第六章DNA重组的操作

（2）用碱性磷酸酶处理载体
载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连接。 但可以与插入片断以单链连接。
载体
5’
3’
插入片断
第二节 重组体导入受体细胞的原理与技术
一、重组DNA导入大肠杆菌
（一）转化（transformation）
大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。
（二）感染（transduction）
将以λ噬菌体DNA为载体的DNA重组分子包装成病 毒颗粒，感染受体菌的过程。
（二）不同种酶产生的黏性末端的连接
二、平末端（blunt end）的连接
（一） 直接连接
T4 DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低， 只有粘性末端的1~10%。
5’ P3’ HO-
-OH 3’ 5’ P-P 5’ 3’ HO-
5’ P3’ HO-
-OH 3’ -P 5’ -OH 3’ -P 5’
（1）连接效率低； （2）破坏限制性内切酶原有的识别位点； （3） 插入没有方向性； （4） 高底物浓度下会产生多拷贝外源片段插 入载体。
（二） 人工加尾形成 “粘性末端”
（1）同聚物加尾法
① 原理： DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA 的3’-OH端加上脱氧核苷酸。
② 加尾－碱基互补
分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。
5’- AATTC PCR产物 G -3’ 3’- G PCR产物 CCTAG -5’ 两头各有一个粘性末端！
三2.、与PCTR载产体物直的接连连接接 PCR产物
载体
dNTP A
Taq DNA聚合酶
A T
dTTP T
TA TA
四、DNA体外连接应注意的事项 1. 插入片断与载体的酶切位点互补 相同的粘性末端才能有效地连接。 尽量避免平端连接。
CaCl2使细胞膜具有通透性，允许DNA进入。
2. 碱金属离子介导的完整细胞转化 酵母 0.1mol/L LiCl处理 感受态
热激
插入外源基因的载体
40% PEG 4000
涂布选择性平板，筛选转化子
特点：吸收线性DNA能力明显大于环状DNA，两者相差80倍 转化率：103个 / g DNA；共转化现象极少
3. PEG1000转化 PEG处理酵母细胞，可获得类感受态，用于转化
毕氏酵母PEG1000转化法 （1）试剂 缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene glycol 缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35 缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35 DMSO，-70℃保存 （2）待转化毕氏酵母的制备 接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30℃培养2d; 挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜； 取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0.5～0.8； 室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次； 重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulDMSO，
（1）用相同的酶切 EcoRI
EcoRI
EcoRI
（2）用同尾酶切
BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII 都产生GATC4个碱基的粘性末端。
2. DNA插入的方向正确
用双酶切
由于产生的粘性末端不同，只能以固定 方向连接。
EcoRI
BamHI EcoRI
BamHI
EcoRI
BamHI
10ng 载体DNA
100L 感受态细胞
吸附DNA 冰浴30min
摄入DNA 42℃ 1~2min
10-100L转化液 涂Amp＋平板
37℃ 振荡培养1h
加入1mL LB培养基 （Amp-）
转化率：106-108/g DNA
（2）电转化法
原理：在高压脉冲下，细菌细胞表面形成暂时
性微孔，重组DNA通过微孔进入细胞后，脉冲结 束，细胞恢复原状。
虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接
T4多核苷酸激酶处理使5’磷酸化
三、PCR产物的连接
1.在引物的5’端设计酶切位点
（1）设计原则 符合载体的多克隆位点；
避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。 （2）带酶切位点的引物的结构
5’端保护碱基＋内切酶识别序列 3’端15～20bp与模板互补；
模板
制备过程
培养大肠 杆菌
OD600至 0.3-0.4
On ice 5-10 min
4℃离心收 集菌
On ice 30 min
用冰冷的 60mMCaCl2重 悬
4℃离心收 集菌
用冰冷的 60mMCaCl2重 悬
4℃离心收 集菌
用冰冷的 60mMCaCl2重 悬
分装、-70 ℃冻 存
② CaCl2法制备感受态细胞转化DNA的原理
第一节 DNA的体外重组
DNA的体外重组：将目的基因与载体连接，这种重新组
合的DNA称为重组DNA。 一、粘性末端的连接 （一）同一种酶产生的黏性末端的连接
DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起
单酶切、双酶切
两段DNA的连接
DNA片断与载体的连接
不足：
目的基因的正反向插入 载体或目的基因片段会自身环化 载体与多个目的基因片段之间重组
BamHI adapter 5’p-GATCCCGG-3’ GGCC-p5’
Blunt-ended DNA
P-
-OH
HO-
-P
CIP处理
5’HO-GATCCCGG3’ GGCC-OH5’
T4 ligase
nick缺口
5’HO-GATCCCGGGGCC
CCGG -GGCCCTAG-OH5’
nick缺口
受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。 （每g DNA能形成106噬菌斑）。
（三） 转 染
噬菌体DNA不经过蛋白包装成病毒颗粒，用 DNA连接酶使噬菌体环化，再通过质粒的转化 方式导入受体菌的过程。
是转化的一种特殊形式
二、重组DNA导入真核细胞
（一）导入酵母细胞
1. 原生质体转化 2. 碱金属离子介导的完整细胞转化 3. PEG1000转化法 4. 电击法
将黏性末端变成平末端的方法：
（1）5′突出黏性末端的补平 采用大肠杆菌聚合酶Ⅰ的Klenow大片段
（2）3′突出黏性末端的切平 T4噬菌体DNA聚合酶或S1核酸酶
在连接反应体系中加入：
高浓度的DNA连接酶 较高浓度的外源DNA和载体DNA 低浓度的ATP 低浓度的聚乙二醇
平末端连接存在一些缺陷：
3’- 互补序列 GCTAGCCGG -5’
延伸
5’
模板
3’-
PCR产物 互补序列
GCTAGCCGG -5’
带酶切位点的PCR产物
5’- GCAGAATTC PCR产物 GGATCCGCG -3’
3’- CGTCTTAAG PCR产物 CCTAGGCGC -5’
EcoR I位点
BamH I位点
EcoR I BamH I
BamHI adapter
5‘p-GATCCCGGGGCC-
-CCGG -GGCCCTAG-P5’
以粘末端连接，影响与DNA片段的连接
CCGG
5‘p-GATCCCGG-
GGCCCTAG-p5’
GGCC-
④ 防止自我连接
先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其 5’端的磷酸，防止自我连接。
（二）导入植物细胞
（三）导入动物细胞
1. 利用原生质体进行转化
再生
酶去壁
CaCl2
酵母
原生质体 PEG 感受态
插入外源基因的载体
转化
特点：操作周期长；转化率受再生率影响；共转化的原生质 体占转化子总数的25%~33%。
共转化：将两个以上的基因同时导入感受态细胞的方法
PEG（聚乙二醇）使细胞壁具有通透性，允许 DNA进入。
实验简单，不需要制备特殊的感受态细胞
“感受态”：清洗处理，在低温下使细胞处于 无离子区且有甘油或蔗糖等保护剂的悬液中，保证 电击过程中细胞不被击穿而死亡。
转化率：109~1010/ g DNA
电转化法
LB培养受体菌至 OD600=0.5-0.6
冰浴15分钟， 2°C离心集菌
少量冰冷10%甘 油重悬
（1）多核苷酸激酶处理
（2）T4连接酶连接 （3）限制性内切酶消化 （4）目的片段与载体连接
（（3二））接头人分工子加尾（形ad成ap“te粘r）性连末接端法”
① adapter 一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）
P-P
Blunt-ended DNA
5’p-GATCCCGG-OH3’ 3’HO-GGCC-p5’
原理：PEG为细胞融合剂，可使细胞膜间或DNA与膜之
间形成分子桥，从而有利于DNA分子的进入。
步骤：
（1）取对数生长期的大肠杆菌细胞，用含有适量溶菌酶 的等渗缓冲液剥除细胞壁，形成原生质体；
（2）加入待转化的DNA和PEG等渗溶液，均匀混合，促 进DNA进入细胞；
（3）离心除去PEG，将菌体涂布在特殊的固体培养基上， 再生细胞壁，最终得到转化细胞。
3. 插入基因的开放阅读框（ORF）正确
（1）DNA定向插入
（2）起始密码
尤其当载体上有ATG起始密码的时候， 更要注意。
EcoRI
EcoRI
ATGGAATTC 载体
ATGCGGAATTCT 插入片断
ATGGAATTC T
重组
但移码突变！
4. 防止载体自身环化连接 （1）提高插入片断的用量 连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。
4. 接合转化
接合：指通过细菌细胞之间的直接接触导致DNA从
一个细胞转移至另一个细胞的过程。
➢ 原理：非接合型质粒由于缺少编码接合转移基因，不能直
接通过细胞接合转化受体细胞，但当同一细胞中共存一个 含有接合功能的辅助质粒，则这些非接合型质粒通常也会 被转移。
➢ 接合转化法（三亲本杂交接合转化法）：待转化的受体菌、 含重组质粒DNA的供体菌、含有接合质粒的辅助菌。
（三）转染（transfection）
受体菌直接捕获重组噬菌体DNA的过程。
（一）转化（transformation）
（1）Ca2+诱导转化法（heat shock） （2）电穿孔转化法（electronporation） （3）PEG介导的原生质体转化 （4）接合转化
（1） Ca2+诱导转化法 制备感受态细胞
2°C离心 收集菌体
冰冷的10%甘 油重悬菌体
分装成 50-300L
0.5g质粒 DNA
On ice 混合
电转仪调为 2.5kV,25F
脉冲控制器 200-400
10-100L转化液涂含 抗菌素的平板
37°C中速震 荡60分钟
冰冷的10%甘 油重悬菌体
2°C离心 集菌
转化
加入 1mLSOC 培养液
➢3.PEG介导的原生质体转化法
③优点： 能把任何片 段连接起来
④缺点： 操作繁琐； 外源片段难以回收； 同聚物尾巴影响外源 基因表达。
非酶切位点
（2）衔接物（linker）连接
Linker：
用化学合成法合成的一段10-12bp的，具有一个或数 个限制性内切酶识别位点的平末端双链寡核苷酸
EcoR I linker： GGAATTCC CCTTAAGG
（二） 感染
将以λ噬菌体DNA为载体的DNA重组分子包装成病毒颗粒， 使其感染受体菌的过程称为感染；
体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，形成噬菌斑。
体 外 包 装 过 程
形成噬菌斑
通过受体菌细胞表面的DNA接受器位点 （receptor site)，使带有外源基因的重组体DNA注 入受体大肠杆菌进行扩增。
1、将处于对数生长期的细菌置于0℃的CaCl2低渗溶液中，细 胞膨胀成球形，处于感受态；
2、将感受态细胞与DNA混合，Ca2+与DNA结合形成抗DNase 的羟基-磷酸钙复合物，粘附于细胞表面；
3、经42℃短时间热激处理，细胞吸收DNA复合物； 4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。
操作步骤： （p140）
3’
3’
模板
5’- GCAGAATTC EcoRI位点
互补序列 -3’ 引物1 复性
3’
模板
5’- GCAGAATTC 互补序列 -3’
延伸
3’
模板
5’- GCAGAATTC 互补序列 PCR产物
-3’
模板
3’
3’
模板
引物2
3-’ 互补序列 复性
GCTAGCCGG -5’ BamH I 位点
5’
模板
① 目的 增加受体菌细胞膜的通透性
感受态细胞：处于能吸 收外源DNA分子的生理 状态的细胞
菌种
使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如 K12系列的大肠杆菌。
制备原理
用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。
其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热 脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫 做感受态。