RNAscope technology-Chn
QIAamp
本操作手册适用于离心法从140ul 血清、血浆、尿液、细胞培养上清液、无细胞体液、拭子浸液中纯化病毒RNA 。
如需配合QIAcube 核酸纯化工作站实现自动化病毒RNA 纯化，请参阅QIAcbue 操作说明。
如处理更大量的样本（可多至560ul ），按照标准操作流程增加适当比例的裂解液以及载样次数即可。
针对一些病毒含量很低的样本，可参照附录中样本浓缩操作步骤对样本进行浓缩。
注意事项注意事项：：1、 所有步骤所有步骤均均于室温下室温下操作操作(15–25°C)。
2、 样本收集和离心后，血浆（未经处理，或用肝素之外的抗凝剂处理）或血清可在2–8°C 下储存至多6个小时。
如需长期保存，推荐分装后在–20°C 或 –80°C 保存。
冷冻血浆或血清样本不可反复冻融样本不可反复冻融样本不可反复冻融。
反复冻融将会促使蛋白变性沉淀，因而病毒含量降低，导致纯化得到的病毒RNA 的量减少。
并且，反复冻融形成的冷凝蛋白将有可能导致QIAamp 膜堵塞。
冷凝蛋白可通过 6800 x g 下快速离心3 分钟去除，小心吸取上清后立即进行下一步操作。
这一步骤不会影响病毒的含量。
3、 本操作步骤不适用于RNA 和DNA 分离，样本中存在的样本中存在的DNA 和RNA 会被同时纯化出来会被同时纯化出来。
如需完全去除DNA 的影响，推荐使用无细胞体液作为病毒RNA 纯化的起始样本。
含有细胞的样本，例如脑脊液、骨髓、尿液、以及大部分拭子，首先需要过滤，或者1500 x g 离心10分钟以上取上清使用。
如DNA 和RNA 已经一并完成纯化，可将洗脱液经过无RNA 酶的DNA 酶消化处理，接着热处理将DNA 酶灭活。
4、 可以纯化所有大于大于200nt 的RNA 分子分子，小分子RNA 将不能得到高效率的纯化。
本操作手册仅限内部学习使用！如有任何疑问，请联系：胡川（189****3075）准备事项准备事项：：1、 所有样本所有样本平衡至室温平衡至室温2、 Buffer AVE 平衡至室温3、 每个样本每个样本提供提供4个2ml 收集管收集管，，根据不同需要适当自备根据不同需要适当自备无无RNA 酶超净2ml 收集管/1.5ml 离心管4、 按照按照下面的配方准备下面的配方准备AW1 和AW2 BufferBuffer AW1以浓缩液的形式提供。
rna-ip条件 -回复
rna-ip条件-回复RNA IP (RNA Immunoprecipitation) 是一种分子生物学实验技术，旨在研究RNA分子与相关蛋白之间的相互作用。
通过使用RNA抗体，研究人员可以选择性地富集RNA结合蛋白，并进一步分析它们的相互作用及功能。
本文将一步一步地回答有关RNA IP的主题，包括技术原理、实验步骤、数据分析以及该技术的应用领域和挑战。
第一步：技术原理RNA IP的原理基于免疫沉淀技术，其中使用一种RNA特异性抗体与细胞/组织中的靶RNA结合。
为了实现这一目标，首先需要将细胞/组织中的蛋白质与RNA一起交联。
然后使用具有对RNA特异性的抗体，将抗体与交联后的RNA蛋白复合物结合。
免疫反应完成后，通过洗涤步骤去除非特异性结合的物质，最终可以纯化蛋白- RNA复合物。
第二步：实验步骤RNA IP的实验步骤如下：1.细胞/组织交联：使用适当的交联剂，如形醛或二硫化羟亚胺，将目标细胞/组织中的RNA与蛋白质交联。
2.细胞/组织裂解：使用细胞裂解缓冲液或组织断裂器将细胞/组织裂解，并释放RNA蛋白复合物。
3.免疫沉淀：将交联后的产物与特异性抗体结合，并通过抗体的亲和力选择性地富集RNA结合蛋白。
4.洗涤：通过多次洗涤步骤去除非特异性结合物，以提高样品纯度。
5.洗脱：将富集的RNA蛋白复合物从抗体上洗脱，以进一步分析。
第三步：数据分析分析RNA IP实验结果通常涉及以下步骤：1.蛋白质鉴定：通过质谱分析等技术鉴定与RNA结合的蛋白质，并确定其功能。
2.RNA测序：通过测序技术对富集的RNA进行分析，以确定与RNA 结合的蛋白质及其作用位点。
3.功能鉴定：利用基因表达谱分析等方法确定RNA结合蛋白对基因转录和翻译的调控作用。
第四步：应用领域RNA IP在许多生物学研究领域中发挥着重要作用，如：1.转录调控研究：通过分析转录因子与RNA的相互作用，可以揭示转录调控机制。
2.病理学研究：通过在疾病标本中应用RNA IP，可以鉴定与疾病进展和治疗相关的RNA结合蛋白。
新冠疫苗 亲和色谱 -回复
新冠疫苗亲和色谱-回复新冠疫苗是当今全球关注的焦点话题之一，而亲和色谱则是一种常用的分离和纯化技术。
本文将会详细介绍新冠疫苗的亲和色谱进展，以及亲和色谱在疫苗研发中的应用。
一、新冠疫苗简介新冠病毒是一种由SARS-CoV-2引起的呼吸道传染病，其传播速度极快，严重威胁着全球人民的健康和经济。
为了应对疫情，科学家们积极开展了新冠病毒疫苗的研发工作。
二、亲和色谱的基本原理亲和色谱是一种分离和纯化生物大分子的方法，通过利用生物分子之间相互作用的特异性，使目标分子选择性地与固定相结合。
常见的亲和色谱方法包括亲和层析和亲和吸附。
三、亲和色谱在新冠疫苗研发中的应用新冠疫苗的研发是一个复杂而漫长的过程，其中亲和色谱技术发挥了重要作用。
下面将介绍亲和色谱在新冠疫苗研发中的几个典型应用。
1. 抗原纯化亲和色谱可以用于抗原的纯化，以获得高纯度和高活性的抗原。
研发新冠疫苗时，科学家需要从新冠病毒中提取出目标抗原，并将其纯化，以便后续的疫苗研究和制备工作。
2. 抗体纯化研发新冠疫苗的关键是获得高效的抗体。
亲和色谱可用于抗体的纯化，以去除杂质和其他非特异性成分。
纯化后的抗体可用于体外研究、体内动物试验以及临床试验等。
3. 抗体结构研究亲和色谱还可以用于抗体结构的研究。
通过利用与特定抗体亲和的配体分离，科学家可以更好地了解抗体的结构和功能。
这对于了解抗体的作用机制以及优化疫苗设计具有重要意义。
4. 结合亲和素的载体构建研发新冠疫苗时，科学家还需要将目标抗原与亲和素结合，以获得更好的免疫原性和稳定性。
亲和色谱可以用于合成亲和素与目标抗原结合的载体，为疫苗研发提供有力支持。
四、新冠疫苗研发中的亲和色谱进展近年来，亲和色谱在新冠疫苗研发中得到了广泛应用，并取得了一些重要进展。
1. 抗原纯化的改进传统的亲和色谱方法在抗原纯化中存在一些问题，比如选择性不高、纯化效率低等。
研究人员通过改进亲和色谱的材料和工艺，提高了抗原纯化的效率和纯度。
生物谷专访罗宇龄博士：RNAscope(R)开启分子诊断新时代
生物谷专访罗宇龄博士：RNAscope(R)开启分子诊断新时代PCR作为传统的分子诊断技术 ,具有灵敏度高、特异性强、诊断窗口期短 ,可进行定性、定量检测等优点。
但它有一个缺点 ,必须打破细胞 ,把目标分子释放到溶液中才能检测。
而很多慢性疾病〔如癌症等〕的诊断 ,其样品中标识分子和细胞是密切相关的 ,因而更多的需要从单细胞、单分子水平进行检测。
RNAscope(R)能够在原位、单分子水平上高灵敏的检测和定量RNA生物标志物 ,是新一代原位杂交技术平台。
ACD除了开发具有自主知识产权的癌症检测试剂 ,还与制药企业和生物公司建立合作关系 ,验证靶向治疗开展中的生物标志物。
ACD的技术突破了伴随诊断中识别和验证的关键性难题。
RNAscope(R)开启分子诊断新时代生物谷：罗博士您好 ,近年来分子诊断的概念日渐风行 ,能否请您简单为大家介绍一下分子诊断技术相对于传统的诊断方法具有哪些先进之处？我们了解到 ,贵公司成功开发出RNA原位细胞分子诊断的核心技术——RNAscope(R) ,请问这项技术最大的优势是什么？罗宇龄：分子诊断主要通过核酸检测实现 ,其检测的灵敏度和特异性相对于传统检测方法高很多 ,同时也能进行定量检测 ,比方PCR；这些技术上的优势在传染性疾病检测方面已经全面显现。
然而传统的分子检测技术如PCR并不太适合癌症诊断。
因为它需要先打破样本中的细胞并提取核酸才能进行检测。
测到的只是样本中核酸标识分子的平均值。
这种方法对传染性疾病的检测是有效的。
因为病原体于人体而言是外来物质 ,只要在样本中检测到了病原体标识分子 ,就可以断定病因。
但对于自身引起的疾病 ,比方癌症、自身免疫疾病等来说 ,标识分子常存在于自身正常细胞中。
仅仅在样本中检测到标识分子就没有意义了 ,必须知道标识分子出现在那一种细胞中。
这样一来 ,不破坏细胞的“原位〞分子检测技术就非常重要了。
这是PCR等传统的分子检测技术无法做到的。
RNAscope_技术检测hTERC_RNA_组分在宫颈鳞状上皮内瘤变中的表达及其应用价值
ʌ文章编号ɔ1006-6233(2023)06-0928-05RNAscope技术检测hTERC RNA组分在宫颈鳞状上皮内瘤变中的表达及其应用价值胡倩岚,㊀张㊀爽,㊀李红娜,㊀毛㊀昕,㊀刘㊀芳,㊀吴晨阳,㊀宋旭东(华北理工大学附属医院病理科,㊀河北㊀唐山㊀063000)ʌ摘㊀要ɔ目的:探讨RNAscope技术检测hTERC RNA组分表达对宫颈鳞状上皮内瘤变分级诊断价值㊂方法:筛选2021年9月至2022年2月华北理工大学附属医院病理科已确诊为HR-HPV感染的宫颈活检标本80例,分3组:炎症组14例㊁低级别组34例㊁高级别组32例㊂分别采用荧光原位杂交技术及RNAscope技术检测石蜡包埋组织中hTERC基因的扩增状况及其RNA组分的表达㊂结果:FISH 检测hTERC基因扩增三组间具有差异性(P<0.05)㊂RNAscope检测三组间检出率具有统计学差异(P< 0.05)㊂组织学诊断分组中,炎症组14例中hTERC RNA组分阳性表达程度均为(-/++),低级别组中以hTERC RNA组分(++)为主(19/34),高级别组中以hTERC RNA组分(+++/++++)为主(27/32),上述染色模式表达情况在组织学分级诊断中具有统计学差异(P<0.05)㊂结论:RNAscope技术检测宫颈上皮内瘤变组织中hTERC RNA组分的表达有助于宫颈病变组织学诊断及进展预测㊂ʌ关键词ɔ㊀RNAscope技术;㊀荧光原位杂交;㊀宫颈上皮内瘤变;㊀人端粒酶RNAʌ文献标识码ɔ㊀A㊀㊀㊀㊀㊀ʌdoiɔ10.3969/j.issn.1006-6233.2023.06.09Expression of hTERC RNA Fraction in Cervical Squamous Intraepithelial Neoplasia by RNAscope Technique and Its Application ValueHU Qianlan,ZHANG Shuang,LI Hongna,et al(The Affiliated Hospital of North China University of Technology,Hebei Tangshan063000,China)ʌAbstractɔObjective:To investigate the diagnostic significance of hTERC RNA fractions expression de-tected by RNA scope technique in cervical squamous intraepithelial neoplasia.Methods:A total of80cervi-cal biopsy specimens diagnosed with HR-HPV infection in the Department of Pathology,Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology from September2021to February2022were screened in3 groups:inflammation group(14cases),low-grade group(34cases),and high-grade group(32cases). The amplification status of hTERC gene and the expression of its RNA components in paraffin-embedded tis-sues were detected by fluorescence in situ hybridization and RNAscope techniques,respectively.Results: FISH detection of hTERC gene amplification was different among the three groups(P<0.05).Detection rate by RNAscope was statistically different among the three groups(P<0.05).In the histological diagnostic sub-groups,the degree of positive expression of hTERC RNA fraction was(-/++)in all14cases in the inflamma-tion group,the hTERC RNA fraction(++)was predominant in the low-grade group(19/34),and the hTERC RNA fraction(++++/++++)was predominant in the high-grade group(27/32),and the expression of the above staining patterns in the histological graded diagnosis had statistical differences(P<0.05).Con-clusion:The RNAscope technique to detect the expression of hTERC RNA fraction in cervical intraepithelial neoplasia tissue helps in the histological diagnosis and progression prediction of cervical lesions.ʌKey wordsɔ㊀RNAscope technique;㊀Fluorescence in situ hybridization;㊀Cervical squamous intraep-ithelial neoplasia;㊀Human telomerase RNA㊃829㊃ʌ基金项目ɔ2018年度河北省医学适用技术跟踪项目,(编号:G2018067)ʌ通讯作者ɔ宋旭东㊀㊀在全球女性恶性生殖性肿瘤中,宫颈癌位居第二,严重威胁女性健康[1]㊂据数据统计2020年全球新发病例超60万,死亡人数达34万[2]㊂宫颈癌是目前唯一明确病因的恶性肿瘤,高危型HPV(HR-HPV)感染是主要致癌因素,因此如何有效防止宫颈癌的发生发展,及早预防㊁精准诊治是目前研究热点㊂研究发现, HR-HPV可导致宫颈鳞状上皮细胞3号染色体长臂人端粒酶RNA组分(human telomericRNA component, hTERC)基因异常扩增,该基因异常表达是宫颈肿瘤发生的基础,也是宫颈癌形成的早期事件[3]㊂RNAscope 技术是一项新型RNA原位杂交检测方法,它利用 Z 型双探针引物与目标RNA序列互补结合,实现特异性信号放大,使其拥有高灵敏度及特异度,并能在显微镜下直接观察病变中RNA的表达情况[4,5]㊂本课题采用RNAscope技术检测宫颈上皮内瘤变患者hTERC RNA组分的表达,探讨该技术在宫颈鳞状上皮内瘤变病理诊断中的意义㊂1㊀资料与方法1.1㊀一般资料:筛选2021年9月至2022年2月华北理工大学附属医院病理科已确诊为HR-HPV感染宫颈活检标本80例,由两位高级职称病理医师按照2020年(第五版)WHO女性生殖器官肿瘤分类行组织病理诊断,其中炎性病例14例(简称炎症组)㊁低级别鳞状上皮内瘤变34例(简称低级别组)㊁高级别鳞状上皮内瘤变32例(简称高级别组)㊂所有病例均无相关治疗或其他恶性肿瘤放化疗史,且临床资料完备㊂1.2㊀荧光原位杂交技术(FISH):按照试剂盒操作说明对石蜡包埋宫颈组织学标本行FISH检测,橘红色荧光素标记的TERC探针检测TERC基因,绿色荧光素标记的CEP3探针检测3号染色体着丝粒序列,杂交信号结果记录为绿ʒ红,正常细胞为2ʒ2型,异常细胞包括2ʒ3㊁2ʒ4㊁3ʒ3㊁4ʒ4以及hTERC基因高拷贝型(N:5及以上)等㊂1.3㊀RNAscope技术:石蜡切片经二甲苯透明㊁梯度乙醇脱蜡至水,取出切片在室温下风干5min,滴加双氧水室温下10min后蒸馏水清洗,将切片浸入到接近沸腾的靶标修复试剂中,99ħ15min,然后用蒸馏水清洗切片,在无水乙醇中清洗3~5次,风干㊂疏水笔在每张切片样本周围画疏水圈,室温下放置至完全干燥㊂在上述每张切片上加约5滴蛋白酶放入预热至40ħ的HybEZ湿盒,加盖密封,放入杂交炉,40ħ孵育30min,蒸馏水清洗去除切片上的过量液体,在每张切片上加入4滴探针,置于杂交炉中,40ħ孵育2h㊂取出温度控制盘,用清洗缓冲液室温清洗切片2min㊂擦净阻水圈周围的液体,分别依次加入6次杂交反应液,反应温度40ħ,反应时间分别为30min㊁15min㊁15min㊁15min㊁30min㊁15min㊂每次反应结束均用缓冲液清洗玻片㊂加入配置好的Red工作液,室温显色20min,苏木素复染㊁去离子水冲洗㊂1.4㊀结果判读:FISH结果判读:在10ˑ物镜下查找FISH检测细胞区域,然后在40ˑ物镜下扫描整个杂交区域,观察标本的质量,随机计数100个细胞,分别记录正常信号及异常信号细胞的数目㊂正常细胞信号绿ʒ红为2ʒ2型,异常细胞包括2ʒ3㊁2ʒ4㊁2ʒ5㊁3ʒ3型等㊂以20例正常宫颈组织学标本中FISH检测结果建立阈值,阈值=均数+3ˑ标准差,计算结果阈值为6%,即异常细胞数/计数细胞总数ȡ6判断为hTERC 基因扩增,结果为阳性㊂RNAscope结果判读:hTERC RNA组分阳性反应为肿瘤细胞胞质及胞核中可见紫红色颗粒状染色,同时根据阳性细胞在宫颈鳞状上皮垂直切面的分布进行分级:(+)为基底和基底旁细胞染色;(++)为表皮下1/3层的细胞染色;(+++)为超过表皮下1/3层,但未达到2/3层的细胞染色;(+++ +)为超过表皮下2/3层和到全层的细胞染色㊂肿瘤细胞呈阴性反应或阳性反应仅局限于基底或基底旁者均视为hTERC RNA组分不表达,即(-)与(+)均判读为hTERC RNA组分阴性表达(Ⅰ级),(++)染色为Ⅱ级,(+++)和(++++)染色为Ⅲ级㊂1.5㊀统计学方法:采用SPSS26.0软件进行统计学分析,FISH和RNAscope检验结果采用配对χ2检验;一致性检验采用Kappa检验㊂检验水准α=0.05,P<0. 05为差异有统计学意义㊂2㊀结㊀果2.1㊀宫颈活检标本中hTERC基因扩增情况:80例标本中有24例呈hTERC基因扩增(见图1),总扩增率为30.0%(24/80),炎症组㊁低级别组及高级别组扩增阳性率分别为0%(0/14)㊁23.53%(8/34)及50%(16/ 32),统计分析三组阳性率比较具有统计学差异(χ2= 12.773,P=0.002),见表1㊂组间比较,仅高级别组与炎症组之间差异有显著统计学意义(P=0.01)㊂以上结果提示HR-HPV感染宫颈鳞状上皮可以引发hTERC基因扩增,并参与宫颈鳞状上皮瘤变,但hTERC基因扩增阳性结果对宫颈上皮内瘤变分级及预测病变进展的帮助有限㊂㊃929㊃图1㊀FISH检测hTERC基因扩增情况(ˑ100)A.正常宫颈组织无hTERC基因扩增(绿色信号ʒ红色信号=2ʒ2);B.宫颈高级别鳞状上皮内病变hTERC基因扩增阳性(绿色信号ʒ红色信号=8ʒ40)表1㊀FISH检测宫颈组织标本中hTERC基因扩增情况(n)分组例数扩增结果阳性㊀㊀㊀㊀阴性阳性率(%)炎症组140140低级别组3482625.53a高级别组32161650.00bc χ212.773P0.002㊀㊀注:三组之间两两进行比较,χ2分割(α=0.05/3=0. 0167);a示低级别组与炎症组比较,P=0.085;b示高级别组与炎症组比较,P=0.001;c示高级别组与低级别组比较,P=0. 0252.2㊀宫颈活检标本中hTERC RNA组分表达情况:80例HR-HPV感染的宫颈活检组织标本中有53例hTERC RNA组分呈阳性表达,总阳性率为66.25% (53/80),炎症组㊁低级别组及高级别组阳性率分别为0%(0/14)㊁67.65%(23/34)及93.75%(30/32)(见表2)㊂三组hTERC RNA组分阳性表达率的统计学差异显著(χ2=38.334,P=0.000),其中炎症组的阳性率显著低于宫颈鳞状上皮内瘤变组(低级别组及高级别组)(χ2分别为18.184㊁33.715,P值均为0.000),高级别组的阳性率显著高于低级别组(χ2=7.101,P=0. 008)㊂以上结果提示hTERC RNA组分表达增高参与宫颈癌的发生发展㊂参照组织学分级诊断标准,对hTERC RNA组分表达程度进行分级,其中炎症组hTERC RNA组分阳性表达程度均为Ⅰ级(-/+)(14/14),低级别组中以Ⅱ级(++)为主(19/34),高级别组中以Ⅲ级(+++/++++)为主(27/32)(见图2㊁表3)㊂统计学分析示RNAscope检测hTERC RNA组分分级染色模式在宫颈组织学分级中差异具有统计学意义(P<0.05),该结果提示hTERC RNA组分阳性表达的程度与宫颈病变级别呈正比,采用RNAscope检测宫颈组织中hTERC RNA组分的表达可辅助宫颈鳞状上皮内瘤变的组织学诊断㊂图2㊀RNAscope检测hTERC RNA组分表达情况(ˑ200) A.正常宫颈组织hTERC RNA组分(-)㊁B.慢性子宫颈炎hTERC RNA组分(+)㊁C.宫颈低级别鳞状上皮内瘤变hTERC RNA组分(++)㊁D.宫颈高级别鳞状上皮内瘤变hTERC RNA 组分(+++)㊁E.宫颈原位癌hTERC RNA组分(++++) 2.3㊀hTERC RNA组分在宫颈鳞状上皮内瘤变一致性分析:将宫颈鳞状上皮内瘤变中hTERC RNA组分阳性表达程度分Ⅰ级(-/+)㊁Ⅱ级(++)㊁Ⅲ级(+++/+++ +),分别对应组织学诊断中的慢性宫颈炎㊁低级别鳞状上皮内瘤变及高级别鳞状上皮内瘤变㊂根据宫颈鳞状上皮内瘤变临床分层管理共识,将宫颈鳞状上皮内瘤变及hTERC RNA组分阳性表达程度重新分为两级管理(见表4)㊂依据表4分析hTERC RNA组分表达㊃039㊃对宫颈高级别鳞状上皮内瘤变诊断的灵敏度为84. 37%(27/32)㊁特异度为100%(48/48)㊁阳性预测值为100%(27/27)㊁阴性预测值为90.57%(48/53)㊁准确率为93.75%(75/80),一致性检验Kappa值为0.866,一致性显著㊂表2㊀RNAscope检测宫颈组织标本中hTERCRNA组分表达情况组别例数阳性程度-㊀㊀㊀㊀㊀㊀+㊀㊀㊀㊀㊀㊀++㊀㊀㊀㊀㊀㊀+++㊀㊀㊀㊀㊀㊀++++阳性率(%)炎症组141130000低级别组3474194067.65a高级别组32203111693.75bc χ238.334P0.000㊀㊀注:三组之间两两进行比较,χ2分割(α=0.05/3=0.0167);a为低级别组与炎症组比较,P=0.000;b为高级别组与炎症组比较,P=0.000;c为高级别组与低级别组比较,P=0.008表3㊀RNAscope检测分级诊断和组织学分级诊断情况n(%)检测方法组别组织学诊断炎症组㊀㊀㊀㊀低级别组㊀㊀㊀㊀高级别组χ2PRNAscopeⅠ级14(100.0)11(29.7)2(6.3)38.3340.000Ⅱ级0(0.0)19(55.9)3(9.4)24.3200.000ⅢI级0(0.0)4(11.8)27(84.4)47.3550.000合计143432表4㊀RNAscope检测hTERC RNA组分一致性比较检测方法分级宫颈鳞状上皮内病变高级别病变㊀㊀㊀低级别及以下病变Kappa PⅡI级270RNAscopeⅠ/Ⅲ级5480.8660.000合计32483㊀讨㊀论端粒酶是一种维持端粒长度的核蛋白复合体㊂hTERC基因是端粒酶上具有11个碱基的模板序列,在端粒延伸过程中起模板作用,同时也是端粒延伸的重要组成部分㊂该基因异常扩增会导致端粒酶表达过度,致端粒酶延伸,最终造成细胞恶性循环增殖而产生肿瘤[3,6]㊂hTERC基因的表达与端粒酶活性一致,hTERC在许多正常组织和良性组织中均有表达,但其相对上调可反映恶性进展程度,在恶性肿瘤中高表达㊂在宫颈癌和癌前病变中,hTERC也有不同程度的扩增,被认为是宫颈癌的潜在肿瘤标志物[7]㊂HR-HPV 感染是导致hTERC重新激活的起始因子,两者的联合作用使宫颈细胞获得无限的增殖能力㊂目前国内外关于hTERC基因研究也证实了以上观点,Haizhen He[8]㊃139㊃及杨淑玲[9]等研究运用FISH技术检测hTERC基因扩增阳性率,结果显示在宫颈癌中最高,在CIN3中为中度,在CIN1/2类病变中最低,说明hTERC基因在不同宫颈病变的分级诊断中存在明显差异,即随着宫颈病变严重程度增加,hTERC基因表达也增加㊂本实验结果与上述研究一致㊂hTERC RNA组分是由DNA转录产生,在疾病的诊断与治疗中发挥重要作用,但极易降解,而RNA-scope技术所具备的高灵敏度及特异度优势可以显著提高RNA检出率并能提供有效的组织形态学特征㊂本研究中,hTERC RNA组分在各级宫颈病变中均有表达,但是在宫颈高级别鳞状上皮内瘤变中hTERC RNA 组分检出率达90%以上,且组间差异有显著统计学意义(P<0.05),显微镜原位观察hTERC RNA组分染色范围也随着宫颈鳞状上皮内瘤变程度的增加从基底层逐渐向表层覆盖,其染色模式在不同级别的宫颈鳞状上皮内瘤变中的表达具有统计学差异(P<0.05),且具有显著的诊断效能㊂以上统计分析示,RNAscope技术相比于目前主流的FISH技术,它具有更显而易见优势,如明了染色模式㊁判读方便㊁一致率高等,除此之外,在宫颈病变分级诊断中具有显著的灵敏度及特异度,并能直观反应病变进展情况㊂在本研究中,FISH 检测hTERC基因扩增阳性率无法象RNAscope一样进行分级比较,且组间阳性率比较无统计学意义,更加突出RNAscope技术优越性㊂hTERC RNA组分原位杂交染色最显著价值是对宫颈组织学标本进行染色定位㊂在本研究中,hTERC RNA组分在炎症组㊁低级别组及高级别组中显示了不同的染色模式,因此可利用hTERC RNA组分原位杂交为基础来对宫颈病变发展进行推测㊂众所周知, HPV感染从病毒损伤鳞状上皮黏膜基底细胞层开始,随后病毒将其基因整合入宿主基因组中并开始大量复制,最后扩散至整个上皮层,并表达大量E6㊁E7蛋白,破坏宿主DNA修复功能和细胞凋亡,同时上调端粒酶活性使hTERC基因扩增表达,导致上皮细胞无限增殖,最终导致癌的发生[10]㊂本研究中,低级别组大部分病例为表皮下1/3层表达模式,与复制期感染过程相符㊂在高级别病变中,大部分病例表现为表皮下2/ 3层至全层的染色模式,与转化期感染过程一致㊂因此可以通过hTERC RNA组分原位染色变化间接地反映了HPV感染过程㊂故在宫颈上皮内瘤变分流诊断中,对于病理诊断不明确或有分歧时,行hTERC RNA 组分检测可辅助组织学病理诊断以指导临床治疗,对hTERC RNA组分无阳性表达的CIN1及慢性宫颈炎病例,酌情考虑随诊,以避免过度治疗㊂当hTERC RNA 组分阳性表达级别增高时,极大可能为宫颈高级别病变或进展为高级别病变,而予以积极治疗防止漏诊㊂综上所述,采用RNA scope技术检测hTERC RNA 组分的表达,相对于FISH检测hTERC基因扩增状态,更有效地作为宫颈癌前病变的早期筛查辅助手段,并有助于宫颈病变组织学分级诊断㊂ʌ参考文献ɔ[1]㊀Bray F,Ferlay J,Soerjomataram I,et al.Global cancer statis-tics2018:GLOBOCAN estimates of incidence and mortalityworldwide for36cancers in185countries[J].CA:A CancerJournal for Clinicians,2020,70(4):133-133. 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非脱钙骨软骨组织的切片设备制作方法及其细胞示踪和RNAscope联合测试方法与制作流程
图片简介:本技术属于生物检测技术，具体涉及一种非脱钙骨软骨组织切片的制备方法及骨软骨组织细胞示踪和RNAscope联合测试方法。
针对现有技术中由于非脱钙骨软骨组织切片难以保持完整，导致细胞示踪和RNAscope联合测试的技术无法在骨软骨组织切片中应用的问题。
本技术的技术方案是：通过Kawamoto 膜保证骨软骨组织在冰冻切片时的完整性，然后联合应用荧光细胞示踪技术和原位杂交技术实现在同一片骨软骨组织切片中同时观察细胞示踪荧光信号和RNAsocpe的原位杂交特异性靶RNA信号。
本技术拓展了细胞示踪和RNAscope联合测试技术的应用范围，包括：1)骨软骨组织发育研究；2)骨软骨组织中相应基因敲除效率分析；3)基因敲除后对其他目标基因转录水平的影响的研究；4)骨软骨组织病理分析。
技术要求1.一种非脱钙骨软骨组织切片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取冷冻及包埋后的待测骨软骨组织，将骨软骨组织块修正；(2)取Kawamoto膜，修剪成与骨软骨组织块的待切片面对应的大小；(3)将修剪后的Kawamoto膜的粘性面粘贴在骨软骨组织块待切片的面上；(4)对骨软骨组织块粘贴Kawamoto膜的一面进行切片，得到粘贴有Kawamoto膜的骨软骨组织切片；(5)将骨软骨组织切片粘贴有Kawamoto膜的一面贴到载玻片上，固定，得非脱钙骨软骨组织切片。
2.一种骨软骨组织细胞示踪和RNAscope联合测试的方法，其特征在于，包括如下步骤：(a)构建具有细胞示踪剂的骨软骨组织；(b)按照权利要求1所述的制备方法制备得到非脱钙骨软骨组织切片(c)对固定在载玻片上的骨软骨组织切片进行RNA原位杂交处理；(d)同时检测骨软骨组织切片中的细胞示踪信号和目标RNA信号。
3.按照权利要求2所述的一种骨软骨组织细胞示踪和RNAscope联合测试的方法，其特征在于：步骤(a)中所述构建具有细胞示踪剂的骨软骨组织的方法选自转基因标记、Y染色体标记和染料标记。
rnascope wash buffer成分
rnascope wash buffer成分rnascope wash buffer主要由以下成分组成：1.缓冲液（Buffer）：缓冲液是组成rnascope wash buffer的主要成分之一，它可以调节溶液的pH值，维持反应的稳定性。
常见的缓冲液成分包括tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)和酸；Tris可以使溶液保持在中性条件下工作，保证了rnascope wash buffer的稳定性。
2.盐类（Salts）：盐类是rnascope wash buffer中的另一个重要成分，它们可以帮助维持溶液的离子强度，有助于控制杂交反应和洗涤反应。
常用的盐类包括氯化钠（NaCl）和磷酸盐缓冲剂；NaCl可以提供必要的离子强度，促进核酸的结合和杂交反应。
磷酸盐缓冲剂可以提供额外的缓冲能力，维持溶液的稳定性。
3.温和的表面活性剂（Mild Surfactants）：为了增加洗涤效果，rnascope wash buffer中常常添加温和的表面活性剂，例如Tween 20。
这些表面活性剂可以降低洗涤液的表面张力，使其更容易与目标分子（如RNA分子）相互作用。
此外，这些表面活性剂还可以帮助样品均匀涂覆在载玻片上，并提高探针的扩散性能，提高检测的灵敏度。
4.稳定剂（Stabilizers）：为了保护rnascope wash buffer中其他组分的活性和稳定性，通常会添加一些稳定剂，例如聚乙二醇（PEG）和牛血清蛋白（BSA）。
这些稳定剂可以减少非特异性背景信号的产生，并保持杂交温和条件下的稳定性。
除了以上主要成分外，rnascope wash buffer还可能包含一些其他辅助成分，如酸性底物、抗氧化剂和防腐剂。
这些成分的添加是为了进一步提高反应的稳定性和减少不必要的干扰。
总结起来，rnascope wash buffer是一种用于洗涤反应的缓冲液，主要由缓冲液、盐类、温和的表面活性剂和稳定剂等组分构成。
生物化学核酸nanopore测序技术
生物化学核酸nanopore测序技术随着人们对DNA和RNA的研究不断深入，越来越多的测序技术被开发出来。
其中，生物化学核酸nanopore测序技术是一种相对新颖的测序技术，它的出现颠覆了传统的核酸测序方法，被认为是下一代DNA测序的新方向。
什么是nanopore测序技术?nanopore测序技术是利用生物纳米通道测序单个核酸分子的技术。
通过将单个核酸分子引入纳米孔中，并在纳米孔两端加上电势差，利用电势差促使核酸分子从一个端口流入，经过纳米孔时，会产生一系列的电信号差异，这些差异可以被检测和记录下来，最终以高精度的方式决定核酸序列。
为什么要使用nanopore测序技术？nanopore测序技术受到研究人员的青睐，主要有以下原因:1.快速检测：nanopore测序技术具有非常快的检测速度，可在几个小时内获得数百万条序列。
2.能够检测长序列：相对于其他测序技术而言，nanopore测序技术可以检测到更长的DNA和RNA序列。
3.结构灵活：利用nanopore测序技术可以检测到许多类型的小分子和大分子，包括DNA、RNA甚至蛋白质等大分子。
这种灵活性使nanopore测序技术成为一个强大的分析工具。
应用领域和前景nanopore测序技术的应用领域非常广泛，包括基因组学、转录组学、表观遗传学以及癌症研究等。
由于其检测速度快、精度高和样品准备过程简单等优点，nanopore测序技术已经被广泛应用于生命科学的许多领域。
例如，在癌症研究领域，nanopore测序技术已被用于研究实体瘤样本和血液中的循环肿瘤DNA。
这项技术可以检测出肿瘤的遗传改变，并帮助医生做出预测和治疗选择。
在实际应用中，nanopore测序技术仍面临一些挑战。
例如，纳米孔的设计和制造仍然需要进一步优化，以提高靶向检测的精度和检测速度。
由于数据处理的复杂性和存储方式的困难，该方法也需要更多的算法和硬件支持。
结论总的来说，生物化学核酸nanopore测序技术已经成为了RNA和DNA测序的一种重要工具。
RNA原位杂交的金标准——RNAscope?
RNA原位杂交的金标准——RNAscope®RNAscope®是一项新型的RNA原位杂交技术，可在组织和细胞中检测目标RNA。
该技术基于其独特的探针设计与背景抑制技术，并且融合了传统RNA原位杂交技术与FISH技术的优点，在单细胞水平，实现了单个RNA的可视化，代表了RNA原位杂交领域的一项重大进步，是目前最精准的RNA检测技术。
RNA 表达水平高度动态，并集成了遗传和表观遗传学的调控机制，可以作为极佳的分标记物指示细胞的功能状态。
近年来，转录组分析在癌症研究中的广泛应用业已证明，RNA 与蛋白质一样可以作为临床诊断、治疗评估及预后预测的生物学指标。
为了充分利用RNA作为生物学标记物的这些潜力, 迫切需要开发出有效的方法来常规检测RNA 。
RNAscope®正是可满足这一需求的技术，它可以在形态学基础上，绘制真实而重要的信号通路和关联网络。
RNAscope®工作流程Step 1透化：通过RNAscope®预处理试剂盒处理载玻片上固定好的组织或细胞，以暴露目标RNA。
Step 2杂交：RNAscope®针对靶基因设计的20对Z型目标探针与目标RNA杂交。
Step 3信号放大：RNAscope®检测试剂盒通过信号扩增序列与显色标记有序互补结合，从而扩大信号。
Step 4可视信号形成：在透视光学显微镜或者多光谱成像系统的观测下，每一个目标RNA分子以一个点状信号的形式呈现。
Step 5量化分析：显微镜下，直接计数或者使用RNAscope® SpotStudio™ or HALO自动化图像分析软件，对每一个细胞中的RNA单分子信号进行精确定量分析。
RNAscope®探针设计与信号放大原理1、探针设计为了能够显著提高RNA原位杂交的信噪比，RNAscope®采用了类似于荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）的设计原理。
rnascope fish原理
rnascope fish原理RNAscope Fish原理解析本文将针对RNAscope Fish原理进行解析，从浅入深地介绍相关原理。
1. RNAscope Fish概述RNAscope Fish是一种用于研究RNA在细胞中空间分布的技术。
它通过将RNA与特定的探针进行杂交，使用荧光信号以及显微镜观察，可以快速、直观地显示RNA的位置和表达水平。
2. RNAscope Fish的工作流程使用RNAscope Fish技术进行研究通常包括以下步骤：•准备样本: 首先需要准备含有RNA的样本，可以是细胞、组织或切片。
样本需要在合适的载玻片上进行处理和固定。
•探针设计: 根据研究目的，设计适合的RNA探针。
探针通常包含与目标RNA互补的序列，并且还带有荧光标记或酶标记。
•杂交反应: 将探针与样本中的RNA进行杂交反应。
探针的序列与RNA互补时，会形成特异性的探针-RNA复合物。
•信号放大: 在杂交反应后，使用特定的试剂组合对探针-RNA复合物进行信号放大。
这通常涉及到引入荧光或酶的反应，使得探针-RNA复合物可以被可视化。
•显微镜观察: 最后，在显微镜下观察样本。
通过荧光显微镜或其他适当的技术，可以定量和描述RNA在细胞中的位置和表达水平。
3. RNAscope Fish原理解析RNAscope Fish技术的核心原理是通过将RNA探针与目标RNA发生特异性的杂交反应。
这里所使用的RNA探针通常是经过设计和修饰的人工合成探针。
在杂交反应中，RNA探针与目标RNA的互补部分结合，形成稳定的探针-RNA复合物。
这种互补结合可以使得目标RNA在细胞中被选择性地标记和可视化。
为了增强信号和提高探针-RNA复合物的稳定性，通常会进行多步信号放大。
这包括使用引入荧光标记或酶标记的检测探针，通过化学反应使得信号可见。
该过程还可包括使用辅助分子或寡核苷酸来增强信号。
最后，通过显微镜观察样本，可以获得高分辨率的RNA定位信息。
rnascope原理
rnascope原理
RNAscope技术是一种高灵敏度和高特异性的原位杂交技术，用于检测RNA分子在细胞和组织中的表达和定位。
其原理是利用一种专利的分子标记系统，通过多段位置特异性的短引物和一系列的信号放大步骤，对RNA分子进行检测和可视化。
具体而言，RNAscope技术包括以下步骤：1）用一段20-mer的DNA引物，与目标RNA的序列互补，形成一个短的RNA-DNA杂交片段；2）用一个寡核苷酸的引物，与第一个引物的末端相互连接，形成一个新的引物；3）引物上有一个特殊的“Z”结构，这个结构可以限制信号放大的位置；4）每个引物上都有一个专利的标记分子，这个标记分子可以通过酶作用被激活并产生荧光或染色信号；5）通过多次信号放大，荧光或染色信号得以被放大到足以被检测的强度。
RNAscope技术具有高度的灵敏度和特异性，可以检测单个RNA分子的表达和定位，因此在生物医学研究中具有广泛的应用前景。
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一种RNA荧光探针及其制备方法和应用[发明专利]
![一种RNA荧光探针及其制备方法和应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/31dc1c6c777f5acfa1c7aa00b52acfc789eb9fbd.png)
专利名称：一种RNA荧光探针及其制备方法和应用专利类型：发明专利
发明人：刘勇,陈哲,魏国岭,李昺言,沈键平,张越
申请号：CN202111464008.X
申请日：20211203
公开号：CN114014848A
公开日：
20220208
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及探针检测技术领域，尤其涉及一种RNA荧光探针及其制备方法和应用。
本发明所述的RNA荧光探针是一种以噻吩类化合物为基础合成的新型探针，该探针可以凭借自身“V”型共轭结构和刚性平面之间以单键的形式相连的特点，通过氢键相互作用和嵌插作用等与RNA结合，嵌入RNA后探针单键的自由旋转受限产生扭转分子内电荷转移(TICT)机制效应从而能够通过荧光检测方法对RNA进行生物成像，尤其是可以实现细胞或者水环境中RNA的检测。
根据实施例的记载，本发明所述的RNA荧光探针不仅具有高稳定性、低背景荧光和高灵敏度，而且具有跟踪和成像能力。
申请人：云南大学
地址：650500 云南省昆明市云呈贡区大学城东外环南路云南大学呈贡校区
国籍：CN
代理机构：北京高沃律师事务所
代理人：霍苗
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研究LncRNA的一种新方法---RNAscope技术
研究LncRNA的⼀种新⽅法---RNAscope技术我们对RNA 的理解在过去⼏⼗年⾥不断得到发展，RNA不仅仅只承担遗传信息中间载体的辅助性⾓⾊，⽽是更多地承担了各种调控功能。
ncRNA在发育和基因表达中发挥的复杂精确的调控功能极⼤地解释了基因组复杂性之难题。
对ncRNA的研究主要的⼿段是对细胞或组织提取的RNA进⾏定量和定性的分析，常⽤的⽅法包括定量PCR，芯⽚，测序，northern blot等。
为了获得ncRNA在细胞及组织中的表达信息，对细胞或组织直接进⾏RNA检测也是⾮常必要的，这就需要⽤到原位杂交的⽅法。
原位杂交的⽅法可以提供⽬标RNA在单个细胞内的空间定位，以及结合组织形态学显⽰在组织中不同类型细胞表达RNA的精确信息。
传统RNA原位杂交选择放射性标记、荧光标记或⽣物素标记的RNA探针，存在特异性差、灵敏性差的缺点，因此在ncRNA研究中的应⽤受到了很多的限制。
RNAscope 是基于独特的探针设计和信号放⼤⽅法的原位杂交⽅法。
它采⽤类似于荧光共振能量转移(FRET) 的探针设计策略, 两个独⽴的探针( 双Z 探针) 必须串联杂交到⽬标序列才能引起信号放⼤发⽣，结合在⾮特异性位点的单个Z探针不会产⽣⼀个完整的信号放⼤分⼦结合位点，从⽽防⽌⾮特异性信号的放⼤，显著提⾼了检测的特异性（见图1）。
每个RNA分⼦只需三对双Z RNA探针结合到⽬标RNA就可以检测到信号，该⽅法的⾼灵敏性使RNAscope平台具有原位检测⼈类转录组中⼤多数基因的能⼒，很多低丰度的RNA也可以清晰的显⽰空间位置。
RNAscope双Z探针的设计⽅法要求检测的RAN长度要求⾄少300碱基以上，因此，这个⽅法已经被⼴泛⽤于长链⾮编码RNA（LncRNAs）的研究。
图1：RNAscope测定在⼀天内就能完成。
制备样品后，加⼊与⽬标RNA靶标互补的寡核苷酸探针进⾏杂交。
然后⽤双Z探针系统放⼤特异性信号，并⽴即通过标准光学显微术进⾏检测和定量。
rnascope基本原理
rnascope基本原理
RNA Scope基本原理
RNA Scope是一种高分辨率的RNA检测技术，可以用于检测单个细胞中的RNA分子。
它的基本原理是利用一系列特殊的探针来识别RNA分子，并通过荧光或色素信号来标记它们的位置。
RNA Scope的探针是一种短的DNA或RNA序列，可以与目标RNA 分子的特定序列互补配对。
这些探针通常由20-30个核苷酸组成，可以通过化学修饰来增强它们与RNA的互补性和稳定性。
在RNA Scope中，探针通常被标记为荧光染料或色素，以便在显微镜下观察它们的位置。
RNA Scope的操作步骤通常包括以下几个步骤：
1. 样品制备：将细胞或组织样品固定在载玻片上，并进行脱水和脱脂处理，以便探针可以更好地穿透细胞膜和细胞壁。
2. 探针设计：根据目标RNA的序列设计一系列探针，并将它们标记为荧光染料或色素。
3. 探针杂交：将标记的探针与样品中的RNA分子杂交，使它们与目标RNA的序列互补配对。
4. 信号放大：通过一系列化学反应，将标记的探针信号放大，以便在显微镜下观察。
5. 显微镜观察：使用荧光或色素显微镜观察样品，并记录RNA分子的位置和数量。
RNA Scope的优点是可以检测单个细胞中的RNA分子，并且具有高分辨率和高灵敏度。
它可以用于研究RNA的表达和定位，以及RNA在细胞和组织中的功能和调控。
RNA Scope还可以用于诊断和治疗疾病，例如癌症和神经退行性疾病。
RNA Scope是一种重要的RNA检测技术，可以为RNA研究和临床应用提供有力的支持。
rnascope技巧
RNAscope是一种专有的显色原位杂交（ISH）方法，用于在单个细胞水平上可视化单个RNA分子，从空间上对其进行检测，同时维持空间组织微环境。
以下是RNAscope的一些关键步骤和技巧：1. 样本准备：确保样本质量是实验成功的关键。
对于FFPE样本，需选择适当的染色程序以保留RNA。
新鲜样本则无需特殊处理。
2. 靶点修复：在修复靶点之前，应使用靶标修复试剂对样本进行预处理。
这一步的目的是使细胞通透并暴露RNA。
3. 杂交：使用RNAscope的探针与样本进行杂交。
不同的探针适用于不同的RNA类型和目标。
4. 信号放大：通过一系列的洗涤和酶促反应，信号被放大并变得可见。
这一步是RNAscope技术的核心，需要精确控制时间和温度。
5. 显色：最后，通过添加显色底物，将信号转化为可见的染色斑点。
6. 图像采集：使用显微镜观察样本并采集图像。
高质量的图像需要适当的曝光和对比度设置。
7. 结果分析：计数斑点以量化RNA表达。
分析应考虑到背景噪声、非特异性染色和其他潜在的假阳性信号。
8. 质量控制：始终进行必要的质量控制，包括阴性对照和阳性对照。
这有助于验证实验的可靠性和准确性。
9. 注意事项：避免样本暴露于日光、高温和化学物质，以免影响结果。
此外，应遵循所有安全预防措施，特别是在处理潜在的传染性物质时。
10. 验证与优化：根据研究目的和样本类型，可能需要验证和优化RNAscope实验条件。
这包括调整探针浓度、杂交时间和洗涤条件等。
总之，RNAscope是一种强大的技术，但也需要一定的实验技巧和经验。
建议参考相关指南或教程以获得更详细的信息，并在实验中不断探索和总结经验。
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个体化医疗研究的捷径
Advanced Cell Diagnostics
RNAscope® –新一代RNA原位杂交技术
个体化医疗研究的捷径
产品概述
ACD公司坐落于美国加利福尼亚州的硅谷中心，作为新兴的分子病理诊断的领导者，开发了基于细胞和组织测试的方法和平台, 并可应用于个体化医疗领域。
ACD公司的RNAscope®专利技术提供了一种能够在组织细胞原位水平对单分子RNA生物标志物进行定性及定量分析的方法，具有较高灵敏度及特异性，是首个能够进行多重荧光和显色标记的原位杂交技术平台。
同时为缺乏高灵敏度及特异性的生物标志物研发项目提供了很好的替代检测方法，该平台将生物标志物检测环节减少到了3个星期。
ACD公司已开发了多个具有自主知识产权的肿瘤检测相关试剂，更好的解决了病人及疾病异质性检测的问题，并通过与制药和生物公司建立合作关系，开发更多与药物研发及生命科学研究相关的检测试剂，同时也为伴随诊断生物标志物的识别和验证提供了有力的工具。
RNA生物标志物的检测，同样也可应用于感染性疾病、神经生物学以及相关领域的基础医学研究。
为什么要进行RNAscope®原位杂交检测
RNAscope®技术能够在同一实验结果中同时提供分
子定量分析与形态学信息，得益于ACD独特的探针
设计专利技术。
RNAscope®是目前最先进的能够同
时实现信号放大与并降低背景噪音的多重核酸原位
杂交检测技术，是原位杂交领域重大的进步之一。
原位杂交技术的新突破
✧40多年来，RNAscope®技术一直是原位杂交领域最重要的进展之一。
✧凭借单分子级检测灵敏度和多重检测能力，RNAscope®使基因在复杂组织中的表达
实现可视化。
一次测定，获得分子和细胞的基因信息
✧RNAscope®能够在单细胞量级上实现RNA单分子检测与基因表达的定量分析。
✧RNAscope®保存了样品的组织结构完整性，在完整的形态学环境中获取精确的
RNA信息。
“Grind-and-bind”方法，如RT-PCR，需要裂解细胞和提取RNA，丢失了RNA表达信息的细胞微环境。
✧RNAscope® 定量分析单个细胞中的RNA分子数，能够在不同的细胞类别中提供精
确的基因表达定量分析。
IHC 、FISH 、PCR和NGS的补充性工具
✧结合IHC和FISH，RNAscope®可以补充DNA、RNA和蛋白质原位分析的分子病
理学家的工具包。
RNAscope®为原位检测RNA核糖核酸分子标记提供可能，填补了分子原位杂交领域长期存在的空白。
能够在缺少有效抗体或者抗体灵敏度或者特异性不能满足需要的情况下，为免疫组化（IHC）实验方法提供有效补充。
RNAscop 能够有效地检测到分泌蛋白的RNA以及非编码RNA，而后者并不能通过现有的IHC方法实现。
✧RNAscope®是将基因芯片与高通量测序（比如RNA测序）等实验方法获得的结果
转化到临床应用的理想平台。
诸如RT-PCR等其它的RNA分子探针技术虽也能提供灵敏与特异的RNA转录分子定量结果。
但这些定量结果只能够代表一组非单一细胞类群中定量表达的“群体均值”，却丧失了RNA分子的原位定位信息。
✧RNAscope®的探针设计专利技术能够为任何组织在任意基因组上的一切基因设计
探针引物。
与病理学实验室工作流程完美兼容
✧RNAscope®测定可使用与IHC/ISH相同的仪器和样本。
检测操作稳定可靠，易于在
各类型实验室中执行，无论是基础研究，转化型研究还是临床研究实验室中均适用。
同时也提供了人为与自动化检测实验试剂盒以及测试服务等不同产品的可选性。
✧RNAscope®是常规FFPE临床样本的理想之选。
RNAscope®通过提供单细胞层面的
检测灵敏度与样品形态保存的完整，理想地适用于组织样品中RNA分析的诊断应用。
RNASCOPE®检测的实验原理是什么
RNAscope®是一项用于检测位于完整细胞中目标RNA的原位杂交（in situ hybridization , ISH) 的新技术。
该技术以其能放大特异性信号而非噪音信号的专利探针引物设计方法，代表了RNA原位杂交（ISH）领域一项重大进步。
RNAscope® 探针引物设计与信号放大原理
为了能够显著提高RNA原位杂交ISH的信号噪声比，RNAscope®采用了一项原理已被证实的十分类似于荧光共振能量转移（FRET）的设计原理。
两个独立的引物探针(Z 形引物对) 需要随机与目标序列互补结合，以实现信号放大。
因为两个独立引物相互紧挨同时相互互补结合到一个非目标序列的可能性非常之小，这种设计原理保障了对目标信号的特异性放大。
对于任意一个目标RNA序列，都有一组独特设计的20对Z形引物探针对只针对该目标序列具有互补杂交特异性，而不会结合到非目标片段上。
每一个Z形探针引物包含了三个结构元素：
✧Z型引物底部是一个18到25碱基长度的序列能够互补结合到目标RNA上。
这个
序列因目标序列的不同与独特的结合属性而被特异性设计。
✧中部的一个间隔序列链接了引物的上下两端。
✧Z型引物顶端是一个14碱基长度的尾部序列。
源自一对Z形引物对的顶端序列合
成了一段28个碱基长度的结合区以供信号放大前体序列结合。
信号的放大由一系列的杂交组合串联事件最终实现。
✧20组Z形引物对互补结合到1KB长度的目标RNA上。
✧信号放大前体序列结合到一对Z形引物拼接成的28个碱基长度的结合区域。
✧信号放大序列进一步结合到信号放大前体序列上的20个互补结合区。
✧接下来拥有荧光分子标记或者显色标记的酶标记的引物结合到信号放大序列上的
20个互补结合区。
RNAscope®引物探针设计与信号放大系统的优势
✧灵敏度：每三对Z形引物对足以实现对于单一RNA分子的检测。
在部分RNA段落
不能被有效抵达或者RNA部分降解等情况下，20对Z形引物对的设计保障了足够强劲的RNA检测。
✧特异性：Z形引物对的设计屏蔽了背景噪音。
单一的Z形引物探针对于非目标序列
的结合不能够提供信号放大前体序列结合所需要的足够长度，以此防止了对于非特异信号的扩增，保障了特异性。
✧单分子量级的可视性与定量分析：此20x20x20x的引物设计与信号放大原理让单一
RNA分子能够在标准的显微镜下以一个点状信号的方式可视化呈现。
✧能够检测到降解了的RNA：得益于其相对短小的目标结合区域(Z形引物对底端40
到50个碱基的长度)，此Z形引物对的设计为检测到部分降解的RNA提供了保障。
RNASCOPE®原位杂交工作流程
适用于所有基因和组织的综合生物标志物平台。
RNAscope®技术首创多重荧光和显色原位杂交平台，原位检测和定量RNA生物标志物，具有单分子级灵敏度。
操作步骤原理
组织前处理通过RNAscope®预处理试剂盒处理载玻片上固定好的组织或细胞，暴露目标RNA. 杂交RNAscope®的20对针对靶基因设计的Z型目标探针与目标RNA杂交。
信号放大RNAscope®检测试剂盒通过信号扩增序列与显色标记有序地互补结合从而扩大信号。
可视信号形成在透视光学显微镜或者多光谱成像系统的观测下，每一个目标RNA分子以一个点状信号形式呈现。
定量分析用肉眼或者通过RNAscope® SpotStudio™软件自主选择人为或者机读方式定量分析每一个细胞中的RNA分析信号。
根据不同的RNAscope®试剂盒的选用，整个实验流程耗时6.5到10个小时。
其中有2到2.5个小时属于手动操作时间。
产品应用
RNAscope®是一种新型的RNA检测技术，实现单个RNA在原位的可视化和定量。
研究人员利用RNAscope®技术可以检测任何组织的任何基因包括福尔马林固定后石蜡包埋的组织简称为FFPE样品，以及冰冻组织或者细胞中几乎所有表达的基因。
RNAscope®优点：
✧所有样品种类都可以：培养细胞、TMA、PMBC、FFPE或冰冻组织切片！通过设
计原位杂交（ISH）特异RNA序列，可以检测样本中任何基因的表达情况！
✧优异的灵敏度和特异性：通过显色或者荧光法，可精确检测仅有单拷贝表达的
mRNA，使单个RNA转录变得可视化。
双Z探针设计，背景低，可区分90%相似度的序列。
✧品质可靠、快速：只要存在目标RNA，就可以检测出来！现有3000多个目标RNA
的探针，RNA探针定制仅需3周。
✧目前唯一的原位RNA高通量分析工具：具有多个生物标识物，可以同时原位检测
多个基因
参考文献
请参阅“RNAscope® Scientific Peer-reviewed Publications“
Updated July 2014。