基因克隆的质粒载体
第四章 基因工程的质粒载体
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型
第三章 基因克隆的载体
没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。
外源基因BamH I Amp中存活 但在Tet中死亡
外源基因Pst I Tet中存活 但在Amp中死亡
② 分子小，克隆能力大 载体越小越好。 >10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。
③ 高拷贝数
2. 质粒载体相关知识介绍
（4）pBluescript SK
pBluescript SK is similar to the pGEM vectors except that it also carries an origin of replication for a filamentous phage, f1. f1 uses a single stranded DNA molecule as a genome and pBluescript KS
表达型质粒载体
装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯 化的元件，主要用来使外源基因表达出 蛋白质产物。
注意启动子的性质，终止子、起始 密码、终止密码的阅读正确。 如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆 的真核生物的基因臵于大肠杆菌的转 录—翻译信号控制之下。
① 表达载体的结构
1）普通载体元件 复制起始点ORI、 选择标记、 多克隆位点MCS
1.质粒的生物学特性
（4）质粒的复制类型 一种质粒在宿主细胞中存
在的数目称为该质粒的拷贝数。据拷贝数将质粒分为 两种复制型：“严紧型”质粒（stigent plasmid）, 拷贝数为1-3；“松弛型”质粒（relaxed plasmid）, 拷贝数为10-60。不过，即使是同一质粒，其拷贝数在 不同的寄主细胞间也可能有很大的变化。
4第四章 基因克隆的载体-1质粒
4、载体分子中有一段不影响它们扩增的非必须区域， 插入其中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行 复制和扩增； 5、具有较好的安全性，不能任意转移，避免基因非控 制性扩增。
载体的种类和特征
（二）根据质粒自身传递的性质分为两大类： 1、结合型质粒：能自我复制，含转移基 因组，可自我控制质粒从一个寄主细胞传到 另一个寄主细胞。 如：F质粒，部分R质粒、Col质粒。 2、非结合型质粒：能自我复制，不含转 移基因组，不能自主在细胞间传递。 如：R质粒、Col质粒
（三）根据质粒的复制特性分为两大类： 1、严紧型质粒：是一类低拷贝数的质粒， 每个细胞中仅含有一个或几个质粒； 拷贝（数）是指一种质粒在一个寄主细 胞中存在的数目。 2、松弛型质粒：是高拷贝数的质粒， >20拷贝/细胞。该类基因工程中常用。
Example: a. 在pBR322质粒的BamHⅠ或SalⅠ位点 插入外源DNA片断，切断了tetr基因编码 序列的连续性，使之失去活性，产生出 AmprTets表型的重组pBR322质粒，转化 入AmpsTets的大肠杆菌细胞。先涂布在 含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出 具Ampr菌落，再将它们涂布于含四环素 的选择性培养基上。插入外源片断的重 组质粒不能在这种培养基上生长。
它的分子量为4363bp。克隆载体的大小不要超 过10kb。 2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的
选择记号。
共有24种核酸内切酶识别位点（单一的）。其中7种 内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识 别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶 切位点插入外源片断可以导致Tetr 基因的失活； 另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因Ampr有单一 的识别位点，
列举重要质粒
列举重要质粒
质粒是一种环形的DNA 分子，常存在于细菌、真菌等生物体中，它能够自主复制并在细胞间转移，携带一些重要的基因信息。
以下是一些重要的质粒：
1. pUC19 质粒：这是一种常用的克隆载体，携带氨苄青霉素抗性基因和lacZ 基因。
它常用于在大肠杆菌中克隆和表达基因。
2. pET 系列质粒：这是一类用于表达外源基因的质粒，常用于在大肠杆菌中高效表达蛋白质。
pET 系列质粒携带T7 启动子，可以诱导基因的高水平表达。
3. pBR322 质粒：这是一种经典的质粒，携带氨苄青霉素和氯霉素抗性基因。
它常用于基因克隆和质粒构建。
4. pGL3 质粒：这是一种用于荧光素酶报告基因检测的质粒，常用于研究基因调控和启动子活性。
5. pGEX 系列质粒：这是一类用于表达谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白的质粒，常用于蛋白质的纯化和检测。
这些质粒在分子生物学、基因工程和生物技术等领域具有重要的应用价值。
当然，还有许多其他类型的质粒，它们具有不同的特性和用途，可根据具体需求选择合适的质粒。
基因克隆的基本原理和流程
基因克隆的基本原理和流程
基因克隆是一种技术，它使用质粒或DNA片段来复制一个特定的基因序列。
这种技术可以被用来产生大量相同的基因，以改变物种的表型特征，也可以用来研究有关基因的功能、结构和表达的有关信息。
基因克隆的基本原理是使用一种叫做酶切的酶，通过限制性内切酶将DNA片段分割成较小的片段，然后使用DNA 聚合酶将它们连接在一起。
这样，就可以生成几乎完全相同的DNA序列。
基因克隆的流程可以分为三个主要步骤：
1. 提取DNA：首先，由于想要克隆的基因位于一个细胞上，所以必须提取该细胞中的DNA。
常见的提取方法有水解法和溶剂提取法，其中水解法主要通过分解细胞壁和细胞质来提取DNA。
2. 克隆：其次，在提取出DNA后，使用限制性内切酶将DNA分割成较小的片段，然后使用DNA聚合酶将它们连接在一起。
3. 将克隆的DNA植入宿主：最后，将克隆的DNA植入一个宿主细胞，使其可以在宿主体内进行表达。
这里，一般会使用一种叫做质粒的DNA载体，它可以将克隆的基因植入宿主细胞中，从而使细胞获得克隆的基因。
基因克隆是一个复杂的流程，其中包括对基因的提取、克隆和植入宿主体等步骤，而且要完成克隆，还需要使用一系列不同的技术和工具，如限制性内切酶、DNA聚合酶和质粒等。
基因克隆技术在生物学、医学和农业等领域都有着重要的应用，它们已经成为研究基因功能、结构和表达的重要工具。
简述外源基因原核系统克隆表达的基本流程
简述外源基因原核系统克隆表达的基本流程外源基因在原核系统中的克隆表达是通过一系列步骤来实现的。
以下是基本的流程：1. 选择质粒载体（Plasmid Vector）：-选择一个合适的质粒，通常是圆形DNA 分子，具有自主复制的能力。
质粒通常包含选择标记（例如抗生素抗性基因）和表达调控元件（例如启动子、终止子等）。
2. 准备目标基因：-获取外源基因，这可以是从其他生物中克隆得到的DNA 片段。
这个基因应该编码所需的蛋白质或RNA。
3. 限制性内切酶切割：-使用限制性内切酶切割质粒载体和目标基因。
选择适当的酶，以确保两者切口相互兼容。
4. 连接（Ligation）：-将切割后的质粒和目标基因连接在一起，形成重组质粒。
这一步通常涉及DNA 连接酶。
5. 转化（Transformation）：-将重组质粒导入宿主细菌中。
这可以通过热激冲击、电穿孔或其他方法实现。
质粒包含抗生素抗性基因，使得只有带有重组质粒的细菌能够在含有抗生素的培养基中生长。
6. 筛选（Screening）：-鉴定带有正确重组质粒的细菌。
这可以通过PCR、酶切鉴定等技术来进行。
7. 培养：-将筛选出的正常克隆株培养起来，以增大其数量。
8. 表达：-利用宿主细菌的生物机制，使得外源基因在细菌中表达。
这通常涉及到适当的启动子和终止子，以及其他调控元件。
9. 纯化：-如有必要，对表达的蛋白质进行纯化。
这可以通过各种方法，如层析、电泳等来实现。
整个流程的成功依赖于实验室技术的熟练操作和对基因工程原理的深刻理解。
这些步骤的每一步都需要谨慎操作，以确保最终得到具有期望表达产物的克隆。
第2章 基因克隆的载体——质粒和噬菌体
第2章基因克隆的载体——质粒和噬菌体载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。
一、载体的功能：1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供条件二、载体应具备的条件：1.具有对受体细胞的可转移性2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3.长度尽可能小，以提高其载装能力4.具有多种单一的酶切位点5.具有合适的选择性标记附图：图 3-1 自主复制型载体和附加载体的扩增方式2.1 质粒质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子（Covalently closed Circular DNA, ccc DNA），并不是细菌生长所必需的，但可以赋予细菌某些抵御外界环境因素不利影响的能力。
分子量在1-200kb之间。
一、质粒的基本特性：（一）自主复制性质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori）以及一个控制质粒拷贝数的基因，因此它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。
不同的质粒在宿主细胞内的拷贝数也不同，少则几个多则几百个不等，当然由于质粒上并没有复制酶的基因，所以其复制需要使用宿主细胞复制染色体DNA的多种酶群。
（二）不相容性利用同一复制系统的不同质粒（RNAI RNAII Rop因子）如果被导入同一细胞中，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中，就会彼此竞争，它们在单细胞中的拷贝数也会有差异，拷贝多的复制更快，结果在细菌繁殖几代之后，细菌的子细胞中绝大多数都含有占优势的质粒，因而这两种质粒中只能有一种长期稳定地留在细胞中，这就是所谓的质粒不相容性。
（三）可扩增性质粒就其复制方式而言分为两类：松弛型复制及严谨型复制。
pMB1或ColEI 类质粒复制子的复制完全依靠宿主细胞提供的半衰期较长的复制酶及蛋白因子（DNA聚合酶I，III，RNA聚合酶以及dnaB、dnaC、dnaD、dnaZ的产物），因此在蛋白质合成中断时，质粒复制能持续合成，这样当用氯霉素抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制时，带有pMB1或ColEI复制子的质粒将利用丰富的原料大量复制，最后每个细胞可以积聚2000-3000个拷贝，这叫做氯霉素扩增。
基因克隆载体质粒库
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PET-28b Vector PET-29a Vector PET-30a Vector PET-31b Vector PET-35b Vector PET-40b Vector PET-41a Vector PET-42b Vector PET-43.1b Vector PET-50b Vector PET-52b Vector pET302/NT-His Vector pET303/CT-His vector PET-DsbA Vector PET-GST Vector PET-His Vector PET-Trx Vector PLLP-STII Vector PLLP-OmpA Vector PTrc-CKS Vector Pmal-c2x Vector Pmal-p5x Vector PMBP-C Vector PMBP-P Vector PET-28a-sumo Vector PET-duet-1 Vector pACYCDuet-1 Vector PRSFDuet-1 Vector pCDFDuet-1 Vector pACYC184 Vector pProEX-Hta Vector PproEX-Htb Vector Pcold I Vector pCold II Vector pCold-TF Vector
简述基因克隆载体的主要类型
简述基因克隆载体的主要类型
基因克隆载体是指一类可以携带外源DNA片段并能够被复制的DNA分子。
常用于基因工程中，将特定基因序列克隆到载体DNA上，进而进行转化和表达。
根据不同的功能和应用，基因克隆载体可以分为多种类型，以下是主要的几种：
1. 质粒（Plasmid）：质粒是最常用的基因克隆载体之一，通常起源于细菌，具有自主复制的能力，易于操作和扩增。
质粒通常被用于基因表达、基因敲除和基因突变等领域。
2. 病毒载体（Viral Vector）：病毒载体是一类通过改造病毒而成的基因克隆载体，具有高度的转染效率和生物安全性。
病毒载体通常被用于基因治疗、免疫治疗和癌症治疗等领域。
3. 人工染色体（Artificial Chromosome）：人工染色体是一种可以模拟天然染色体结构和功能的基因克隆载体，通常具有高度的稳定性和扩增性能。
人工染色体通常被用于基因组学研究和治疗复杂遗传病等领域。
4. 原核表达载体（Prokaryotic Expression Vector）：原核表达载体是一类专门用于大肠杆菌等原核生物中进行基因表达的基因克隆载体。
原核表达载体通常具有高度的表达效率和易于操作的特点，被广泛应用于蛋白质制备和生物技术研究等领域。
质粒和载体的关系
质粒和载体的关系
质粒是指在细胞质内具有自主复制能力的一类DNA分子，通常被用作基因克隆和基因表达等生物学实验中的载体。
载体是指能够携带外源DNA并进行转移、复制和表达的一类生物分子，其中质粒是最常用的一种载体。
质粒和载体的关系可以通过以下几点来说明：
1. 质粒是载体的一种形式。
质粒作为一种能够独立复制的DNA 分子，可以携带外源DNA序列，并被用作基因工程和遗传学实验中的载体。
在细胞内，质粒可以复制自身，同时也可以复制携带的外源DNA序列，从而实现基因表达等功能。
2. 载体可以是多种类型的分子。
除了质粒以外，还有病毒、贝壳蛋白、脂质体等分子可以作为载体。
不同类型的载体具有不同的特点和应用范围，但质粒作为一种常用的载体，因其构建简单、易于操作等特点，被广泛应用于生物学实验。
3. 质粒和载体的选择取决于实验需求。
在进行基因克隆和基因表达等实验中，研究人员需要根据实验所需的外源DNA序列大小、表达强度、转染效率等因素，选择适用的质粒载体。
同时，还需要考虑质粒在目标细胞中的稳定性、毒性等因素，以确保实验结果的准确性和可重复性。
综上所述，质粒是载体的一种形式，作为常用的载体之一，广泛应用于生物学实验中。
质粒和载体的选择应根据实验需求进行，以确保实验结果的准确性和可重复性。
(整理)基因克隆的质粒载体
基因克隆的质粒载体在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较 详尽研究的主要有质粒、质粒和 质粒。
①质粒又叫因子或性质粒（ ）m 它们能够使寄主染色体上 的基因和 质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。
②质粒通称抗药性因子。
它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且 通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的 抗菌素抗性能力。
③ 质粒即所谓产生大肠杆菌素因子。
它们编码有控制大肠杆菌素合成 的基因。
大肠杆菌是一类可以使不带有 质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死 的蛋白质。
第一节 质粒的一般生物学特性一、质粒细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。
绝 大多数的质粒都是由环形双组成的复制子（图 ）。
Q 大肠杆菌质粒分子的结构示意图质粒是细菌染色体外能够自我复制的环形双链的DNA 分子.编码抗菌素抗性基因的 质粒叫R 质粒，大部分质粒是可以转移的，但也存在着不能够转移的质粒 环形质粒分子 环形染色体DNA大肠杆菌细胞质粒分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状，但在一定的条件下又可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
环形双链的质粒分子具有三种不同的构型：1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形（），这样的通常呈现超螺旋的构型；2．如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环（）N此即构型；3若质粒经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子l ），通称构型（见图—l。
(a) (b)质粒DNA琼脂糖凝胶电泳模式图由于琼脂糖中加有嵌入型染料漠化乙锭.因此, 在紫外线照射下DNA电泳条带呈橘黄色。
（a）道中的SC DNA走在凝胶的最前沿.OC DNA则位于凝胶的最后边Mb）道中的LDNA是经核酸内切限制醉切割质粒之后产生的.它在凝胶中的位置介于OC DNA 和SC DNA 之间在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒，尽管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移就绪。
基因工程的四大技术
基因工程的四大技术
基因工程是一种通过改变生物体的基因来改变其外部表现的技术，它主要包括了四大技术：基因克隆、质粒载体构建、DNA测序和基因编辑。
基因克隆是指将特定的DNA片段从一个生物体中提取出来，然后将其复制到其他生物体中的过程。
这种技术早期是一种繁琐的手工操作，需要牛仔式的实验技能，并且存在着一定的风险。
随着现代技术的进步，基因克隆已经变得更加可靠和高效。
现在，使用PCR 技术和DNA修饰酶等工具可以快速且准确地进行基因克隆。
质粒载体构建是指将特定的DNA片段克隆到一个称为质粒的小环状DNA片段上。
质粒通常存在于细菌中，是细菌用来存储和传递基因的工具。
构建质粒载体需要将目标DNA片段连接到一个特定的质粒DNA片段上，然后将它转化到宿主细胞中。
质粒载体构建可以被用来生产大量蛋白质、药物和其他化合物。
DNA测序是指将 DNA 的顺序进行分析的过程。
这个技术可以让科学家更好地理解和操纵基因。
对于广泛的应用领域，如医学、环境和农业，DNA测序已成为关键的技术。
现代DNA 测序可以通过自动高通量技术，产生数以百万计的 DNA 片段的快速测序结果。
基因编辑是指通过分子生物学技术直接更改一段 DNA 序列的过程。
这种技术可以让科学家更好地理解基因，并且能够使目标细胞中的基因进行针对性的修改。
基因编辑是作为理解基因和生物活动的研究工具，以及改善人类健康、植物和动物耐逆性等实际应用的工具来使用的。
总之，四大基因工程技术的发展，使得科学家对于基因的理解逐步深入和进一步，也促进了科技和生产效率的提高，为我们的社会和未来奠定了更加坚实的基础。
基因工程的质粒载体
E.coli E.coli 酵母细胞 哺乳类细胞
病毒载体 穿梭载体
动物细胞
动物细胞 和细菌
结构 环状 线状 环状 环状 环状 环状 线性染色体
线性染色体 环状 环状
插入片断 〈 8*
9 - 24kb
〈 10 kb 35- 45kb ≈300 kb
举例
pUC18/19 , T-载体 pGEM- 3z等 EMBL系列， Λ gt系列
OC L
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒: 能自我转移
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
自主复制基因，转移基因，细 菌染色体区段
（5）分子量要相对较小 （6）在细胞内稳定性要高 （7）易分离纯化 ※表示载体必须具备的条件
（四）基因工程中常用的载体
基因工程中常用的载体有5类： 质粒（plasmid） 单链DNA噬菌体M13 噬菌体的衍生物 柯斯质粒（cosmid） 动物病毒（virus）
载体的种类和特征
质粒*
受体细胞 E.coli
M13mp系列
pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV
Pel oBAC系列
100 - 2000 kb
PCYPAC1
100 - 2000 kb
〉 1000 kb
SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体
pSVK3质粒，PBV, Ti质粒
第一节 质粒载体
一、质粒（plasmid） 是独立于染色体以外的能自主复制的 双链闭合环状DNA分子。
基因工程第3章 基因克隆载体(1质粒载体)
诱导物：IPTG
• IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵 子的启动转录，使受体菌基因组中的 lacZ 的C端部分和载体的lacZ’肽都 表达。从而互补。 • 但载体MCS上插入外源DNA后，不能 产生肽！
lacZ的肽互补
• -肽（ lacZ’ 基因编码）：-半乳糖苷酶N端 的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。 • lacZ只有在4聚体的状态下才有功能。 • pUC质粒载体上的lacZ’ 编码的肽与这个缺 失突变的-半乳糖苷酶“互补”，使它能形 成4聚体，又能分解Xgal，产生蓝色物质。
• pBR322质粒是按照标准的质粒载体命 名法则命名的。
• “p”表示它是一种质粒； • “BR”则是分别取自该质粒的两位主 要构建者F．Bo1ivar和 R．L．Rodriguez姓氏的头一个字母， • “322'’系指实验室编号，以与其他质 粒载体如pBR325，pBR327， pBR328等相区别。
合适的启动子
• 真核生物基因在原核生物中表达，改 用原核生物或病毒（噬菌体）基因的 启动子。
• 原核生物基因在真核生物中表达，仍 用原核生物基因的启动子。 • 选用外界条件诱导的启动子。
(1) 质粒克隆载体pBR322
• pBR322是经人 工改造的一种较 为理想的大肠杆 菌质粒载体，应 用广泛。现在已 经被许多更优良 的新型克隆载体 所替代。 (P40)
• （1）分子量大，拷贝数低
• 第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子 长 9.1 kb。但只有一个EcoR I切点充当克隆位点， Tetr 作为筛选标志。
（2）筛选标志不理想
• ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1 （colicin E1）。 • colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形 成“噬菌斑”。 • 唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因 的内部。因此可通过插入失活筛选。但细 菌群体容易自发突变出抗colicin E1的细 胞…….
基因克隆本科实验报告
一、实验目的1. 理解基因克隆的基本原理和操作步骤。
2. 掌握限制性核酸内切酶、DNA连接酶、质粒载体等工具的使用方法。
3. 培养实验操作技能，提高实验数据分析能力。
二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段插入到载体DNA中，构建重组DNA分子，并在宿主细胞中扩增。
实验过程中，主要利用限制性核酸内切酶、DNA连接酶等工具进行DNA片段的切割、连接和转化。
三、实验材料与仪器1. 材料：质粒载体、目的基因片段、限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA分子量标准、DNA琼脂糖凝胶电泳试剂盒、DNA纯化试剂盒、感受态细胞等。
2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、微量移液器、离心机、培养箱、超净工作台等。
四、实验步骤1. 制备DNA模板：以质粒载体为模板，利用PCR技术扩增目的基因片段。
2. 酶切：将目的基因片段和质粒载体分别用限制性核酸内切酶进行酶切，得到具有相同粘性末端的DNA片段。
3. 连接：将酶切后的目的基因片段和质粒载体在DNA连接酶的作用下连接成重组DNA分子。
4. 转化：将重组DNA分子转化到感受态细胞中，使其成为重组质粒。
5. 鉴定：通过PCR、DNA琼脂糖凝胶电泳等方法对转化后的细胞进行鉴定，筛选出含有目的基因的克隆。
6. 提取目的基因：从阳性克隆中提取重组质粒，并进行DNA纯化。
7. 验证：利用DNA测序技术对提取的目的基因进行验证，确保其序列与预期一致。
五、实验结果与分析1. 酶切：酶切后的目的基因片段和质粒载体在DNA琼脂糖凝胶电泳上呈现出两条带，分别对应目的基因片段和质粒载体。
2. 连接：连接产物在DNA琼脂糖凝胶电泳上呈现出一条带，表明目的基因片段和质粒载体已成功连接。
3. 转化：转化后的细胞在PCR、DNA琼脂糖凝胶电泳上呈现出一条带，表明转化成功。
4. 提取目的基因：提取的重组质粒在PCR、DNA琼脂糖凝胶电泳上呈现出一条带，表明目的基因已成功提取。
5. 验证：DNA测序结果显示，提取的目的基因序列与预期一致，实验成功。
第四章 基因克隆的质粒载体
流程：
首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（ SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。
将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的 大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链 的碱基中去。
在EB达到饱和时，进行氯化铯密度 梯度离心。
2021/8/4
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碱变性法：
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体 DNA片段之间，在拓扑学上的差异而发展出来 的。
2021/8/4
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8.质粒ＤＮＡ的分离与纯化
(1)氯化铯密度梯度离心法 (2)碱变性法 (3)微量碱变性法
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氯化铯密度梯度离心法
1、质粒DNA占总DNA的1%～2%； 2、在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子
量的细菌染色体易断裂成线性片段，而质 粒DNA分子量小，结构紧密仍保持完整的 状态； 3、染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA链 的碱基中，导致链的解旋；而且形成的 EB- DNA复合物中，EB含量越高，密度会 越低。
线性分子（lDNA)：经限制性内切酶切割之后，双链断裂而 形成。称L构型。
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什么是超螺旋(superhelix 或supercoil) ？ DNA是以双螺旋的形式围绕着同一轴缠绕的，当双螺
旋DNA的这个轴再弯曲缠绕时，DNA就处于超螺旋状态， DNA超螺旋状态是结构张力的表现。超螺旋是DNA三级结构 的一个重要特征。
迁移作用(mobiligation): 由共存接合型质粒引发的非接合型质粒的迁移过程.
2021/8/4
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从基因工程安全角度考虑，接合型质粒不宜作为克隆载体。 因为从理论上存在着发生使ＤＮＡ跨越生物种间遗传屏障 的潜在危险.
(整理)质粒特性
第四章基因克隆的质粒载体在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。
①F质粒又叫F因子或性质粒（sex plasmid）。
它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。
②R质粒通称抗药性因子。
它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。
③Col质粒即所谓产生大肠杆菌素因子。
它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。
大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。
第一节质粒的一般生物学特性一．质粒DNA细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。
绝大多数的质粒都是由环形双DNA组成的复制子（图4-1）。
质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状，但在一定的条件下又可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型；2．如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），此即OC构型；3．若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子（IDNA），通称L构型（见图4-2）。
在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移就绪。
其中走在最前沿的是SC DNA，其后依次是L DNA和OC DNA（图4-3）。
凡经改建而适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都必定包括如下三种共同的组成部分，即复制基因（replicator）、选择性记和克隆位点。
二．质粒DNA编码的表型质粒DNA仅占细胞染色体组的1%～3%左右，但却编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。
puc-19t载体质粒提取的原理
puc-19t载体质粒提取的原理PUC-19T是一种质粒载体，用于DNA克隆和基因表达等分子生物学研究中。
提取PUC-19T质粒主要涉及质粒的裂解、纯化和检测等步骤。
1. 质粒裂解：PUC-19T质粒提取的第一步是裂解细胞，释放质粒DNA。
一种常用的方法是碱裂解法。
首先，将含有PUC-19T质粒的细菌培养物收集下来，通过离心将细菌沉淀下来。
细菌沉淀后，使用含有蛋白酶K和SDS的裂解缓冲液，将细菌细胞壁破坏，使DNA从细胞内释放出来。
碱裂解的同时，高温可以进一步增加DNA的释放效率。
2. 质粒纯化：质粒裂解后的混合溶液中，含有不同的细胞组分和杂质。
为了纯化PUC-19T质粒，可以使用离心、溶液过滤和柱层析等方法。
首先，通过离心将残余的细胞碎片和大颗粒杂质沉淀下来，取得上清液。
随后，多次使用乙醇沉淀将DNA沉淀下来，通过离心分离DNA沉淀和上清液。
DNA沉淀后，可以使用乙醇洗涤去除杂质和残留缓冲液。
最后，用适量的缓冲液将DNA溶解，得到纯净的PUC-19T质粒。
3. 质粒检测：提取的PUC-19T质粒经过纯化后，需要对其进行检测，以确保其质量和完整性。
一种常用的检测方法是琼脂糖凝胶电泳。
首先，在琼脂糖凝胶中制备电泳槽，并预备电泳缓冲液。
将提取的质粒与DNA标记物混合，然后上样到琼脂糖凝胶孔中。
接通电源后，DNA在电场中迁移，根据DNA分子量的不同，形成不同的泳道。
通过与标准的DNA分子量标记物对照，可以确定质粒的大小、完整性和纯度。
此外，还可以通过PCR、酶切、测序等方法进一步验证提取的质粒是否正确。
例如，可以设计特异引物对质粒进行PCR 扩增，并通过胶回收技术纯化扩增产物，用于测序验证质粒的序列是否正确。
综上所述，提取PUC-19T质粒的原理主要包括质粒裂解、纯化和检测等步骤。
通过这些步骤，可以从细菌中高效地提取纯净的质粒DNA，用于后续的分子生物学研究和实验。
基因工程载体的分类及其特性
基因工程载体的分类及其特性田文晓 1343001125按照来源和性质分类1、质粒载体①复制：通常情况下一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区。
在不同的质粒中，复制起始区的组成方式不同，有的可决定复制的方式，例如滚环复制和θ复制；在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于 pMB1 质粒或 ColE1 质粒的复制起始位点。
②拷贝数：质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。
严谨型质粒每个细胞中拷贝数大约为1 ～几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。
③不相容性：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及DNA 限制系统时出现的现象。
不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。
两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。
④转移性：指在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内。
它需要移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因子 bom 及其内部的转移缺口位点 nic。
2、噬菌体载体（包括λ噬菌体、M13噬菌体载体）1)λ噬菌体载体：大的外援插入片段在质粒中不稳定，转导是比转化效率更高的过程，避免出现无插入片段的空载体。
2)M13噬菌体载体：可以对任意克隆基因进行DNA进行诱变，测序方便，可以制备单链测序模板；含有噬菌体DNA的噬菌体颗粒从转化细胞中分泌出来后，可以在生长平板上收集。
①超感染免疫性：溶原性细菌在被噬菌体感染并溶原化后，不会被同种噬菌体再次感染。
②经过若干世代后，溶原性细菌会开始进入溶菌周期，即溶原性细菌的诱发。
此时，原噬菌体从宿主基因组上切离下来进行增殖。
3、粘粒载体（柯斯质粒）①具有λ噬菌体的特性。
柯斯质粒载体在克隆了合适长度的外源DNA，并在体外被包装成噬菌体颗粒之后，可以高效地转导对λ噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。
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第四章 基因工程质粒载体
第二节 质粒DNA的复制与拷贝数控制
返② DNA聚合酶的利用 绝大多数大肠杆菌质粒DNA都是利
用Pollll，仅在前体片段合成中才利用poll；但另外一些 质粒，例如ColE1，始终是利用pol1 。 ③ 复制的方向性 分为纯单向性的（如 ColE1 ）和纯双向 性的（如 F质粒）两种不同的形式。此外还有一类质粒， 其 DNA的复制既有单向性的也有双向性的。 ④ 复制的终止 ⑤ 复制型 ⑥ 复制起点 窄宿主范围质粒和广宿主范围质粒。
接合型质粒的分子比较大，编码有一套控制质粒DNA 转移的基因。
非接合型的质粒，分子小，不足以编码全部转移体系 所需要的基因。
如果寄主细胞中同时存在一种接合型质粒，那么它们 通常也是可以被转移的。
由共存共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移 叫质粒的迁移。
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基因工程
第四章 基因工程质粒载体
ColE1是一种可以迁移的非接合型的质粒。
ColE1质粒的转移需要质粒自己编码的两种基 因参与：特异位点bom( nic) ；ColE1特有的 mob基因编码的核酸酶（迁移蛋白质）。
从ColEI质粒或其亲缘关系密切的派生的大多 数的质粒载体，都已经丧失掉了mob区段。迁
移蛋白可以由亲和性质粒类似基因来补充。 mob
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bom (nic)
ColE1
实验中使用的许多载体分子，在其构建过程中都已经丢掉了nic位点，因此不能迁 移。要使这类质粒发生接合转移的唯一的可能途径是，通过重组作用形成融合的 共整合质粒，从而使它们在形体上变成接合型质粒的一部分。
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将外源DNA带进宿主细胞 提供使重组DNA分子在宿主细
胞中保存下去所需的生物学功能
通常用质粒、噬菌体和病毒
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第四章 基因工程质粒载体
第一节 质粒的一般生物学特性
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4.1.1 质粒DNA：都有一段DNA复制起始位点序列
1、F因子(致育因子)：F+（♂）；F-（♀）；Hfr. 2、R因子(耐药性)： 3、Col因子：可以使不带有Col质粒的亲源关系密切的菌 株致死的蛋白质. 4、青霉素酶质粒： 5、Ti质粒(诱癌质粒)：植物基因工程重要载体。 6、降解质粒： 7、其它：隐蔽质粒、表达质粒、分泌质粒等。
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第四章 基因工程质粒载体
4.1.3 质粒的转移
4.1.3.1 按结合方式分类类型：结合型和非结合型 雌一雄细胞配对过程为细菌的接合作用。
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分类
主要基因
按抗性记 号分类
非 接 合 自主复制基因，产生大肠杆菌素基因 型质粒 自主复制基因，抗菌素抗性基因
自主复制基因，转移基因，细菌染色体区段
（2）以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，同时在其上 还携带着细菌的染色体基因或DNA区段。这样的细胞叫做F’ 细胞。
（3）以线性DNA形式从不同位点整合到寄主染色体上，这 样的细胞叫做Hfr细胞（高频重组细胞）。
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4.1.3.3 质粒DNA的接合转移作用
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第四章 基因工程质粒载体
4.1.5 质粒的不亲合性
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当两种或两种以上的质粒不能够在同一 个宿主细胞中共存的现象，叫质粒的不 亲合性.
这两种质粒就属于一个单一的不相容组.
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4.1.2 质粒编码基因表达的某些表型特征 返回第四章
抗性特征 抗菌素抗性 氨苄青霉素、氯霉素、四环素、链霉素抗性等 重金属抗性 汞\镍、钻、铅、锑、锌等金属抗性 毒性阴离子抗性 砷酸盐、亚砷酸盐、亚硫酸盐、硼酸盐等 其它 嵌人试剂（EB）、辐射、噬菌体及细菌素、质粒特异的限制／修 饰体系抗性 代谢特征：抗菌素及细菌素的合成；碳水化合物、蛋白质、冠瘦碱的新陈 代谢；固氮作用、H2S的合成； 修饰寄主生活方式的因子 毒素的合成--大肠杆菌肠毒素合成； 金黄色葡萄球菌--剥脱性毒素的合成， 植物之冠座病和发根病；豆科植物的感染与结瘤 其它特征 盐杆菌---细胞中气泡的形成； 豌豆根瘤菌的根际蛋白质合成；
接 合 型 自主复制基日，转移基因，大肠杆菌素基因
质粒
自主复制基日，转移基因，抗菌素抗性基因
自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因
Col质粒 R质粒 F质粒 Col质粒 R质粒 Col质粒
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4.1.3.2 F质粒
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（1）以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，其上不携带 着细菌的染色体基因或DNA区段。这样的细胞叫做F+细胞。
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4.2.2 质粒拷贝数控制
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常用的定义是指，生长在标准的培养基条件下，每个细菌细 胞中所含有的质粒DNA分子的数目.
•10~100个拷贝，称为高拷贝数质粒，松弛型 •1~4个拷贝，为低拷贝数质粒，严紧型 •质粒最多可以占到细菌总DNA的0.1％ ~ 5％。
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雄性细胞中的 F因子按滚环复 制，进入到雌性细胞。
F－受体细胞
F＋细胞。
F因子还能够带动寄主染色 体一道转移。 从安全考虑，基因工程主要 使用非接合型的质粒。
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第四章 基因工程质粒载体
4.1.4 质粒DNA的迁移作用（mobilization） 返回第四章
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第四章 基因克隆质粒载体
第一节 质粒的一般生物学特性 第二节 质粒ＤＮＡ的复制和拷贝数控制 第三节 质粒ＤＮＡ的分离和纯化 第四节 质粒载体的构建及类型 第五节 重要的大肠杆菌质粒载体
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第四章 基因工程质粒载体
引子
限制性片段，连接进载体后，
形成多个重组DNA分子