天然虾青素分析方法的研究进展

天然虾青素分析方法的研究进展虾青素是一种特殊生理活性的物质，具有超强的抗氧化、抗衰老、抗癌、提高免疫力等作用。

近些年国内外在天然虾青素的分析方法上有了一定的进展，本文对薄层层析法、紫外光谱法，液相色谱法等分析方法进行了综述。

标签：虾青素；薄层分析；比光谱导数法；光镊拉曼光谱法；高效液相色谱法1前言虾青素是一种端基为酮基的类胡萝卜素色素，化学名称为3，3’-二羟基-4，4’-二酮基-β，β’-胡萝卜素，分子式为C40H52O4，又名虾黄素，虾黄质，龙虾壳色素，是一种非维生素A源类胡萝卜素。

虾青素不仅具有很强的抗氧化性、抗肿瘤及增强免疫的生理功能，而且拥有艳丽的红色及极强的色素沉积能力，国外已成功用于高档水产养殖[1]。

基于虾青素特殊的结构，分别在两端的环结构上存在手性中心，每个手性中心有两种构象，因此存在三种立体异构体，分别是左旋、右旋和消旋体[2]。

虾青素色泽为粉红色，具脂溶性，不溶于水，易溶于氯仿、丙酮、苯和二硫化碳等有机溶剂[3]。

动物实验表明，虾青素可以清除二氧化氮、硫化物、二硫化物，也可降低脂质过氧化作用，有效的抑制自由基引发的脂质过氧化。

另外，虾青素还具有很强的抑制肿瘤发生、增强免疫功能等生理作用[4]。

因而在食品添加剂、水产养殖、化妆品、保健品和医药工业方面有广阔的应用前景。

目前虾青素的主要来源是从水产品废弃物中提取、利用藻类和酵母生产[5]，因此研究快速、简便、准确的虾青素含量测定方法是十分必要的。

本文论述了薄层层析法、比光谱导数法、分光光度法、光镊拉曼光谱法、高效液相色谱法五种检测方法。

2虾青素的分析方法2.1薄层层析法薄层层析以其简单、廉价、快速、适用范围广的优点而成为天然藥物提取、分离过程中常用的检测、分析手段。

样品溶液用毛细管点在薄层板的一端，置密闭槽中，加入适宜溶剂为流动相。

由于毛细管原理，溶剂被吸上，沿板移动，并带动样品中各组分向前移动，这个过程称为展开。

由于各组分性质不同，移动距离不同，展开一定距离后，即得互相分离的组分斑点。

可用适当方法使各组分在板上显示其位置，如组分本身有颜色，即可直接观察，否则可喷显色试剂或在紫外灯下观察荧光等办法确定斑点位置。

吴彩娟[6]采用了用薄层层析快速地定性判断用丙酮提取虾壳中的虾青素情况，粗色素油中虾青素酷的水解情况，纯化虾青素过程中游离虾青素、虾青素醋和其它红色素吸附和洗脱情况。

薄层层析法采用了硅胶板，展开剂为正己烷-丙酮（4∶1，V/V），该方法可以为柱层析及硅胶柱色谱分析提供参考。

2.2比光谱导数法20世纪90年代初，F.Salinas等在多波长数据线性回归分析法和导数吸光光度法的基础上发展了一种新的“比光谱—导数吸光光度法”，并应用于二元混合物的同时测定。

该方法兼具导数吸光光度法可消除低频背景干扰及多波长数据线性回归分析法光谱分辨能力强的特点，能提供更多工作波长的选择余地（Moeriil.B1994），能具有更高的灵敏度和准确度，并且它也避免了普通导数吸光光度法在进行同时测定时为提高分辨率而采用高阶导数方法可能带来的误差。

该方法以混合物溶液的混合光谱与其中某一组分的标准光谱的比值对波长求导，从而得到比值—导数光谱。

经数学处理后，从而解析出混合液中的各个组分的浓度[7]。

倪辉[8]采用了比光谱导数法检测虾青素，测定虾青素的波长为466nm，求导间隔为2nm，除数因子为2μg/ml，测定β-胡萝卜素的波长为461nm，求导间隔为2nm，除数因子2μg/ml。

工作曲线回归方程的R2值都大于0.999，说明回归方程很好地拟合了实验数据，当虾青素和β-胡萝卜素的浓度分别为0.5μg/ml 和0.6μg/ml时，模型的线性良好，可以满足定量分析的要求。

两种类胡萝卜素的回收率都在99%～101%之间，RSD值都小于5%，这证明了方法的精确性与良好的重现性。

该法可以在短时间内获得结果，且不需要液相色谱那样复杂的设备，可以很方便地同时测定分析样品中的虾青素和β-胡萝卜素。

2.3紫外-可见分光光度法分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。

分光光度法以仪器价廉、操作简单、快速等优点而具有广泛的实用价值[9]。

许培雅等[10]采用了紫外-可见分光光度法测定红发夫酵母中虾青素含量，用少量氯仿溶解一定量的虾青素标样后，用混合破壁试剂：混合提取试剂=1∶1为溶剂稀释成不同浓度，以试剂空白作为对照，在480 nm波长下测定吸光度，平行测定6次，测定结果表明，虾青素浓度在0～4μg/ml范围内，线性关系较好。

分光光度法加标回收率为100.2%～104.1%，标准偏差为0.21%～0.43%，表明该分析方法准确性高，重复性好，且简便、快速，可以作为菌种筛选、发酵条件优化过程中快速测定菌体中虾青素含量的方法。

宋素梅等[11]采用紫外-可见分光光度法测定南极磷虾壳中虾青素的含量，分别将虾青素的丙酮提取液和色素油于400～600nm波长范围内进行光谱扫描，得到色素油和虾青素丙酮提取液最大吸收波长分别为481、478nm，在此波长下测吸光度A，从而计算虾青素的含量。

2.4光镊拉曼光谱法光镊拉曼光谱由光镊系统与拉曼光谱系统组成。

激光光镊与拉曼光谱相结合形成的激光光镊拉曼光谱系统（LTRS）已用于分析生物组织标本，可对单个活细胞进行操控和光谱收集。

从拉曼光谱特征峰位置、强度和线宽可得到有关细胞的组成、结构及细胞内物质相互作用的信息[12]。

王雪[13]采用了光镊拉曼光谱法测定红法夫酵母内虾青素的含量，其中光镊拉曼光谱法以波长780nm的激光为激发光，用光镊捕获红法夫酵母细胞，以10s 曝光时间采集细胞拉曼光谱，每种样品收集80个细胞光谱，再以相同高度、相同曝光时间采集背景光谱8个。

用原始的拉曼光谱数据减去相应的平均背景光谱数据，以达到背景扣除的效果，再对数据进行平滑及相应特征峰峰高的读取操作。

以上步骤通过Matlab7.0编写的程序实现，预处理后的光谱数据在Origin8.0中作平均光谱，并用Raman Baseline软件进行基线校正；标准曲线的绘制：取虾青素标准品的不同浓度溶液，以4s曝光时间收集拉曼光谱，每个光谱扣除氯仿溶剂的背景光谱，平滑后，取1520cm-1特征峰峰高与溶液浓度作相关性曲线，即为虾青素的标准曲线，其相关系数R2可达0.9983，相关性良好，这说明了激光镊子拉曼光谱系统稳定，对虾青素的浓度变化敏感且测定准确，是定量分析虾青素的有效手段。

结果显示红法夫酵母发酵24h和72h时的拉曼光谱与虾青素标准品溶液拉曼光谱的三个主要峰位置一致，证实红法夫酵母细胞中确实含有虾青素。

2.5高效液相色谱法以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。

HPLC 是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。

具有分离效能高，选择性好，灵敏度高，分析速度快，适用范围广的特点，适用于高沸点，热不稳定有机及生化试样的分离分析。

陈勇等[14]采用HPLC法测定雨生红球藻中虾青素及其它色素含量，采用分析柱为Nova_PakC18（300mm×3.9mm，5μm）柱，流动相为水、甲醇和丙酮，流速1.0mL/min，用二极管阵列检测器在250～700nm波长范围扫描，在476nm 处进行检测；虾青素、多种类胡萝卜素和叶绿素在30min内得到较好分离，其中游离虾青素、斑蝥黄质和β-胡萝卜素的检出限分别为3.56、1.36和29.4μg/L，游离虾青素在质量浓度为1.99～31.7mg/L范围内与峰面积线性关系良好，相关系数达0.9993，该法的精密度（RSD为0.09%～2.97%）和回收率（96%～102%）均符合方法学要求。

余孔捷等[15]采用高效液相色谱法测定动物源性食品中角黄素、虾青素。

采用分析柱为Waters Symmetry C18（250mm×4.6mm，5μm）柱，流动相为乙腈：水=95：5，流速1.0mL/min，检测波长为471nm，进样量为50.0μL。

虾青素在0.05～5μg/ml范围内呈良好线性关系，相关系数达0.9978。

虾青素的平均回收率范围在83.1%～98.7%，RSD范围在2.0%～8.9%之间，测定低限为0.1mg/kg，可满足现有相关法规所要求检测的需要。

齐安翔[16]等建立了一种雨生紅球藻中虾青素酯皂化的反相高效液相色谱方法，采用二极管阵列检测器（DAD）在476 nm处进行检测，虾青素在15 min 内得到了较好的分离。

虾青素的含量在1～15 mg/L范围内与峰面积具有良好的线性关系，相关系数为0.9993；方法的检出限为0.049 mg/，RSD为3.27%，及回收率为100.7%。

应用本法测定出雨生红球藻中虾青素的总含量为9.79～4.70 mg/L。

3结语随着经济的发展，虾青素的应用越来越广泛，因此对虾青素的分析方法也变得尤为重要。

快速、简便、准确的虾青素含量测定方法有利于减少生产成本，也节约了生产时间。

薄层层析法、比光谱导数法、分光光度法、光镊拉曼光谱法和高效液相色谱法这五种检测方法各有各的优缺点。

其中薄层层析法能方便、简单、快速、直接地检测出虾青素，定性分析虾青素，但不能定量分析虾青素的含量。

该方法可以为柱层析及硅胶柱色谱分析提供参考。

比光谱导数法可以在短时间内获得结果，且不需要液相色谱那样复杂的设备，可以很方便地同时测定分析样品中的虾青素和β-胡萝卜素。

但该方法稍复杂，但是其数学运算繁杂、运算量大，比光谱导数值的影响因素多。

分光光度法操作简便，快速，实验条件不高，但很难区分虾青素和β-胡萝卜素，一般检测得到的结果为虾青素与其他类胡萝卜素的总值。

光镊拉曼光谱法激光镊子拉曼光谱法在测定单位质量红法夫酵母虾青素含量和单位体积红发酵液虾青素产量两方面都适用，且在重现性、操作的简便性等方面比紫外可见分光光度法具有更大优势，但实验条件较高，专业性强。

高效液相色谱法是目前虾青素检测方法中应用最多的方法，结果准确可靠，选择性好，灵敏度高，但虾青素与其他类胡萝卜素分离时间长，样品预处理复杂。

参考文献[1]汪洪涛. 虾青素的性质与开发[J]. 食品工程，2006，（4）：18～34.[2]蔡小莲，杨安平，马志浩，等. 从雨生红球藻中提取纯化天然左旋虾青素的研究进展[J]. 亚太传统医药，2012，8（2）：189～191.[3]张明祥，赵建国. 国内外虾青素的研究进展. 粮食与饲料工业[J]，2002，（1）：26～28.[4]Nishino H.Cancer prevention by carotenoids[J]. Mutat Res.，1998，40（2）：159-163.[5]谢虹，张慧碧，何国平，等. 高效液相色谱法测定虾青素的含量[J]. 粮食与饲料工业，2003，（1）：46～47.[6]吴彩娟. 天然虾青素提取和纯化工艺研究[D]. 浙江大学，2003，18～26.[7]宁霞. 多组分体系中比光谱导数分析方法的研究[D]. 中国海洋大学，2003，9～14.[8]倪辉. 法夫酵母虾青素发酵条件的优化及提取与分析研究[D]. 浙江大学，2005，36～44.[9]李景梅，贾宝山，翟庆洲，等. 分光光度法测定铝的进展[J]. 岩矿测试，2006，25（1）：64～67.[10]许培雅，郑裕国，沈寅初. 分光光度法测定红发夫酵母中虾青素含量[J]. 浙江工业大学学报，2001，29（2）：121～135.[11]宋素梅，刘富俊，姜启兴，等. 南极磷虾虾壳中虾青素稳定性的研究[J]. 食品工业科技，2012，33（18）：96～102.[12]王雁军，姚辉璐，王桂文，等. 人肝癌组织细胞的激光光镊拉曼光谱研究[J]. 光谱学与光谱分析，2009，29（7）：1881～1883.[13]王雪，孙美娟，刘军贤，等. 光镊拉曼光谱法分析红法夫酵母内虾青素含量[J]. 光谱学与光谱分析，2012，32（9）：2433～2437.[14]陈勇，李德发，陆文清，等. 测定雨生红球藻中虾青素及其它色素含量的高效液相色谱法[J]. 分析测试学报，2003，22（4）：28～31.[15]余孔捷，钱疆，杨方，等. 高效液相色谱法测定动物源性食品中角黄素、虾青素的研究[J].食品与发酵工业，2008，34（3）：145～148.[16]齐安翔，蔡明刚，张英，等. NaOH皂化反相高效液相色谱法测定雨生红球藻中虾青素[J].分析科学学报，2005，21（6）：619～621.。