核酸适体及其在疫病诊断中的应用

核酸适体及其在疫病诊断中的应用
祖立闯;王金良;李娇;沈志强
【摘要】核酸适体是采用指数富集配体的系统进化技术从随机单链寡核苷酸库中筛选出的能与靶物质高特异性、高亲和力结合的配体.因其具有亲和力高、特异性强、精确识别、易体外合成与修饰等优点,逐渐成为抗体的代替或补充试剂,已成功应用于生物芯片、生物传感器、分子信标等多种疫病诊断技术平台,显示出了良好的应用前景,在未来的疫病诊断中将发挥越来越重要的作用.论文就适体技术及其在疫病诊断中的应用进展进行综述.
【期刊名称】《动物医学进展》
【年(卷),期】2011(032)007
【总页数】5页(P80-84)
【关键词】核酸适体;指数富集配体的系统进化技术;疫病诊断
【作者】祖立闯;王金良;李娇;沈志强
【作者单位】山东绿都生物科技有限公司,山东滨州256600;山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600;山东绿都生物科技有限公司,山东滨州256600;山东绿都生物科技有限公司,山东滨州256600;山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600
【正文语种】中文
【中图分类】S854.4
随着生物技术的发展,人们意识到 DNA和RNA不仅是遗传信息储存和传递的载体,还可以借自身折叠形成特定的空间结构与其他类型的分子相互作用。

指数扩增富集配体的系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)是20世纪90年代初新出现的一种化学组合筛选技术,由Tuerk C和Gold L在1990年首次提出[1],从而开启了一个研究蛋白质与核酸相互作用的崭新时代[2-3]。

SELEX技术是指应用化学法合成大容量的随机寡核苷酸由两端的固定序列和中间几十个碱基的随机序列组成文库,通过施加选择压力,并结合体外扩增技术,经过多轮的循环选择富集,获得与靶物质高度特异结合的寡核苷酸分子,可以是RNA也可以是DNA,长度一般为25个～60个核苷酸[4-5]。

SELEX技术筛选得到的寡核苷酸序列被称为适配子(aptamer),国内将其翻译为核酸适体、核酸适配子、核酸识体和核酸适配体等。

适体的出现,使得筛选能识别各种靶物质并能与靶物质具有高亲和性、高特异性结合的反应物成为可能[6]。

20多年来,SELEX 技术得到不断的发展和成熟,筛选到的核酸适体不断被应用于生命科学各个领域的研究中[7-11]。

适体在疫病诊断方面的应用虽然起步较晚[12],但发展迅速,本文就适体技术及其在疫病诊断中的应用现状及发展前景做一简要综述。

SELEX首先根据分子生物学技术,人工合成单链随机寡核苷酸文库,文库的两端为固定序列,中间为长度约25个～30个核苷酸随机序列。

寡核苷酸随机区的每个核苷酸种类都存在4种可能性(A、C、G、T),如果随机区有n个核苷酸,那么随机序列的多样性有4n种。

随机区域长度为30个核苷酸左右的文库容量就能达到1014-15[13]。

单链寡核苷酸易通过G-C、A-T配对(RNA中还存在G-U配对)形成各种形状的极其稳定的二级结构和三级结构,如发卡(hairpin)、茎-环(stem-loop)、G-四聚体(G-tetramer)、假节(pseudoknot)、鼓包(bulge)等 ,这些结构通过静电作用、氢键作用、构型互补等形式与靶物质相互作用,或嵌合,或包被,形成稳定的核酸-靶物质复合物[3]。

适体与配体间具有较大的接触面积,能形成许多潜在的结合位点,
这一优势使适体甚至能识别配体间一个基团的细微差别,因此其在理论上具有很高的特异性。

适体识别蛋白质靶序列的过程与抗体类似,不同的是,抗体以初结构去识别抗原决定簇,而适体则折叠成紧密的结构,嵌进蛋白质表面的裂缝中,这种作用机制就好比蛋白质上形成“口袋”,适合该“口袋”的结构嵌进,而其余的结构终将被洗掉[14]。

文库中核苷酸随机序列的多样性决定了寡核苷酸立体构象的多样性,容量为1014-15的巨大文库所蕴含的丰富的核苷酸立体构象几乎模拟了自然界存在的所有可能与靶物质相互作用所利用的空间结构,因此理论上应用SELEX技术能筛选到自然界几乎所有靶分子的适体。

SELEX筛选过程起始于化学合成的DNA或RNA随机序列库,随机序列两端是带有限制性内切酶位点的固定序列,此固定序列是多聚酶链反应及其他酶学反应相关引物的结合位点[4.13]。

随机序列不能太短,太短可能导致没有足够的二级结构同靶分子结合;也不能太长,太长可能由于全套文库单链寡核苷酸序列一定,导致降低了选择分离出来的配基概率。

RNA随机序列库由DNA序列库逆转录而来,如采用 RNA 随机序列库,预先应将RNA多聚酶启动子序列(如T7 RNA多聚酶结合序列)引入5′端固定序列中以便体外逆转录合成DNA[15]。

在特定缓冲体系和选定的温度下随机序列与靶目标混合温育,此步中可以同靶物质亲和作用的特异性序列非常少,只有通过物理方法分离出结合序列。

如靶目标是大分子如蛋白质,通常用硝酸纤维素膜截留与靶蛋白质分子结合的序列;或预先用生物素修饰靶蛋白质分子,再用表面包被有链亲和霉素的磁珠捕获核酸-蛋白复合物。

对于小分子靶目标如核酸、多肽等,预先将其固定到固相支持物上制成亲和基质,通过简单的洗脱即可以达到纯化目的[16]。

侯选序列的DNA片段和 RNA片段,可分别通过PCR或RT-PCR扩增,生成次一级文库,再开始下一轮筛选。

随着每一轮筛选严谨度的不断增加,低亲和力序列逐渐被淘汰。

严谨度与温度、pH、金属离子、靶目标浓度等有关,在每一轮筛选中都应进
行平行的亲和力检测实验,最后一轮富集侯选库中90%以上的序列都是能与靶分子特异结合的适体序列。

约经10轮～15轮筛选后,可获得与靶物质特异性高亲和力
结合的适体[17]。

最后一轮扩增产物进行克隆、测序,并鉴定所筛选的核酸适配子与靶分子结合的特
异性和亲和力,也可通过后续实验验证所得适配子与靶分子结合的最短序列[18]。

抗体是目前进行分子识别的主要物质,广泛应用于疾病的诊断。

适体与靶物质的结
合类似于抗原-抗体反应,其功能类似于抗体,但具有抗体无法比拟的优越性。

适体可以对靶物质进行定量检测,凡是涉及抗体的诊断方法,几乎都可以用适体代替,与抗体可以对抗原进行定量检测一样,适体也可以对靶蛋白进行定量检测[5]。

适体作用的靶分子远多于抗体,原则上自然界中所有物质都可以通过SELEX技术筛选出相应的适体,包括金属离子、有机分子、抗生素、核酸、多肽、蛋白质、细胞、病毒颗粒、大分子聚合物等。

与抗体相比,适体作为检测分子应用范围更广,特别在
抗原性弱的蛋白及非纯样品检测中有明显优势[2]。

适体的二级结构能够分辨出靶分子结构上细微的差别,能识别靶物质上一个甲基、
羟基或一对映结构体的细微结构。

适体可能更适用于单克隆抗体难以区分的结构类似物或交叉抗原的鉴别诊断[12]。

适体的获得是根据每一适体与其相对应靶物质结构的亲和力不同而得到的,适体与
靶分子间的结合具有比抗原抗体结合更高的亲和力,它们作用的解离常数可达nmol 甚至pmol水平,可以完全不受组织或样品中非靶蛋白的干扰[7]。

适体为寡聚核苷酸片段,可进精确的位点修饰,且修饰后的适体保持原有的生物学活性。

为了增加适体的功能,提高它在临床诊断中的应用,可以进行广泛的位点特异性
修饰用以提供报告分子和效应分子[19]。

例如适体可以被荧光素、放射性同位素、生物素标记,还可以与放射性核苷酸、细胞毒素相连。

适体变性与复性可逆且速度快,变性的适体可在数分钟内再生,因而可反复使用,可长
期保存和在常温下运输,这对诊断试剂都是极其有利的[13]。

而抗体易发生不可逆
变性,对温度敏感需低温运输。

随着 SELEX技术的不断完善和自动化的实现,适体的筛选周期越来越短,一个适体的筛选和制备只需2～3个月时间,而制备抗体至少需要3～6个月。

筛选出的适体可通过PCR技术大量扩增,有极佳的准确性和重复性,几乎消除了制备的批间差异[5]。

适体是在体外筛选的,不需经过体内(动物、细胞)体系,可根据实验要求设定筛选条
件来改变特性,从而实现适体与靶分子结合条件的调控。

而抗体筛选是在动物体内
或培养细胞条件下进行的,很难对抗体与靶分子的结合进行调控[9]。

筛选过程在体外而不在动物体内进行,靶物质的免疫原性强弱不影响其适体的筛选,
适体无免疫原性,体内不产生免疫反应,可用于体内诊断[20]。

适体(8×103～15×103)比抗体分子小,易于通透细胞膜进入细胞内,可以检测细胞内的靶分子,可用于细胞内诊断[19]。

核酸适体与靶物质结合所呈现的高敏感性和高特异性,使其在疾病诊断中具有良好
的应用前景,尽管目前成熟的临床应用报道很少,但应用适体检测靶蛋白的研究却不
断增多,基于适体的检测新技术也不断出现。

Horii K等利用SELEX技术筛选到了针对神经鞘氨醇磷酸胆碱(sphingosylphosphorylc holine,SPC)且与分磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)无交叉反应的特异性RNA适体,为研制基于RNA适体的SPC医
学诊断及阐述SPC的生物学功能提供了有价值的工具[21]。

Yoon S筛选到了针对衣壳蛋白的2个RNA适配子,通过电泳迁移率变动分析(EMSA)和表面等离子体共
振分析(SPR)表明RNA适配子具有较高的亲和力和特异性,且可以中和PCV-2在
PK-15细胞的感染,提出中和适体成为PCV-2检测试剂和抗PCV-2有效治疗药物
的候选者[22]。

Joshi R等[23]筛选到了5株针对沙门菌的特异性DNA适体,为食
品和环境样品中沙门菌的检测提供了基础。

Gopinath S C等[24]筛选到了针对B
型流感病毒血球凝集素蛋白的适体,该适体与B型流感病毒血球凝集素蛋白无交叉反应,为流感病毒的分型诊断提供了基础。

在国内,李卫滨等[25]运用SELEX技术采用了生物素-链亲和素磁珠分离法制备次级文库,从合成的随机ssDNA文库中筛选到针对CsA的特异性适体,为小分子物质适体的筛选提供一个技术平台,也为建立检测全血CsA浓度的快速而简便的实验室诊断方法奠定基础。

王立峰等[26]通过体外7轮筛选获得癌胚抗原(CEA)特异性适体,证实所获得的CEA适体可特异性地与纯化CEA和天然状态的 CEA蛋白结合,为后续高表达的CEA肿瘤的靶向诊断和治疗奠定了实验基础。

詹林盛等[27]利用重组的HCV核心蛋白为靶蛋白,从随机单链DNA文库中筛选出了较强结合活性的HCV C蛋白特异寡核苷酸适体,并对其结构进行了初步分析,为HCV C蛋白抗原检测和以C蛋白为靶位的抗HCV治疗奠定基础。

马占忠等[28]建立了以微孔板为筛选介质,生物素-链亲和素-辣根过氧化物酶显色系统测定亲和力的方法,该设计基于较成熟的ELISA技术之上,操作简便、易于自动化,具有较好的推广价值,为MTB的临床诊断提供了新的思路和方法。

甘龙杰等[29]利用SELEX技术,筛选能与金黄色葡萄球菌外毒素B(SEB)特异、高亲和力结合的ssDNA适体(A11),并运用该适体初步建立酶连接适体检测方法,通过对临床6例患者血清标本的检测,得出获得的ssDNA适体针对SEB的特异性强,能识别SEB患者血清,提出酶连接适体的检测方法简便、快速、灵敏,具有很好的应用前景。

“三明治夹心法”原用于抗体检测技术,基于抗体的诊断模式中以双抗体夹心法最为常用,其中一个抗体为捕捉分子,另一抗体为检测分子。

核酸适体检测靶物质时也可借鉴这种模式。

将一个适体的末端交联到一个固相上作为“捕获者”,去捕获待测标本中的靶物质,另一个适体的5′端标有相应的指示剂,如:荧光素、生物素、放射性同位素等,这种适体称之为“报告者”。

当“报告者”与相应的待测标本结合后,就会有相应的信号产生。

Austin M A等[30]将2个适体同时作为捕获分子和检测分子进行双位点结合实验。

Ahn D G等[31]筛选到了针对SARS N蛋白的 RNA适
体,可以特异性的结合N蛋白C羧基末端,以此适体为捕获抗原试剂,建立了检测SARS N蛋白的适体-抗体免疫测定法,可检测SARS N蛋白最低浓度为2 pg/mL,提出建立的适体-抗体免疫测定法将成为SARS的敏感、特异的检测方法。

Yan X R等[32]利用筛选到的2株RNA适体,建立了检测细胞因子的酶联适体测定法(ELONA),通过与ELISA的对比后发现,ELONA更加敏感、最低检测下限为100 pg/mL,为细跑因子的检测提供了极其敏感、特异的检测方法。

流式细胞术(flow cytometry,FCM)是借助流式细胞仪检测细胞等单分散颗粒的高通量细胞生物学分析方法,流式细胞术检测时常用荧光标记适体进行染色,以获得靶标分子的信息,识别不同靶标亚群。

以往的流式细胞术是通过不同颜色的荧光素标记单克隆抗体来实现的,基于抗体流式细胞技术存在一定局限,抗体分子较大,不易进行细胞内结合,与Fc受体存在非特异性结合,核酸适体的应用可在一定程度解决这些问题,提高检测的可靠性,促进流式细胞术检测的推广应用。

Davis K A等[33]首次报道了适体用于流式细胞术检测的研究,他们筛选到了与中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,HNE)高亲合力结合适体能象抗HNE荧光标记抗体一样地有效检测HNE包被的微珠。

证实了适体代替抗体用于流式细胞术检测的可行性。

作为有效的生物识别片段,核酸适体在光学生物传感器、电化学生物传感器及压电生物传感器等多种传感器检测平台上得以应用。

Lee M等[34]将凝血酶特异性适体应用于光纤生物传感器,缩短了检测时间,每次检测不超过15 min。

Liss M 等[35]将IgE适体应用于石英蛋白生物传感器,可对IgE定量检测,并通过传感器对适体与IgE亲和力进行测定,发现适体能够耐受反复的亲和洗脱等过程,且传感器的灵敏度几乎没有降低[35]。

分子信标(molecular beacon)是近年发展起来基于荧光共振能量转移现象的检测技术。

Li J J等[36]建立的适体分子信标(moleculptamer beacon,MAB)技术,用于凝血酶检测。

Fang X等[37]将针对血小板来源生长因子(platelet derived growth
factor,PDGF)β链的适体两端分别连接荧光基团和荧光淬灭基团,可以在体液或细胞培养液中检测到pmol/浓度的PDGF。

Bruno J G等[38]筛选到了针对FMDV VP1的特异性适体,并建立了检测口蹄疫病毒的定量的竞争性荧光共振能量转移(FRET)方法,可在10 min内定量检测到脏器内25 ng/mL～250 ng/mL的口蹄疫病毒,为口蹄疫的快速诊断提供了一种极其敏感、特异的定量检测方法。

抗体为临床检测和治疗提供了物质基础,并且成为目前临床检验不可缺少的部分。

随着SELEX技术的出现,提供了分离能识别各种各样靶物质并对相应靶物质具有高亲和力和特异性寡核苷酸适体的可能性。

这些称之为“适体”的寡核苷酸片段,开始在治疗与检测方面与抗体竞争。

凡是涉及抗体的诊断领域,几乎都可以用适体代替,特别是可以弥补抗体在诊断领域中应用的不足。

在双位点结合试验模式中已有研究表明,适体比单克隆抗体更适于难以区分的结构类似物或交叉免疫反应的鉴别诊断;在分子信标模式中,一般分子信标只能用于核酸的检测,而新建立的适体分子信标可以用于非核酸物质如蛋白质的检测。

此外,适体在毛细管电泳、流式细胞术、荧光偏振等分析模式中都发挥着非常重要的作用;在传感器方面,与抗体介导的免疫传感器相比,适体的特点是亲和力高、特异性强、靶分子范围广、且稳定性好、可快速变性复性、能反复使用、容易制备、便于长期保存和运输。

但核酸适体作为诊断试剂仍处于发展阶段,尤其应用于体内诊断仍有一些问题需要解决,大规模应用还需一段时间;尽管目前还没有适体毒副作用的报道,但各种修饰适体安全性需要进一步证明。

有研究表明,经体外筛选获得的核酸适体在体内实验中可能会失效[39]。

总之,与比较成熟的抗体技术相比,适体技术还处在发展的初级阶段,但它正以飞快的速度不断完善自己。

核酸适体作为检测试剂的市场,将随着人们对它的不断认识,开发前景会越来越好。

【相关文献】
[1]Tuerk C,Gold L.Sy stematic evolution of ligands by exponential enrichment:RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase[J].Science,1990,249(4968):505-510.
[2]侯玥,魏磊,吴军,等.核酸适配子在生物医学领域中的应用[J].中国实验诊断学,2010,14(6):965-968.
[3]Djordjevic M.Inferring protein-DNA interaction parameters from SELEX experiments[J].Methods M ol Biol,2010,674:195-211.
[4]Gold L.The SELEX process:a surprising source of therapeutic and diagnostic compounds[J].Harvey Lect,1995-1996,91:47-57.
[5]红梅,余若祯,全占军,等.核酸适配子的研究进展与应用展望[J].环境与健康杂志,2008,25(6):558-560.
[6]Pan W,Clawson G A.Primer-free aptamer selection using a random DNA
library[J].Methods Mol Biol,2010,629:369-385.
[7]Fan M,McBurnett S R,Andrews C J,et al.Aptamer selection ex press:a novel method for rapid single-step selection and sensing of aptamers[J].J Biomol Tech,2008,19(5):311-319.
[8]Famulok M,Mayer G.Aptamers as tools in molecular biology and immunology[J].Curr T op Microbiol Immunol,1999,243:123-136.
[9]Zimmermann B,Bilusic I,Lorenz C,et al.Genomic SELEX:a discovery tool for genomic aptamers[J].Methods,2010,52(2):125-132.
[10]Barbas A S,White R R.T he development and testing of aptamers for cancer[J].Curr Opin Investig Drugs,2009,10(6):572-578.
[11]Ulrich H,Wrenger C.Disease-specific biomarker discovery by aptamers[J].Cytometry A,2009,75(9):727-733.
[12]Brody E N,Willis M C,Smith J D,et al.T he use of aptamers in large arrays for molecular diagnostics[J].Mol Diag n,1999,4(4):381-388.
[13]王成刚,莫志宏.核酸适体技术研究进展[J].生物医学工程学杂志,2006,23(2):463-466.
[14]董俊红,谢立苹,王振明.SELEX技术原理及应用进展[J].潍坊医学院学报,2005,27(5):358-360.
[15]张慧卿,方念,张和.适配子筛选技术[J].中国生物工程杂志,2008,28(1):113-118.
[16]罗正良,严鹏科.SELEX技术及其应用的研究进展[J].中国现代医生,2008,46(33):55-57.
[17]Sefah K,Shangguan D,Xiong X,et al.Development of DNA aptamers using Cell-SELEX[J].Nat P rotoc,2010,5(6):1169-1185.
[18]付玉荣,邱宗荫.SELEX技术及其应用研究进展[J].国外医学:病毒学分册,2005,12(3):70-72.
[19]严馨蕊,高绪文,张智清.与细胞因子特异结合的寡聚核苷酸适配子及其在诊断和治疗中的应用[J].生物工程学报,2004,20(4):627-632.
[20]张贝,部芳玉,张猑和.核酸适配子及其在肿瘤诊断与治疗中的应用[J].国际肿瘤学杂
志,2006,33(10):756-759.
[21]Horii K,Omi K,Yoshida Y,et al.Development of a sphingosylphosphory lcholine detection sy stem using RNA aptamers[J].Molecules,2010,15(8):5742-5755.
[22]Yoon S,Lee G,Han D,et al.Neutralization of infectivity of po rcine circovirus ty pe
2(PCV2)by capsid-binding 2'F-RNA aptamers[J].Antiviral Res,2010,88(1):19-24.
[23]Joshi R,Janagama H,Dwivedi H P,et al.Selection,characterization,and application of DNA aptamers for the capture and detection of Salmonella enterica serovars[J].Mol Cell Probes,2009,23(1):20-28.
[24]Gopinath S C,Kawasaki K,Kumar P K.Selection of RNA-aptamer against human influenza B virus[J].Nucleic Acids Sy mp Ser(Oxf),2005(49):85-86.
[25]李卫滨,兰小鹏,杨湘越,等.SELEX技术在筛选环孢霉素A适体中的运用[J].福州总医院学
报,2007,14(3):171-173.
[26]王立峰,魏嘉,殷海涛,等.癌胚抗原特异性寡核苷酸适配子的体外筛选及其意义[J].医学研究生学报,2007,20(9):903-907.
[27]詹林盛,孙红琰,彭剑淳,等.丙型肝炎病毒核心蛋白寡核苷酸适配子的筛选与鉴定[J].中华微生物学和免疫学杂志,2002,22(5):578-581.
[28]马占忠,秦莲花,王玉炯,等.结核分枝杆菌 ESAT-6抗原适体的筛选与亲和性分析[J].中华临床医师杂志,2007,10(1):45-48.
[29]甘龙杰,兰小鹏,江丽,等.金黄色葡萄球菌外毒素 B特异性适体的筛选及其应用[J].生物技术通讯,2010,21(2):232-235.
[30]Austin M A,T almud P J,Farin F M,et al.Association of apolipoprotein A5 variants with LDL particle size and triglyceride in Japanese Americans[J].Biochim Biophys
Acta,2004,1688(1):1-9.
[31]Ahn D G,Jeon I J,Kim J D,et al.RNA aptamer-based sensitive detection of SARS coronavirus nucleocapsid protein[J].Analy st,2009,134(9):1896-1901.
[32]Yan X R,Gao X W,Yao L H,et al.Novel methods to detect cytokines by enzyme-linked oligonucleotide assay[J].Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao,2004,20(5):679-682.
[33]Davis K A,Abrams B,Lin Y,et e of a high affinity DNA ligand in
flowcytometry[J].Nucleic Acids Res,1996,24(4):702-706.
[34]Lee M,Walt D R.A fiber-optic microarray biosensor using aptamers as receptors[J].Anal Biochem,2000,282(1):142-146.
[35]Liss M,Petersen B,Wolf H,et al.An aptamer-based quartzcry stal protein
biosensor[J].Anal Chem,2002,74(17):4488-4495.
[36]Li JJ,Fang X,Tan W.M olecular aptamer beacons for realtime protein
recognition[J].Biochem Biophys Res Commun,2002,292(1):31-40.
[37]Fang X,Sen A,Vicens M,et al.Synthetic DNA aptamers to detect protein molecular variants in a high-throughput fluorescence quenching assay[J].Chem
Biochem,2003,4(9):829-834.
[38]Bruno J G,Carrillo M P,Phillips T.Development of DNA aptamers to a foot-and-mouth disease peptide for competitive F RET-based detection[J].J Biomol Tech,2008,19(2):109-
115.
[39]Lee D,McClain W H.Aptamer redesigned tRNA is nonfunctional and deg raded in cells[J].RNA,2004,10(1):7-11.。