免疫学实验教案

实验一凝集反应
一、目的要求
学习和掌握用试管凝集反应测定抗血清效价的方法。

二、实验说明
细菌、螺旋体、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后，在有适量电解质存在的情况下，抗原颗粒相互凝集成肉眼可见的凝集块，称为凝集反应。

参加反应的抗原称凝集原，抗体称凝集素。

三、实验材料
1．试剂抗原、石炭酸生理盐水、阳性血清、被检血清、阴性血清。

2．器材及其他载玻片、小试管（1 cm×6.5 cm）、试管架、移液管、吸管、水浴锅。

四、方法步骤
1．玻片凝集实验
（1）在载玻片两端各滴一滴大肠杆菌菌悬液。

（2）在一端的菌悬液中加入一滴1:10稀释的大肠杆菌抗血清，另一端悬液加入一滴生理盐水。

（3）将载玻片小心地振动使混合液混匀后静置于室温，数分钟后便可观察到加抗血清的一端产生凝集块，而另一端生理盐水对照没有凝集块产生。

若反应不明显，可放入培养皿中（皿内放入湿滤纸，以保持一定湿度），37℃保温30 min后观察结果。

亦可将载玻片放置显微镜下，凝集块明显可见。

2．试管凝集试验
（1）抗血清的稀释抗血清稀释采取倍比稀释法。

取干净小试管7支，排列在试管架上，依次注明号码，每支试管用移液管加入0.5 ml生理盐水。

（2）按下表操作用0.5%石炭酸生理盐水，将待检血清稀释成4个稀释度，5、6、7管分别设为抗原对照、阳性对照和阴性对照。

（3）加入抗原各管中加入抗原0.5ml，充分混匀。

（4）抗原抗体反应把各管混合液振摇混匀，置37℃水浴箱中水浴4 h或在室温中过夜，观察结果。

（5）结果观察与效价判断
①生理盐水对照管中的抗原（细菌）应分散，无凝集块沉淀而呈混浊菌悬液。

②实验管如有凝集，管底可见到凝集块，液体上部澄清、半澄清或混浊度降低，管底凝集块轻摇即浮起，呈片块状。

③凝集强弱的判断（以“+”表示）
“-”：细菌不被凝集，液体混浊、无透明度，管底无伞状沉淀，但由于菌体自然下沉，管底中央出现圆点状沉淀，振荡时复呈均匀混浊状态。

“+”：液体透明度不明显（25%清亮），25%菌体凝集，管底有少许不明显的伞状沉淀。

“++”：液体中等混浊（50%清亮），50%菌体凝集，管底有中等量的伞状沉淀，振荡时呈小絮片状。

“+++”：液体几乎透明（75%清亮），75%菌体凝集，管底有明显的伞状沉淀，振荡时呈小或大絮片状。

“++++”：液体完全透明（100%清亮），100%菌体凝集，管底出现大片的伞状沉淀，振荡时呈大絮片状，但可打碎成小絮片状。

血清的效价就是呈现50%凝集（即“++”反应）的最高血清稀释倍数。

需要注意的是在血清倍比稀释过程中，力求准确。

一是防止液体溢出管外，二是在连续吹吸3次混匀液体时，第2次吸入移液管中的液体高度不能低于第1次，最好是每一稀释度换一支洗净的移液管。

试管水浴或静置后，观察前不宜摇动振荡，以免影响实验结果的准确性。

五、思考题
记录实验结果，试讨论影响试验结果的因素有哪些？
实验二沉淀反应
一、目的要求
学习和掌握沉淀反应的原理及双向琼脂扩散沉淀反应方法。

二、实验说明
可溶性抗原（细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液、病毒、血清、组织浸出液等）与相应抗体结合，在适量电解质存在下，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。

所用抗原称为沉淀原，抗体称为沉淀素。

沉淀反应的抗原可以是多糖、蛋白质、类脂等，抗原分子较小，单位体积内所含的量多，与抗体结合的面积大，故在做定性实验时，常出现抗原过剩，形成后带现象，所以通常稀释抗原，并以抗原稀释度为沉淀反应效价。

三、实验材料
1．试剂可溶性抗原（牛血清白蛋白）、兔抗牛血清白蛋白血清、生理盐水（0.85%NaCl）。

2．器材及其他平皿、移液管、不锈钢吸管等。

四、方法步骤
1．环状沉淀反应
（1）取1:25的牛血清白蛋白l ml，用生理盐水以倍比稀释法稀释成1:50，1:100，1:200，1:400，1:800，1:1600，1:3200的抗原溶液。

（2）取9支洁净干燥的小试管，每支小试管加入1:2的兔抗牛血清白蛋白血清0.5 ml。

（3）用移液管吸取上面已稀释好的牛血清白蛋白（抗原），按表11-2要求，从最大稀释度开始，沿着管壁徐徐加入各小试管中，使之与下层抗体之间形成交界面，切勿摇动混匀，第8管加入生理盐水、第9管加入兔抗血清以作对照。

（4）静置15～30 min，观察在两液面交界处有无白色环状沉淀物出现。

（5）结果记录凡有白色环状沉淀物者记“+”，没有沉淀者记“-”。

最大稀释度的抗原与抗体交界面之间还出现白色环状沉淀者，此管的抗原稀释倍数即为抗体（沉淀素）的效价。

表2环状沉淀反应记录表
试管 1 2 3 4 5 6 7 8 9
抗体（1:2）（ml）抗原稀释度
抗原用量（ml）0.5
1:50
0.5
0.5
1:100
0.5
0.5
1:200
0.5
0.5
1:400
0.5
0.5
1:800
0.5
0.5
1:1600
0.5
0.5
1:3200
0.5
0.5
盐水
0.5
0.5
兔血清
（1:50）
0.5
结果
2．双向琼脂扩散沉淀反应
（1）称取1 g优质琼脂于l00 ml pH7.2的生理盐水中，在沸水中水浴使琼脂溶化后，
加入1%的硫柳汞l ml防腐。

每块载玻片（7.5 cm×4.5 cm）滴加4 ml琼脂溶液，待凝固后用不锈钢吸管在两端(A、B端)打梅花形小孔（如图1），孔径和孔距均为3 mm。

亦可直接用不锈钢管打孔，再用接种针挑去梅花形孔中的琼脂块。

（2）在A端梅花形孔中，用玻璃毛细吸管在中心孔中加入适当稀释的抗血清（抗体），注意要使孔加满，但不外溢；周围孔加入不同稀释度的抗原（例如1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320）。

A B
图1 双向琼脂扩散沉淀反应
在B端梅花形孔中，同样在中央孔中加入适当稀释度的抗原，周围的孔中加入不同稀释度的抗体。

（3）把以上载玻片放入带盖的铝盒中，下面垫上3～4层湿纱布，置37℃扩散24～48 h，可看见抗原和抗体反应处呈现的沉淀线。

（4）记录结果注意沉淀线数目及偏向。

需要注意的是在进行环状沉淀反应实验时，一定要沿着管壁加入抗原，而且切勿摇动，否则影响沉淀环的形成。

双向琼脂扩散试验时，抗原或抗体的稀释度多少才合适，必须进行预试验测定，否则由于抗原、抗体比例不合适而造成假阴性。

五、思考题
记录实验结果，讨论沉淀反应有哪些用途？
实验三淋巴细胞的分离试验
一、实验目的
掌握密度梯度离心分离淋巴细胞的方法；了解淋巴细胞分离在免疫学实验中的重要性与用途。

二、实验原理
在免疫学实验中，尤其是细胞免疫实验中，经常需要从外周血中分离出淋巴细胞。

可以说，淋巴细胞分离技术是细胞免疫实验最基本的技术。

分离淋巴细胞有方法有很多，本实验介绍的是淋巴分离液分离法即密度梯度离心法。

淋巴细胞与单核细胞的比重为 1.075～1.090，而红细胞与分叶核白细胞的比重为1.092。

淋巴细胞分离液的比重为1.077±0.001，与淋巴细胞比重相同，而红细胞较之为重，通过离心，即可将淋巴细胞分离出来。

三、材料
1、淋巴细胞分离液；
2、无Ca2+、Mg2+ Hank’s液
NaCl 4.00g
NaHCO30.175g
KCl 0.20g
Na2HPO4.12H2O 0.076g
KH2PO40.030g
葡萄糖0.50g
H2O加至500.00ml
用5.6％NaHCO3调pH至7.2，115℃15min灭菌。

4℃贮藏备用。

3、注射器、吸管、离心管或试管、秤样天平、水平离心机等。

四、方法步骤
1、静脉抽血2～3ml，肝素抗凝；
2、用PH7.4的Hanks液将血液稀释1倍；
3、取比重1.077的淋巴细胞分离液3～4ml，放入离心管中；
4、用吸管吸取稀释血液，在距分层液上1㎝处沿管壁缓慢加入，使稀释血液重叠于分层液上，勿将液面冲破。

稀释血液与分层液体积比例约为2：1；
5、置水平离心机中、2000r/min离心20min。

离心之后见管中分4层，上层为血浆及Hanks液；第二层为外周血单个核细胞（PBMC）层，主要为淋巴细胞，少量单核细胞，呈一层较厚的白膜；第三层为分层液；最下面为粒细胞和红细胞。

（见图2）
6、用毛细吸管轻轻插到白膜层，沿管壁周缘吸出淋巴细胞层，移入另一试管中，此时已将淋巴细胞分离出。

7、吸出的淋巴细胞加一定量的Hanks液（4～5ml），充分混匀，1500r/min，弃上清，同法洗涤2～3次。

8、根据需要计数并调整细胞浓度。

五、结果观察
图2 淋巴细胞分离液分离结果
淋巴细胞分离前淋巴细胞分离后
血浆、Hanks液
抗凝血
PBMC层（主要为淋巴细胞）
淋巴细胞分离液
淋巴细胞分离液
粒细胞和红细胞
六、注意事项
稀释血液应沿管壁缓慢加入在分层液上；
离心2000r/min离心不能少于20min；
离心管平衡。

七、思考题
1、分离出淋巴细胞后可进行哪些方面的实验？
2、淋巴细胞分离过程中应特别注意哪些步骤？
附：淋巴细胞分离液中淋巴细胞形态观察
[材料]
1、微量加样器、吸头；
2、载玻片；
3、瑞士染液；
4、缓冲液。

[方法]
用微量加样器轻轻插到白膜层，沿管壁周缘吸出淋巴细胞层、加1滴于载玻片上涂开；
涂片自然干燥后，加瑞士染液5~7滴，固定30秒钟后加等量缓冲液染色8~12分钟；
小量流水从上往下冲洗干净，甩干余水，用滤纸吸干，油镜观察淋巴细胞形态。

[注意事项]
取材应采集到淋巴细胞层；
瑞士染液时间应随瑞士染液配置时间而定。