高三生物一轮复习PCR知识总结

高考生物PCR的过程及应用考点归纳总结
一、基础考点
1.名称：多聚酶链式反应
2.原理：DNA双链复制（DNA的半保留复制）、DNA的热变性原理
3.前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列
4.过程：PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：会解释三个步骤
①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链
②复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链结合；
③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸再耐高温的DNA 聚合酶的作用下，根据碱基互补配原则合成新的DNA链
④重复：第一轮循环的产物作为第二轮的模板：重复循环变性—复性--延伸三过程。

5.PCR反应体系的成分及作用
DNA模板：从样本或细胞中提取的微量总DNA
原料∶dNTP（dATP、dGTP、dCTP、TTP），提供原料和能量
酶∶Taq聚合酶（热稳定DNA聚合酶，从嗜热菌中分离得到）
引物∶一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸
（注意：引物与目的DNA片段两条母链各自的3’端序列互补）
Mg2+：维持酶活性所必需
PCR缓冲液∶维持pH，保护Taq酶
6.DNA在体内复制的条件
模板∶DNA分子的每条链
酶∶解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶
原料、能量∶dATP、dGTP、dCTP、dTTP
引物∶RNA引物，温和的反应条件
7.总结：PCR与体内DNA分子复制的不同点：
PCR DNA复制复制起点无有
复制叉无有
场所及条件体外；
控制3个不同温度体内细胞核、线粒体、叶绿体；温和条件
步骤变性、退火、延伸起始、延伸、终止
酶Taq酶解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶引物2种，一小段与DNA母链的
一段碱基序列互补配对的
短单链DNA；人工合成
多种RNA做引物；自行合成
引物是否去除否是
变性的条件90℃以上的高温解旋酶
结果短时间内快速扩增目的基
因片段
复制完整的DNA分子
特点
半保留复制
两条链连续合成半保留复制半不连续复制
8.PCR技术在基因工程中的应用：
（1）特异性、快速扩增目的基因获取目的基因（2）目的基因的检测与鉴定
9.用PCR技术可以扩增mRNA吗？
不可以；在逆转录酶的作用下，需以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则合成cDNA再进行扩增
10.提取mRNA扩增目的基因的过程：
第一步：逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子
第二步：核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；
第三步：以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子
第四步：以双链DNA分子为模板，经过③变性、④复性、⑤延伸，循环扩增形成目的基因产物
11.cDNA中缺少真核生物基因的哪些结构：
启动子、内含子、终止子
12.目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是：Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
13.PCR产物的影响因素：模板DNA的量、脱氧核苷酸的量、引物的量、酶的数量和活性、循环次数、Mg2+的浓度
14.PCR后期，反应速率下降的原因：酶的活性降低、引物和dNTP浓度降低、反应产物增多
15.变性温度过低会导致双链不能充分解开；
16：PCR扩增中预变性的目的：
预变性破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。

使DNA充分变性解旋为单链,有利于引物与模板的正确结合
17.PCR反应体系实际操作时，加入的是4种脱氧核苷三磷酸（dATP dGTP dCTP dTTP）,每掺入一个核苷酸，伴随着两个特殊化学键（高能磷酸键）的断裂，由此释放的能量满足核苷酸聚合反应的需求
18.内参蛋白的作用：排出细胞取样、实验操作等对实验结果的影响
（内参蛋白是用来确保蛋白上样量一致性，量化目的蛋白的表达情况，是对实验结果定量分析或定性比较的重要标尺）
19.内参蛋白的选择：细胞内稳定存在和高表达的蛋白质
二、有关引物的考点总结：影响PCR的各种因素中，引物的设计最为重要
1.引物的作用：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA链
2.需要引物的原因：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA 链，因此DNA的复制需要引物
3.设计两种引物的原因：基因的两条反向平行链都做模板，其碱基序列不同，且DNA聚合酶只能从3’端延伸子链，用2种引物才能确保DNA两条链同时被扩增
4.需要大量引物的原因：子链是在引物的引导下合成的，引物随子链DNA数量的增多而被消耗
5.需要引物的数量：（2n-1)×2
若扩增4次，共产生16个DNA时，消耗30个引物。

6.PCR扩增的产物的特异性：由引物的特异性决定；引物是根据目的基因两端的核苷酸序列设计的
例：PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是有一段已知干扰素基因的核苷酸序列。

（2020山东高考）通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出Wx基因的cDNA，例：
原因是________________________________________。

答案：引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的（或：引物能与Wx基因的cDNA特异性结合）
7.两引物间固定长度(等长)的DNA序列在PCR扩增3次后首先出现
8.复制方向:是沿子链5’→3’，从引物的3’端延伸子链
9.）如果需要在引物上加限制酶的识别序列：需要在引物的5’加
10.在引物的5’端设计两种限时酶识别序列的原因：便于目的基因和载体的定向正确连接
注：
（1）引物的5'端可以修饰，引物的5'端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。

因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。

引物5'端修饰包括：加酶切位点，加标记荧光，引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。

（2）引物的3'端不可修饰；引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。

11.设计引物时，引物自身不能有碱基互补配对的序列：避免引物自连，不能得到目的产物
12.设计引物时，两引物之间不能有碱基互补配对的序列：防止两引物之间结合形成双链，降低引物与DNA模板链结合的效率
13.引物设计不能太短：防止非目的基因的获得
例：为方便构建重组质粒，设计引物时需要增加适当的_________位点。

设计引物时需要避免引物之间形成_______________________，而造成引物自连。

(答案：限制酶碱基互补配对)
例：为便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的_______端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是_____________________________________________。

（答案：5，使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连）
14.复性的温度取决于：引物的长度、碱基组成、浓度及靶基因序列的长度。

如果引物中GC含量较高，可适当提高退火温度
15.复性温度过高，得不到产物的原因：引物不能稳定的与模板结合
16.延伸温度过高不利于引物与模板链的结合；
17.延伸的时间根据待扩增片段长度而定，延伸时间过长会导致非特异性扩增。

例：进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中____的设定与引物有关，____的设定与扩增片段的长度有关。

①变性温度②退火温度③延伸温度
④变性时间⑤退火时间⑥延伸时间
答案：②⑥
18.退火温度过高会导致引物不能充分与模板链结合，导致目标产物的量减少
三、PCR技术与电泳技术结合的相关考点总结：选择性必修三P84
1.方法：琼脂糖凝胶电泳—鉴定并分离DNA
2.原理：DNA具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。

在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动
3.迁移速率的影响因素：凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象
（1）凝胶浓度：凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，DNA迁移受到的阻力越大，速率越慢，离点样孔越近；根据分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配置琼脂糖溶液，浓度0.8%-1.2%（琼脂糖溶液加热融化、冷却后加核酸染料）。

（2）DNA分子的大小：DNA的分子量越大，迁移速率越慢，离点样孔越近
（3）DNA分子的构象：
具有三种构像的质粒在琼脂糖电泳的前后顺序：环形超螺旋>线形>开环；
环形超螺旋（DNA两条链都是完整的质粒，就是超螺旋），结构紧致，受到的阻力小，迁移速率最快；完全断裂的线性DNA，迁移速率次之；环形松弛（DNA双链断了一条，质粒DNA就失去超螺旋，成为松弛的环），迁移速率最慢
4.仪器：PCR仪、微量离心管、微量可调移液器、电泳装置（电泳仪、水平电泳槽等）
试剂：购买的PCR试剂盒、配方参考教材或试剂盒说明书
电泳试剂：电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖、核酸染料等
5.步骤及注意事项：
★步骤：
1.用微量移液器按照右栏中的配方活PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各种组分。

PCR反应体系的配方
10倍浓缩的扩增缓冲液5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液1μL
20mmol/L引物Ⅰ 2.5μL
20mmol/L引物Ⅱ 2.5μL
O28~33μL
H
2
1~5U/μL的TaqDNA聚合酶1~2U
模板DNA5~10μL
总体积50μL
注：模板DNA的用量为1pg~1μg
2.待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。

将微量离心管放入离心机，离心约10s，使反应液几种在管的底部
3.按照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。

将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。

循环程序变性复性延伸
预变性94℃，5min//
30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min
最后1次94℃，1min55℃，30s72℃，1min
4.根据待分离的DNA片段的大小，用电泳缓冲液配置琼脂糖溶液，一般配置质量体积比为0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。

在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。

稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。

5.将温热的琼脂糖溶液迅速导入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。

6.待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。

7.将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。

8.将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。

留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。

9.接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一半1～5V/cm。

待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。

10.观察电泳鉴定结果：取出凝胶至于波长为300_nm的紫外灯下观察并照相。

★注意事项：
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。

2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。

使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。

3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。

4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。

★结果分析：
一次性成功的DNA片段扩增应该产生与预期大小一致的DNA片段。

若出现与预期不一致的结果，可尝试从以下几个方面进行分析：模板DNA的制备、引物的质量与特异性、酶的质量以及PCR循环的条件。

1.未出现扩增条带的原因：
（1）模板：模板DNA含有杂蛋白或Taq酶的抑制剂、模板DNA污染。

若反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加Taq酶以前，将反应体系95℃加热5~10分钟。

（2）酶：Taq酶失活或在反应体系中未加入酶。

（3）引物：引物特异性不强，浓度不合适。

检查引物特异性或重新设计引物；引物浓度过高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

（4）变性温度是否准确：过高酶在前几个循环就迅速失活；变性温度低，变性时间短则模板变性不彻底。

（5）Mg2+浓度过低，扩增的产物过少；
（6）4种dNTP浓度过低，扩增的产物过少；
（7）目的序列变异
2.扩增产物出现多条带（杂带）的原因：
（1）模板：模板DNA污染。

确保操作的洁净。

（2）酶：酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。

（3）引物：引物用量偏大，引物的特异性不高，或形成引物二聚体，特别是引物的3′短互补，易形成引物二聚体，产生非特异性扩增条带；
（4）复性温度偏低，复性及延伸时间偏长：应提高复性温度，减少变性与延伸
时间
（5）Mg2+浓度过高，反应特异性降低，会引发非特异性扩增
（6）4种dNTP浓度不相等：任意一种浓度过高或过低，都会引发错配，扩增的产物过少；
（7）循环次数过多
（8）延伸时间过长会导致非特异性扩增
★对照的作用：
阳性对照：用于检测PCR体系是否正确及扩增效率，确保不是DNA凝胶和PCR程序的问题
阴性对照：用于检测是否存在含有目的序列的DNA污染
阴性对照出现条带：试剂，枪头，工作台污染。

四、DNA片段的扩增及电泳鉴定实验的问题串
1.PCR扩增的原理：
2．DNA分子带电的原因：
3.DNA在电场中的移动方向：
4.PCR产物鉴定方法：
5.凝胶中DNA分子迁移速率的影响因素：
6.凝胶中DNA用什么染色：
7.凝胶中DNA的检测：
8.实验器材、试剂：
9.PCR反应体系的配方：
加入的顺序：
10.各种组分加入什么器材中？操作时应注意什么？
11．依据什么配置琼脂糖溶液？用什么配置琼脂糖溶液？体积比一半为多少？
12.配置好的琼脂糖如何操作？能否加热后直接加入核酸染料？
13.向模具中倒琼脂糖的注意事项？如何制作加样孔？
14.什么时候拔出梳子？凝胶制备成功后放入什么溶液中？
15．电泳槽中的液体是什么？深度如何？
16.加样孔中加什么？用什么仪器加入？注意什么？能否将所有的加样孔都加满？
17.标准参照物是什么：
18.根据什么设定电压？一般为多少？什么时候停止电泳？
19．取出凝胶后如何观察：
20．PCR使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等如何处理？目的是什么？
21.缓冲液和酶应该如何储存？使用前如何操作？
22.向离心管中添加组分时，移液器的枪头是否需要更换？是否吸取一次后就更换？
23.操作时，手部如何处理？
五、判断
1.在溶有DNA的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色()
2.DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精()
3.进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验所需的缓冲液和酶应分装成小份，并在20℃储存()
4.在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关()
5.为了节约资源，移液器上的枪头在实验过程中不必更换()
6.PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化（）
7.进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动（）答案：×√×××××。