检验所山东省畜产品质量安全监测与风险评估重点实验室山东济南）中图分类号：S852.6 文献标识码：A 文章编号：1007-1733(2019)07-0072-03寄生虫病是动物常见的疾病，对畜牧养殖造成比较大危害。
每年，寄生虫感染动物从而造成的社会损失超过30多亿美元。
从Fleming发现青霉素到现在，人们已经发现39000多种不同作用的抗生素。
杀伤各种寄生虫的抗生素却不是很多，其中大多数是作用于真菌和细菌的。
可以杀死寄生虫的抗生素也就只有十几种，因为寄生虫和宿主之间对抗生素敏感性一般差别小，在实际应用方面效果比较差。
一般一种抗生素只能杀死一种或几种寄生虫，他们的抗虫谱也比较窄。
阿维菌素是由阿维链霉菌分泌出的一种次级代谢产物，是迄今为止发现最有效的生物杀死寄生虫的药物，是农业部推荐的一种的高效低毒的兽用药品，具有良好的应用价值和广阔的市场前景。
目前，阿维链霉菌育种技术主要有自然选育、诱变育种、基因重组、代谢控制育种、基因工程育种等方法。
本文主要从阿维菌素生物合成关键调控基因的研究进行探讨，为后期基因工程育种打造理论基础。
1 阿维菌素生物合成基因结构组成（1）已知许多抗生素生物合成基因都是成簇排列的，阿维链霉菌也是如此。
阿维链霉菌生物合成基因簇大约有90kb，这一部分是阿维链霉菌生物合成的关键点，其间82kb的连续区域被测通，从而获得的区域的结构如图2所示。
与已知的I型多功能聚酮合酶(PKS)的模块(module)结构进行比较，红霉素[1-2]、苦霉素[3]、利福霉素[4]多功能PKS的编码模块结构都比阿维链霉菌的要简单。
这个区域有18个开放阅读框(ORF)。
在转录方向上，编码利福霉素PKS的10个模块和编码红霉素PKS模块方向一致，而aveA1-aveA2和ave3-ave4两部分组成了阿维链霉菌PKS的12个编码模块，但是有6个模块与另外6个模块的转录方向是相反的。
阿维菌素高产菌的育种研究进展
阿维菌素高产菌的育种研究进展冀彦锡;吴焱鑫;李杰【摘要】Avermectin, produced by Streptomyces avermectilis,is one kind of insecticidal maorolides antibiotics and is widely used in agriculture and animal husbandry. Finally,the general situation of avermectin in recent years were summarized from three aspects, namely the breeding of strain producing specific composition, the breeding of high yielding strain and the modification of avermectins.%阿维菌素是阿维链霉菌产生的具有杀虫活性的大环内酯类抗生素,在农业和畜牧业中应用广泛.对近年来的研究概况,从产特定组分阿维菌素菌种选育、阿维菌素高产菌选育和阿维菌素的改造创新等方面进行了综述.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2011(039)018【总页数】4页(P10929-10931,10933)【关键词】阿维菌素;育种;阿维链霉菌;基因工程【作者】冀彦锡;吴焱鑫;李杰【作者单位】南京农业大学生命科学学院,江苏,南京,210095;南京农业大学生命科学学院,江苏,南京,210095;南京农业大学生命科学学院,江苏,南京,210095【正文语种】中文【中图分类】S132自1981年阿维菌素及其系列产品伊维菌素、多拉菌素作为兽药和农药上市以来，世界各国研究人员都认为它的发现及应用是继青霉素以来抗生素科学对人类的又一巨大贡献，并认定阿维菌素对全世界的农牧业生产发挥了巨大作用。
阿维菌素的生物合成及代谢工程研究进展
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文章编号 !*;;+1;;;0?0;;.@;21;44,1;4
综
述
阿维菌素的生物合成及代谢工程研究进展
田靖， 张惟材
军事医学科学院 生物工程研究所， 北京 *;;;,* ［摘要 ］ 阿 维 菌 素 （!"#$%#&’() ） 是由除虫链霉菌 （!"#$%"&’()$* +,$#’-"-.-* ） 产生的一种具有杀虫活性的大环内酯类抗生素， 在农业和畜牧业中应用广泛。本文综述了有关除虫链霉菌基因组序列分析、 阿维菌素的生物合成以及阿维菌素育种和代谢 工程的研究进展。 ［关键词］ 除虫链霉菌； 阿维菌素； 生物合成； 代谢工程 ［中图分类号］ A3*［文献标识码］ 5
（DN% ） 。 心位置有 ;= KE 的基因片段编码聚酮合成酶 DN% 基因按 即 3B/$ <C3B/$ = 区和 3B/$ +C3B/$ ’ 区， 照读框可以分为 9 个区， 每区为含有 ; 个模件的重复单元， 且它们的翻译方向相反。 > 个 负 责 编 码 29 组 较大的读框 （B."%2 、 B."%9 、 B."%4 和 B."%> ） 具有酶活性的模件， 每一组模件都催化 2 轮聚酮链的延伸。在这 个大的多功能酶复合体中， 含有 == 个 与 脂 肪 酸 合 成 相 关 的 活 性 位点， 负责聚合反应 *C* 键形成的活性位点有 4 个， 即酰基转移 、 酰基载体蛋白 （B*D） 和 "C 酮酯 酰 合 成 酶 （N% ） 。经此结 酶 （B#） 构域催化的酮酯化合物再由烯酰还原酶 （"$ ） 、 酮基还原酶 （N$ ） 还 原 加 工 。 在 B."%> 的 * 端 有 2 个 具 有 硫 脂 酶 或脱水酶 （M+ ） 活性的结构域， 负责将合成完整的多聚酮链从 DN% 上释放出来， 以形成内酯环。 阿维菌素糖苷配基是在起始单元上按照 DCBCBCBCBCDCDC
阿维菌素的研究进展
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阿维菌素在不同pH缓冲液中的水解(25℃)
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此后该菌株被送到美国Merck（默克）公司进一步研究， 1976年Merck公司分离出一组具有驱虫活性的物质，并将它 命名为Avermactin，中文名阿维菌素。
随着研究的深入，菌株的发酵单位从9mg/L提高到具有商
业价值的500mg/L，1981年Avermactin作为兽药投入市场，
1985 年Avermactin作为农药投入市场。最先进的菌株发酵单
• 多拉菌素伊维菌素类产品比较, 其抗寄生虫范围更广泛、 效果更好, 而且预防寄生虫再感染的有效时间更长，是目 前世界上效果最好、最有开发潜力的兽用抗寄生虫新药。
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埃玛菌素
• 在研究多拉菌素的制备过程中发现，通过直接在阿维菌素 产生菌的发酵生产工艺中添加某些特定的羧酸或其衍生物 的方法， 就有可能获得与阿维菌素有关的新化合物，现 已探明，这些新化合物具有较高的杀寄生虫活性。
– 根据代谢产物的可能分子结构和已报道的阿维菌素降 解途径，推测生物降解产物主要来自：
A．C13位上齐墩果糖二糖基断裂，C8至C17位上的大环断裂 和C8a位上的杂环氧化；
B. C13位上齐墩果糖二糖基断裂和C1位上酯键断裂。
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阿维菌素的水解
– 浙江大学农药环境毒理研究所的研究表明
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阿维菌素高产有效组分基因工程菌的构建
阿维菌素高产有效组分基因工程菌的构建阿维菌素是一种广谱青霉素类抗生素，对多种耐药性细菌有很好的杀菌作用。
然而，阿维菌素的生产需要大量的发酵条件和时间，成本较高。
为了提高阿维菌素的产量和缩短生产周期，基因工程技术被用于筛选高产有效组分基因工程菌。
本文将介绍阿维菌素高产有效组分基因工程菌的构建过程。
阿维菌素的生产源自一种名为青霉菌属的真菌。
在阿维菌素的生产过程中，保护性培养基和适宜的温度和pH值是必不可少的。
在优化了阿维菌素的生产条件之后，研究者们尝试通过转基因技术构建高产菌株，以提高阿维菌素的产量和质量。
由于阿维菌素是一个复杂的天然产物，不同的有效组分对菌株的菌株的生长和产量均有不同的影响。
因此，在构建高产有效组分基因工程菌时，需要定位和转移不同的有效组分基因。
首先，需要识别产阿维菌素的菌株，并确定其基因组序列。
通过比对基因组序列，可以找到与阿维菌素生产相关的基因，如beta-lactamase等。
通过这些基因可以得到阿维菌素的关键酶和代谢途径，并确定有哪些基因参与了阿维菌素的合成和生产。
以阿维菌素的生产菌株Acremonium chrysogenum为例，该菌株的基因组序列已经被测序和注释，并被用于构建高产有效组分基因工程菌。
在该菌株的基因组中，特别是由欧洲分子生物学实验室（EMBL）的Martin-Parras等人研究，发现了阿维菌素合成相关的基因群。
其中，包括编码阿维菌素酸酯酶的基因，编码多肽基元酰基转移酶的基因，编码脱氧-3-酰基阿维林酸合成酶的基因等。
接下来，需要将这些有效组分基因挑选出来，并进行基因克隆和输注到其它的高产菌株中。
不同文献报告中，涉及到基因的挑选和克隆方法多种多样。
有的采用自然传播原理，通过构建自然杂交基因库，对高产株进行筛选和鉴定，确定出携带目标基因片段的自然基因组。
然后，采用PCR扩增获得目标基因片段，并通过专业的组学克隆技术打包传递到携带载体中。
还有的采用合成基因技术，将一些目标“最优”基因通过合成技术人工拼接到“载体基因组”上，并通过特殊的载体方法，使之快速整合到工程菌系中。
阿维菌素高产有效组分基因工程菌的构建
阿维菌素高产有效组分基因工程菌的构建阿维菌素是一种广泛存在于土壤中的黄赤霉菌所分泌的18-membered环内脂肽类抗生素，具有广谱抗菌活性，对多种革兰氏阳性和阴性细菌、真菌和原虫均有活性。
由于其良好的抗菌效果，阿维菌素被广泛应用于医学和农业领域。
然而，阿维菌素的生产量较低，且含量不稳定，制约了其在实际应用中的发挥。
因此，利用基因工程手段构建高效阿维菌素生产菌株，成为了缓解现有问题的关键所在。
本文介绍了阿维菌素高产有效组分基因工程菌的构建方法，主要包括基因克隆、表达载体构建、转化及筛选。
以下分别进行详细阐述。
1. 基因克隆从阿维菌素产生菌株中分离出阿维菌素的生物合成基因簇，然后通过PCR扩增得到所需的基因片段。
通常的基因片段选择包括阿维菌素前体合成基因avmB、avmC、avmD、avmE、avmF、avmG、avmH、avmI、avmJ、avmK、avmL，以及调控基因avmR、avmS、avmT等。
2. 表达载体构建将基因片段与表达载体进行连接。
常用的表达载体包括pET、pUC、pGEX等。
在构建过程中需要注意的是，合理选择启动子、信号肽、标签等元素，以使得蛋白表达量高且方便纯化。
3. 转化及筛选将表达载体转化至宿主菌中，可使用大肠杆菌等细菌作为宿主。
利用适当的筛选方法，如抗生素耐受性筛选法、荧光标记筛选法等，选出具有高阿维菌素生产能力的高效基因工程菌株。
值得注意的是，在构建高阿维菌素生产的基因工程菌株时，需要考虑法律法规等问题，避免破坏环境和人类健康。
此外，不仅仅是阿维菌素，其他抗生素的基因工程构建也需要遵守相应的规范。
总体来说，通过基因工程手段构建高效阿维菌素生产菌株，对于满足社会对高效抗生素的需求，增强我国在生物药物领域的竞争力等方面都具有重要意义。
阿维菌素高产有效组分基因工程菌的构建
阿维菌素高产有效组分基因工程菌的构建阿维菌素是一种重要的青霉素类药物，具有广谱的抗生素活性。
本文将介绍阿维菌素高产有效组分基因工程菌的构建方法。
阿维菌素的合成依赖于avilamycin基因簇，该基因簇包含了多个参与阿维菌素合成的基因。
通过基因工程的方法，可以将阿维菌素基因簇转移到其他有效生产菌中，进而实现阿维菌素的高效产量。
需要从阿维菌素产生菌中提取阿维菌素基因簇的DNA。
通常情况下，可以使用聚合酶链式反应（PCR）方法扩增得到完整的阿维菌素基因簇。
接下来，需要构建一个适合基因工程的载体。
这个载体需要包含适当的基因启动子、特异的启动子、选择性标记等。
一种常用的载体是质粒，可以通过限制性内切酶切割后与DNA片段连接。
然后，将阿维菌素基因簇克隆到载体中。
这可以通过限制性内切酶切割和连接的方式实现。
通常情况下，基因簇的每一个基因都会克隆成一个单独的DNA片段，并按照正确的顺序连接到载体中。
需要将融合载体转移到目标菌株中。
接下来，需要选择一个合适的宿主菌株。
宿主菌株应该有较高的转化效率和较强的表达能力。
一些常用的宿主菌株包括大肠杆菌、枯草杆菌等。
将融合载体转化到宿主菌株中，可以使用化学转化或电转化的方式。
转化完成后，需要对转化菌株进行筛选，以获得目标菌株。
这可以通过选择性培养基、荧光筛选等方法实现。
需要对目标菌株进行培养和发酵。
培养条件应该经过优化，以提高阿维菌素的生产效率。
通常情况下，需要对培养基的成分、pH值、温度、搅拌速率等条件进行调整。
阿维菌素高产有效组分基因工程菌的构建包括以下步骤：提取阿维菌素基因簇DNA、构建基因工程载体、将基因簇克隆到载体中、将融合载体转移至宿主菌株、筛选目标菌株、培养和发酵。
通过这些步骤，可以获得阿维菌素高产有效组分的基因工程菌，为阿维菌素的生产提供了有力的技术支持。
阿维菌素类药物残留分析技术研究进展
阿维菌素类药物残留分析技术研究进展
何继红;申屠芬琴
【期刊名称】《动物医学进展》
【年(卷),期】2009(030)005
【摘要】阿维菌素类药物是目前应用最广泛的抗寄生虫药物.作为脂溶性化合物,在动物体内的残留时间长,因而WHO将其列为高毒化合物,其动物性食品中的残留检测工作引起各国的极大关注.以荧光检测或质谱检测为主的HPLC方法和以抗体为基础的ELISA方法一直是其研究热点.将仪器分析技术的准确性和精密性与免疫分析技术的简便快捷相结合的联合技术的应用也日趋广泛.同时多残留分析技术也是其残留分析技术的发展方向.论文就阿维菌素类药物的残留分析技术进行了综述.【总页数】3页(P98-100)
【作者】何继红;申屠芬琴
【作者单位】中牧实业股份有限公司,北京,100070;北京世纪元亨科技有限公司,北京,100085
【正文语种】中文
【中图分类】S859.84
【相关文献】
1.养殖水产品中磺胺类药物的检测方法及残留分析研究进展 [J], 余丽梅;宋超;张聪;陈家长
2.水产品中氯霉素类药物残留分析方法研究进展 [J], 王淼;王艳;吴艳云;方晓燕
3.饲料和畜禽产品中阿维菌素类药物快速检测技术研究进展 [J], 倪腾腾;彭大鹏;谢书宇;陈冬梅;王玉莲;潘源虎;陶燕飞;袁宗辉
4.四环素类药物残留分析方法研究进展 [J], 杜红鸽; 郭芙蓉; 陈蔷
5.固相萃取技术在磺胺类药物残留分析中的研究进展 [J], 张艳梅; 赵晓燕; 钱珊珊; 赵志勇; 鄂恒超; 范婷婷; 李晓贝; 陈磊; 董慧; 周昌艳
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阿维菌素高产菌株的选育的开题报告
阿维菌素高产菌株的选育的开题报告
一、研究背景
阿维菌素是一种广谱抗生素，能有效治疗多种细菌感染症，包括肺炎、脑膜炎等严重疾病。
目前，阿维菌素的市场需求量逐年增加，因此
提高阿维菌素的产量和效率，成为当今研究的热点。
二、研究目的
本研究旨在从阿维菌素高产菌株的筛选开始，进一步探索阿维菌素
的产量和效率提高的途径，为阿维菌素生产提供一定的科学依据。
三、研究方法
（1）菌株的筛选：收集不同来源的阿维菌株，通过筛选有效的阿维菌素高产菌株。
（2）发酵条件的优化：根据高产菌株的特点，通过改变发酵的温度、pH值等参数，优化发酵条件使产量尽量达到最大值。
（3）分子筛选法：结合现代生物技术手段，从微生物的基因组上鉴定出编码阿维菌素生物合成途径的基因，并选用激活基因或者群体转化
策略进行干预。
四、预期结果
通过筛选，发掘出一批阿维菌素高产菌株，并通过优化发酵条件和
分子筛选干预等手段，达到最佳阿维菌素产量。
五、研究意义
本研究为阿维菌素生产提供了高效和可靠的方法，可以缩短生产周期、降低成本，同时增加阿维菌素的供应量，更好地满足社会和市场的
需求。
同时，研究方法也可以应用到其他广谱抗生素的高效生产中，对
于解决医药领域的紧迫问题具有重要意义。
阿维菌素清洁生产审核技术方法研究的开题报告
阿维菌素清洁生产审核技术方法研究的开题报告
一、研究背景
阿维菌素是一种常用的抗生素药物，具有广谱抗菌作用。
阿维菌素制剂的质量和安全性在临床应用中至关重要。
其中，对阿维菌素生产过程的审核技术方法的研究能够有效提高药品的质量和安全性，减少生产环节中的质量问题和错误率，保障患者用药的安全性和效果。
二、研究目的
本研究旨在探讨阿维菌素清洁生产审核技术方法，建立科学、规范的阿维菌素生产质量审核机制，提升阿维菌素产品的质量和安全性，保障患者的健康和安全。
三、研究内容
1. 阿维菌素生产过程分析
通过对阿维菌素的生产过程的分析和评估，制定科学、规范的生产质量审核标准，建立清洁生产的质量管控和检测体验。
2. 阿维菌素质检技术研究
以阿维菌素的生产工艺流程为基础，研究阿维菌素产品质量的检测指标和技术方法，针对阿维菌素生产厂家需要达到的质量标准开发适宜的检测方法，验证检测方法的可行性。
3. 阿维菌素生产过程的检测方法开发
根据阿维菌素生产过程的特点，研究开发生产过程中的清洁管理方法，建立可靠的质量审核体制，保证阿维菌素产品符合质量标准。
四、研究意义
本研究可以为阿维菌素生产厂家提供质量检测方法和生产监管的科学依据，提高阿维菌素产品的质量和安全性，同时提高生产厂家的信誉度，增加产品市场竞争力，使患者更加安全、有效地使用药物。
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收稿日期:20050317作者简介:刘婷婷(1981),女(汉族),黑龙江哈尔滨人,硕士研究生;阎浩林(1963),男(汉族),辽宁沈阳人,副教授,博士,硕士生导师,主要从事聚酮体化合物阿维菌素生物合成基因的研究,Tel .024********,E mail haolin yan @ 。
文章编号:10062858(2005)06046306阿维菌素产生菌的生物技术改造研究进展刘婷婷,蔡苏兰,阎浩林(沈阳药科大学制药工程学院,辽宁沈阳110016)摘要:目的综述近年来运用基因工程技术对阿维菌素产生菌改良的研究进展。
方法在查阅国内外文献近100篇的基础上,介绍了阿维菌素的生物合成途径,产生多组分的3个关键酶及阿维菌素产生菌改良的研究进展,包括选择性生产有效组分,产生新抗生素、杂合抗生素,改进生产工艺以及提高菌种产抗生素量。
结果目前国内外均已经构建了只产生B 组分及寡霉素基因缺失或失活的工程菌。
分别运用突变结合理性化筛选和特定基因重组提高活性高的组分的产量,并且通过基因改造产生多种阿维菌素的衍生物;将透明颤菌的血红蛋白基因引入阿维菌素产生菌,改进氧的供应,阿维菌素的产量不断提高。
阿维菌素生物合成调控机制和组合生物学改造聚酮合成酶等方面仍需深入研究。
结论利用生物技术改造阿维菌素产生菌在组分改造、结构修饰、产品收率、生产工艺改进等方面已取得显著进展。
对阿维菌素和其他聚酮体药物产生菌的生物合成、基因改造起着重要作用,使生产简化,成本降低,药物应用更广泛。
关键词:阿维菌素;阿维链霉菌;菌种改良;生物技术中图分类号:Q 786;R 978 文献标识码:A 在采用传统发酵方法生产的生物药品中,抗生素占比例最大,且产量不断增长。
现代生物技术不仅直接提供基因工程药物,而且广泛应用于已有抗生素和生物制品的改造,如在改良微生物药物生产菌种,改进现有药物生产工艺和筛选新药等方面发挥着日益重要的作用。
阿维菌素(avermectins ;AVM s )是难以计数的微生物次级代谢产物中少有的具有抗寄生虫活性的抗生素,其产生菌是阿维链霉菌(S treptomyc es avermitilis )。
2002年,日本北里研究所根据该菌种的形态、生理学和种系进化方面的深入研究将其重新命名为S treptomyc es avermectinius [1]。
野生型阿维链霉菌产生的阿维菌素共有8个组分(图1),属于大环内酯类抗生素。
其中5'位为羟基的B 系列,较5'位连接氧甲基的A 系列活性高,且8个组分中B1a 组分驱虫活性最高。
阿维菌素作为生物农药的代表,因其高效、抗虫谱广、低毒、高选择性以及无残留、与环境相容性好等特点,倍受农药界高度重视,并广泛用于兽用驱虫。
阿维菌素B1组分C22C23位加氢还原产物称为伊维菌素(iver -mectin )[2]。
伊维菌素的销售额在动物用药中占首位,并连续多年保持此记录。
WHO 将伊维菌素免费用于根治人类的盘尾丝虫病(致盲)和淋巴丝虫病,解救百万受折磨的穷人。
而人们并未停止研究阿维菌素和伊维菌素的新药理活性和新用途的脚步,2003年伊维菌素被注册用于人圆线虫病的治疗;在日本伊维菌素将被批准作为控制老人疥疮突发症的药物[3];更有意义的是2004年第1次报道阿维菌素有显著的抗肿瘤活性,联合用药更可显著增加长春胆碱的活性[4],并可以抑制肿瘤细胞产生的多重耐药性[5],在抗肿瘤方面具有巨大潜力。
阿维菌素和伊维菌素的药物价值和经济价值无可置疑,目前基因工程技术在阿维菌素研究中的应用大致分为两个方面:第一,对阿维菌素的生物合成在基因水平的研究。
这方面研究已取得突破性进展,阿维菌素的生物合成途径已基本阐明[6,7],有关生物合成基因簇已被克隆,多数基因的功能已经明确[8,9]。
尤其近年H .Ikeda 等完成了阿维链霉菌全基因组的测序工作[10]。
这些不仅有利于人们了解这一重要抗生素和类似抗生素的合成机制,利用基因工程产生杂合抗生素,更利于从全局对菌种进行改良,利于工业生产。
第二,基于上述研究基础,对S .avermectinius 有目的的进行遗传操作(在日本发现的S .avermectinius 至今仍为产生阿维菌素的唯一菌种),使阿维菌素第22卷第6期2005年11月沈 阳 药 科 大 学 学 报Journal of Shenyang Pharmaceutical U niversity V ol .22 No .6Nov .2005p .463产量提高,工艺简化,产生新的有活性的抗生素。
作者主要对后者近年来的研究进展进行综述,旨在为阿维菌素和类似抗生素产生菌的改造和应用提供思路、策略。
Fig .1 Structure of the avermectins1 特定组分菌株的选择性生产S treptomyc es avermectinius 产生8个化学结构非常相似的组分,这8个组分在结构上的差异集中在3个位置,C5、C22C23和C25位。
这8个组分只有B1a 和B1b 两个组分供医疗、畜牧业、农业应用,同时B1组分和B2a 组分可用作伊维菌素合成前体。
其他组分对有效组分的发酵、提取、精制带来很大不便。
野生型S .avermectinius 还产生一种毒性化合物寡霉素(oligomycin ),因此获得只产有效组分的菌种十分必要。
1.1 阿维菌素B 组分的选择性生产大约50%的阿维菌素在C5位为羟基基团(B 组分),余者在C5位为氧甲基(A 组分)。
在阿维菌素的生物合成途径中,由aveF 基因编码的C5酮基还原酶先将C5位的酮基还原成OH 合成B 组分,然后由ave D 基因编码的C5O 甲基转移酶将C5位的OH 甲基化生成A 组分。
使aveD 基因失活可阻止B 组分转变为A 组分。
Ikeda 等用NTG 对ave D 诱发点突变,使其编码的C5O 甲基转移酶第23位Thr 为Ile 取代,该突变株仅产生阿维菌素B [11]。
目前,由于基因组测序完成,国内分别通过对aveD 基因置换和基因缺失得到只产生阿维菌素B 组分的工程菌[12,13]。
阿维菌素PKS 模块2中脱水酶催化C22C23位的脱水反应,由于其仅具有部分脱水酶活性,因而在C22C23位存在烯键和β羟基这2个结构,将B 组分分为B1和B2。
B1组分杀虫活性高,应用广泛。
如能提高B1与B2组分的比例将会减少工业化提取程序。
K .Stutzman Engw all 等[14]构建了一系列含有aveC 基因突变的重组表达质粒,找到了提高此比例的重组表达质粒,引入宿主后与染色体发生重组,最后得到了一系列比例提高的突变株。
其中一突变株B1与B2的比例较野生型突变株提高4倍,达到1∶0.4。
另外,aveC 基因突变株可只产生阿维菌素的2组分。
但B1组分和B2组分比例的调控机制及aveC 基因如何影响脱水酶基因的表达等方面仍需研究。
1.2 阿维菌素B1a 和B2a 组分的选择性生产阿维菌素C25位的基团是阿维菌素生物合成的起始单元,利用异亮氨酸通过支链氨基酸转氨酶和支链α酮酸脱氢酶复合物催化得到的2甲基丁酸为起始单位合成的为a 组分;利用缬氨酸为前体,异丁酸为起始单位合成的为b 组分。
故抑制异丁酸的前体缬氨酸的掺入可以阻止b 组分的产生。
H .Ikeda [15,16]分离得到2个突变株K2021和K2034。
在K2021中,作为聚酮链合成起始单元之一的异丁酸的前体缬氨酸的掺入受到了抑制,因此仅产生阿维菌素的a 组分。
K2034菌株则仅产生b 组分,通过将K2021和K2034两菌株进行杂交得到了仅产生阿维菌素B1a 和B2a 而不产生其他组分的菌株。
进一步,在aveC 基因区域引入点突变,得到了仅产生单一组分B2a 的菌株,B2a 组分可通过化学加氢的方法再转变为毒性较低的伊维菌素B1a 。
2004年,朱浩君等[17]中断支链酮酸脱氢酶复合物中的bkdAB 基因簇的表达,在不添加任何464 沈 阳 药 科 大 学 学 报第22卷前体物的条件下,发酵产物去除了b 组分,只产生B1a 、B2a 和寡霉素。
这一结果表明,bkdAB 基因簇的表达产物在阿维菌素起始单元合成中担当α酮基异戊酸脱氢酶的功能。
中断bkdAB 导致不能利用缬氨酸合成起始单元,b 组分合成受阻。
阿维菌素的生物合成途径(图2)主要因为C5O 甲基转移酶、α酮基异戊酸脱氢酶和模块2的脱水酶这3个关键酶,使得代谢途径出现分支,通过改变或失活这些关键酶可望得到单一有效组分。
Fig .2 Biosynthetic pathways of avermectins including four stages :biosynthesis of starter units ;formation of the initial agly -cons by polyketide synthases (PKSs );post -polyketide modification ;glycosylation of avermectins aglycons1.3 有毒化合物寡霉素的去除野生型的阿维链霉菌不仅产生阿维菌素,同时也产生一种26元环大环内酯化合物寡霉素(oligomycin )。
寡霉素是哺乳动物细胞氧化磷酸化的抑制剂,毒性很高。
H .Ikeda 等[15]曾用Tn4560对阿维链霉菌野生菌株进行转座诱变得到2株不产寡霉素的突变株,该突变是通过同源重组在寡霉素的生物合成基因簇上插入转座子Tn4560而造成插入失活,使突变株不再合成寡霉素。
由于转座子的转座特征,往往在遗传上不稳定,还可能发生回复突变。
目前寡霉素的生物合成基因簇序列测定完成,它是阿维链霉菌线状染色体上与次级代谢合成有关的基因簇中最大的。
其全长104kb ,共有18个可读框架,在该基因簇内部长约90kb 的片段含有7个大的可读框架olm A 1olm A 2olm A 3olm A 6olmA 7和olm A 5olm A 4,共同编码多功能的聚酮合酶,催化寡霉素聚酮体骨架的生物合成[18]。
张晓林等[19]以仅产阿维菌素B 和寡霉素的阿维链霉菌为出发菌株,构建基因缺失载体pXL05(■olm A 1■olm A 4)并将其转入出发菌株,通过质粒和染色体之间的同源双交换,对染色体上长达90kb 的寡霉素PKS 基因簇(olm A )进行缺失突变,得到4个突变株,不再产生寡霉素而仅产阿维菌素B 组分,且阿维菌素的总产量和B1的产量与出发菌株相当。
说明寡霉素PKS 基因簇的缺失并不影响阿维菌素的生物合成。
该缺失突变是在染色体上通过同源双交换完成的,不会发生进一步的重组,因此突变株性质稳定,在工业上具有应用价值。