基于PCR信号放大的微量蛋白检测技术邻位连接延伸分析

以同时检测96个样本，和96组引物(探针)；实现
了多个指标的高通量检测。
2.样本加样可实现自动化
引物（探针）孔
3.样本加样量少：体积1uL、血清、血浆等
4.检测灵敏度 优于ELSA ，检测浓度可到达
fg/mL（10-15），较宽检测线性范围（105）
反应区 样本孔
PEA技术的应用
细胞因子IL-18的检测
PLA类型
根据抗体类型：直接PLA与间接PLA
A图直接PLA，B图间接PLA，区别在于间接法用到的探针为二抗连接的亲 和探针，一抗为捕获抗体。
PLAห้องสมุดไป่ตู้术检测蛋白的核心
邻位探针：不同的DNA单链与一对蛋白识别分子相结合形成，使其通过免 疫吸附的方式结合到待测蛋白上。
为什么说PLA的核心是一对邻位探针？ 1.DNA与蛋白结合效率低。 2.通过筛选（指数富集配体系统进化技术SELEX）技术，难以得到与蛋白 分子高特异性、高亲和力的核酸适体。 3.核酸适体的种类有限，难以满足PLA实验要求。
Olink公司PLA 检测原理
蛋白In Situ （原位）检测 ➢抗体偶联亲和探针为正负链，再加 入与正负链两端同时互补的寡核苷酸 序列（a，b），而这两条链在探针链 上存在一个断裂点，在连接酶的作用 ，连接成为一个环状DNA。 ➢以正链探针为引物，以环状DNA为 模板，进行滚环扩增(RCA)，得到单 链的串联PCR。 ➢定量方法Olink 采用了终点定量的方 法，加入荧光杂交探针，在荧光显微 镜下检测。
Stadler, Charlotte, et al. ( ) Immunofluorescence and fluorescent-protein tagging show high correlation for protein localization in mammalian cells. Nature. doi:10.1038/nmeth.2377
探针不存在损失
非特异性吸附、检测背景信 号高
样品量大、手工操作，干扰 因素多
操作复杂，难以做成商品化
总结
Olink公司基于PLA与PEA的服务
以左上图三 ：个P➢E原A基因检，于测限ILP制-1C8了线RP性L信A范的围号发：展放0应. 用大检测方法，在检测特异性、灵敏度和线性范围都非常
红色：磷酸化的EGFR蛋白；
Stadler, Charlotte, et al.
肿右瘤图相 ：关P于E标AP志反C物应R（过信9程2，种号采肿用瘤放微相大流关控蛋检芯白片）测q的P都研CR究需系服统务要检测考虑的重点问题。
是一种研究蛋白定量、定位、相互作用、修饰以及功能的新蛋白分析技术。
缺上点图： ：盲肺➢目癌基、CT过于C程检P繁测C琐在R，临信核床酸应号适用配放方体面大种，类灵的有敏限检度。73测. 方法通常操作过程繁琐，过程引入的变异因素
左图：PEA 检测IL-18线性范围：0.24-31250pg/mL 右图：ELISA 检测IL-18 线性范围：78-5000pg/mL
Olink公司基于PLA与PEA的服务
是一种研究蛋白定量、定位、相互作用、修饰以及功能的新蛋白分析技术。 循环细胞与偶联寡核苷酸探针的叶酸分子结合；
将国与内细 ：胞目O结前l合处in的于k叶实公酸验室-寡司研核究提苷阶酸供段探，针下无从相面细关胞几产上品解个离方下来面； 的服务：
PLA探针已经走向商业化，Solulink公司可定做抗体DNA复合探针，可直接用于PLA反应。
心血管疾病标志物物的检测 CFDA 年01月11日批准了国内首个通过PCR信号放大检测肺癌循环肿瘤细胞试剂盒-CytoploRare ™（靶向PCR CTC）格诺思博生
物科技（南通）
C在y定to量plo过R程are中™，用可于以临对床细胞和组织的图像进神行分经析疾。 病方面标志物物的检测
从 年到 年邻位连接技术的文献引用次数从41次到156次，到 年关于PLA技术的报道为55篇。 右图：ELISA 检测IL-18 线性范围：78-5000pg/mL Olink公司PLA 检测原理 国外：Olink公司在PLA方面做了较多基础研究，并对PLA技术申请了专利。 上图：肺癌CTC 检测在临床应用方面，灵敏度73. 蛋白In Situ （原位）检测 中图：抗体交叉反应，但邻位探针无法形成互补结构
均相（液相），待测样品、探针、荧光PCR引物以及连接试剂 加入同一管中进行荧光定量PCR，适用于微量蛋白质的快速检 测。
固相，待测蛋白预先固定于微孔板上，洗涤去除未结合分子，去
PLA
除游离探针，检测含量过低的蛋白。
原位，邻位探针与待测的2个具有相互作用的蛋白质分子分别结 合，反应体系中加入的DNA短序列与探针上的DNA链互补，在 连接酶的作用下形成环状DNA，RCA扩增。蛋白互作、细胞或 组织内定位的PLA方法。
PLA基本过程
共分为3步： 孵育：样品与靶特异性抗体的一对邻位 探针共孵育
连接：结合到同一蛋白上的邻位探针与 连接片段杂交并发生邻位连接反应，形 成一个环状的蛋白质一蛋白识别分子一 单链DNA复合物
扩增：qPCR扩增复合物中的单链DNA 部分
PLA类型
PLA可分为三种：均相（液相）、固相和原位。
Fig. 2 EGF（表皮细胞生长因子）刺激前后，用免疫荧光染色和PLA方法检 测U343细胞中EGFR磷酸化水平的变化。PLA方法可以检测到EGFR的激活， 而IF方法则不能。红色：磷酸化的EGFR蛋白；蓝色：细胞核
PLA的应用举例
3.高灵敏度的检测低丰度蛋白的表达 如果需要在天然状态下对蛋白质进行研究，必需对目的蛋 白质进行过表达、标记或遗传修饰。
免疫磁珠反向富集CTC检测示意图
CytoploRare ™用于临床
上图：肺癌CTC 检测在临床应用方面，灵敏度73.2%、特异性84.1%，优 于其他常用标志物。
不同检测技术的比较
PLA PEA 免疫PCR ELISA WB
优点 高灵敏度 高灵敏度 高灵敏度 技术平台成熟 技术平台成熟
缺点
探针存在损失
传统分析方法需要：凝胶电泳、质谱、高效液相色谱法和免疫组化结合。
业化。 抗体偶联亲和探针为正负链，再加入与正负链两端同时互补的寡核苷酸序列（a，b），而这两条链在探针链上存在一个断裂点，在连
接酶的作用，连接成为一个环状DNA。 1038/nmeth.
国内：目➢前P处C于R实方验室法研的究阶高段，灵无敏相关度产品是一把双刃剑，可能产生较高的背景信号，这是基
1. 免疫磁珠反向富集循环细胞 2. 循环细胞与偶联寡核苷酸探针的叶酸
分子结合； 3.洗涤； 4.将与细胞结合的叶酸-寡核苷酸探针从
细胞上解离下来； 5.含有寡核苷酸探针的洗脱液加入25uL的
PCR mix 溶液中； 6. 进行qPCR （Taqman 探针法），计算
样本中寡核苷酸的浓度；并依据标准 曲线转换为CTC units相对单位。
主要内容
邻位连接分析技术（proximity ligation assay） 邻位延伸分析技术（proximity extension assay） CytoploRare ™技术
一、PLA技术（邻位连接分析技术）
背景：瑞典ULF Landegren 研究小组2002年提出了一种新的蛋白体外分析 方法----邻位连接技术(proximity ligation assay , PLA），通过一对亲和探针 对目的分子双识别，继而产生可扩增的检测信号，从而将对蛋白质的检测 转变成为对DNA 的检测，实现了微量蛋白的分析。是一种研究蛋白定量、 定位、相互作用、修饰以及功能的新蛋白分析技术。
三、国内基于PCR信号放大技术-CytoploRare
CFDA 年01月11日批准了国内首个通过PCR信号放大检测肺癌循环肿瘤细胞 试剂盒-CytoploRare ™（靶向PCR CTC）格诺思博生物科技（南通） 用途：定量检测肺癌血清中叶酸受体阳性循环肿瘤细胞，用于肺癌的辅助诊断与 疗效评估。
CytoploRare ™技术特点
1038/nmeth.
通高过灵细 敏胞度核的的检自测动低检丰测度，蛋以白及的细表胞达质大小的肿估算瘤，相研究关者能标够志对组物织或（细9胞2群种中的肿蛋瘤白质相表达关水蛋平进白行单）细的胞统研计学究分服析。务 三检、测国 稳内定基、于瞬时PC和R微信弱号的放蛋大白技互术作-C（yto可p视loR化主a）re 要是用于科研服务，尚未发现临床试验报道
PLA的应用举例
1. 检测稳定、瞬时和微弱的蛋白互作（可视化）
Fig. 1 培养48 h的大鼠胚胎海马神经元，原位显示ER α（雌激素受体）与 DYX1C1在神经突触中的互作。 红色：ER alpha/DYX1C1复合物；绿色：actin蛋白；蓝色：细胞核
PLA的应用举例
2.检测蛋白的翻译后修饰 传统分析方法需要：凝胶电泳、质谱、高效液相色谱法和免疫组 化结合。
左图：抗体识别正确且邻位探针可以形成互补结构 中图：抗体交叉反应，但邻位探针无法形成互补结构 右图：PEA反应过程，采用微流控芯片qPCR系统检测
国内：未见相关报道
Olink公司PEA技术特点
Olink 公司 PEA 特点：
1.qPCR定量采用微流控芯片，实现了蛋白高通
量的定量检测（96样本x96种抗体探针对）：可
具有优势。 连接：结合到同一蛋白上的邻位探针与连接片段杂交并发生邻位连接反应，形成一个环状的蛋白质一蛋白识别分子一单链DNA复合物
邻位延伸分析技术（PEA）， 不需要额外的寡核苷酸将探针拉近连接，其两条探针末端含有5bp配对碱基，在延伸酶的作用下形成双
链以模正板 链，探➢利针采用为引q用P物C链R，进以霉行环检状亲测D，N和A有为素效模的与板避，免生进探行物针滚的素环损扩失系增。(统RCA，)，二得到抗单链偶的联串联探PC针R。，利于将PLA探针形成产
PLA反应原理
1.当识别同一抗原上的两个抗体结合到抗原，则抗体上偶联寡核苷酸序列彼此靠 近。 2.溶液中可以与这两个探针末端互补的连接片段的作用下，形成有一个断裂点的 dsDNA片段。 3.在DNA连接酶的作用下形成完整的dsDNA。 4.以连接完整的DNA作为模板，进行定量PCR的检测；靶抗原的浓度与DNA模板 的量成比例，进行蛋白定量转化。
二、PEA（邻位延伸技术）
邻位延伸分析技术（PEA）， 不需要额外的寡核苷酸将探针拉近 连接，其两条探针末端含有5bp配对碱基，在延伸酶的作用下形成双链 模板，利用qPCR进行检测，有效的避免探针的损失。
PEA相关的产品
国外：Olink拥有该技术的相关专利，并推出了相关产品 产品品 牌：Proseek Multiplex 蛋白高通量检测
国内：目前处于实验室研究阶段，无相关产品 从 年到 年邻位连接技术的文献引用次数从41次到156次，到 年关于PLA技 术的报道为55篇。
Olink公司PLA技术
Olink公司PLA技术应用 领域
➢ 蛋白质互作及其修饰 的检测
➢ 细胞蛋白定位分析
➢ 数字化定量
采用荧光染色，没有复 杂判读标准，极有可 能取代免疫组化
PLA探针已经走向商业化，Solulink公司可定做抗体DNA复合探针，可 直接用于PLA反应。
PLA国内外研究现状
国外：Olink公司在PLA方面做了较多基础研究，并对PLA技术申请了专利。 相关产品：Dolink®（13000RMB）该技术平台于 年12月被sigma-Aldrich 公司收购，目前该产品正是该公司网站上的主推产品。
Fig. 3 分别用免疫荧光和PLA方法检测A431细胞中EGFR 的表达。与IF方法相比，PLA方法的信噪比高出100倍。 红色：EGFR蛋白；蓝色：细胞核
PLA的应用举例
4.数字化定量 在定量过程中，可以对细胞和组织的图像进行分析。通过细胞核的
自动检测，以及细胞质大小的估算，研究者能够对组织或细胞群中的 蛋白质表达水平进行单细胞统计学分析。
以上三个原因，限制了PLA的发展应用
PLA探针的发展
探针的发展： 核酸适体：从一个体外合成的随机寡核苷酸文库中筛选出与靶分子
特异性结合的小分子DNA。缺点：盲目、过程繁琐，核酸适配体种类 有限。
化学法：多功能交换试剂SMPB：抗体与巯基修饰的单链DNA结合 。
生物法：streptavidin与biotin高亲和力。