外周血的NK细胞分离培养

外周血的NK细胞分离培养
1.样本采集
常规操作采集患者外周血，避免样本污染。

2.细胞分离
超净工作台中，分装血样于50mL离心管中，取全血样1mL计数（3mL全血留样）。

2000rpm离心10min，取上层血浆于50mL离心管（1.5mL未灭活血浆留样）。

56℃灭活30min，3000rpm离心10min，去沉淀后4℃保存上清。

生理盐水1:1稀释混匀血细胞，缓慢加到装有Ficill的离心管内（界面清晰，血样：Ficoll不超过2:1），1600rpm离心20min。

吸弃上清，吸取白膜层到离心管，加生理盐水至45mL，混匀后1500rpm离心10min。

吸弃上清，生理盐水重悬后合并一管，加生理盐水至45mL。

混匀，取样计数计算细胞总量，1800rpm离心10min。

参照试剂盒说明书配置培养液、滋养细胞液。

3.细胞培养（山东齐鲁细胞治疗NK细胞培养试剂盒）
0d，T75培养瓶接种：30mL细胞悬液+NK-1试剂[2]+5%自体血浆，37℃，5.0%CO
2培养箱培养。

（接种密度1.0-1.5*106/mL）
3d，离心换液：T75培养瓶中细胞转移至50ml离心管1600 rpm/min升6降4离心10min去除上清。

细胞沉淀+NK细胞培养液（30mL）+5%自体血浆于新T75培养瓶。

5d，转移到T175培养瓶，细胞状态好，加培养液到50mL（5%自体血浆）。

6d，观察细胞，细胞状态好，加培养液到120mL（5%自体血浆）。

7d，观察细胞长势，装袋并添加1支NK-2试剂[2]，加培养液到220mL（1%自体血浆），菌检。

8d，加培养液到500mL（1%自体血浆）。

9d，加培养液到1000mL（1%自体血浆）。

10d，加培养液到1400mL（1%自体血浆）。

11d，加培养液到1600mL（1%自体血浆）。

12d，加培养液到1800mL（1%自体血浆）。

13/15d，根据细胞长势及临床安排收获细胞。

计数计活及流式检测。

[1]:NK细胞培养液：1支D试剂、1支E试剂溶解到1瓶C试剂中。

[2]:NK-1、NK-2试剂为滋养细胞，须严格按照常规细胞的保存及复苏标准操作，使用前需离心去除上清才能共培养。

预实验数据：。