Western Blotting Protocol-中山大学(参考)

Western Bloting (张雪雁)
操作步骤：
1.做胶：下层胶7.5ml一块，以水或乙醇隔离空气。

待下层胶凝固后做上层胶，每块胶配置3ml，灌胶、
插梳子，赶走气泡。

2.蛋白变性：在胶凝固过程中，变性蛋白质，蛋白质的上样量按事先所测弄浓度计算准确，分装到EP
管或，按5ul/100ul样品的浓度加β—巯基乙醇，然后以PCR仪95℃变性10分钟。

3.上样、电泳：
1）上层胶为安全凝固（大约15分钟）后，两只手同时向上用力取下梳子。

以蒸馏水仔细清洗各泳道内残留得碎胶。

2）将SDS—PAGE胶转移到电泳槽中，如果只做一块胶，对面以玻璃板平衡。

1х电泳缓冲液充满电泳槽后，以玻璃棒将电泳槽中的气泡尽量赶除。

3）先以少量加有溴酚蓝1х上样缓冲液标记各泳道。

4）变性过的各管蛋白质样品以加有溴酚蓝1х上样缓冲液补齐至50ul。

蛋白Marker也补齐至50ul。

5）以一定顺序将蛋白样品和Marker，用微量移液器加至泳道。

上样过程中，手要稳，避免将泳道划破，样品自枪头打出时要缓慢，以免样品自泳道飘出。

剩余未加样的泳道以50ul上样
缓冲液平衡。

6）加样完毕，红对红，黑对黑将电泳槽和电泳仪接好，打开电源，电压调至60-100V之间。

一般来说样品在上层胶时电压可稍高，进入下层胶后较低的电压容易将个分子量蛋白粉理清
楚。

溴酚蓝自胶内跑出后电泳结束。

4.电转：
1）准备PVDF膜及滤纸。

PVDF大小8.2х5～5.5，滤纸按电转海绵大小剪，一块胶准备四张滤纸。

2）将PDVF膜置于干净的容器中，倒入适量甲醇浸泡1～3分钟，然后浸泡于电转浸泡液中。

3）小心取出两层玻璃之间的胶，切去上层胶。

在电转液中完成如下：电转孔板黑色面铺放海绵一张，依次铺放滤纸两张，胶一块，PVDF膜一张，滤纸再两张，海绵再一张，然后小心扣好
孔板，将其黑色面对黑色面扣入电转架，将电转架放入电泳槽。

电泳槽内置小冰盒一个，整
个电泳槽置于大冰盒中。

4）接好电源，按蛋白分子量大小调整电压。

一般小分子量适合低电压，大分子量适合高电压。

5.封闭：
1）电转完毕后取出PVDF膜，置于5%的脱脂奶溶液中封闭。

一小时或者4℃过夜。

2）一抗反应：将抗体以10ml 5%脱脂奶适合稀释，将PVDF膜浸入其中，置于脱色摇床上促进反应1小时。

表达丰度低的蛋白可适当加长时间，比如4℃冷库过夜。

6.回收抗体。

7.TBST液摇洗膜，15分钟х3次
8.二抗反应：相应二抗以1：2000比例稀释至10ml。

PVDF膜置于其中要洗40—50分钟。

9.TBST液洗膜，15分钟х3次
10.暗房发光洗片。

所需物品：滤纸，保鲜膜，压片盒，X光片，小镊子，1000ul移液器，枪头，配制发光液，solutionⅠ：solutionⅡ=1:1，一张膜需要2ml。

1）用纸吸干PVDF膜水分，在保鲜膜上浸泡于发光液1分钟，期间用镊子翻转几次促进均匀反应。

用纸吸干PVDF膜上剩余的发光液，裹于干净的保鲜膜里，只需一层。

2）PVDF膜平铺于压片盒，关灯，取X光片1~~2张铺与其上，扣紧压片盒。

根据需要定制曝光时间。

一般第一张1~5分钟。

将剩余X光片密封避光保存妥善。

3）取出压片盒中X光片投入自动洗片机中冲洗。

Western Bloting相关试剂：
Acrylamide / Bisacrylamide
30%(w/v) acrylamide(丙烯酰胺) (Bio-Rad 161--0101)
0.8%(w/v) methelenebisacrylamide (N-N’亚甲基双丙烯酰胺) （Gibco 155-16-024）
丙烯酰胺（Acr）29g
亚甲基双丙烯酰胺(Bic ) 1g
超纯水至100ml
37℃下溶解后，4℃brown bottle 保存，使用时恢复至室温且无沉淀。

4хLower Tris 500ml
Tris base(1.5M,m.w.121.1) 90.83g
10%SDS 20ml
超纯水至 500ml
PH to 8.8(about HCL 12ml)
4хUpper Tris, 200ml
Tris base（0.5M） 12.12g
10%SDS 8ml
超纯水至 200ml
PH to 6.8(about HCL 8ml)
10%Ammonium Persulfate(过硫酰胺，APS，10%，W/V) （Bio-Rad 161-0800）总量10ml
Ammonium Persulfate 1g
DH
0 to 10ml
2
溶解后，分装后-20℃保存，每次用一支（200ul），保存时间为一周。

Temed:
2хSample Buffer,50ml
Glycerol 10ml
20% SDS 15ml
4хUpper Tris 12.5ml
O to 50ml
H
2
1хSample Buffer
1.5ml 2 ml 3 ml 4 ml 5 ml 10 ml 20 ml 50 ml
H2O (ml) 0.675 0.9 1.35 1.8 2.25 4.5 9 22.5
2хS.B.(ml) 0.75 1 1.5 2 2.5 5 10 25
BME (ul) 75 100 150 200 250 500 1000 2500
10хRunning Buffer
4L 2L 1L Glycine(sigmaG 7526) 576g 288g 144g Tris base(GIBCOBRL 15504-038) 120g 60g 30g SDS (GIBCOBRL 15525-017) 40g 20g 10g O至相应的容量。

加dH
2
1хRunning Buffer
O按1:9比例配置，溶解后室温保存；溶液可置于4℃重复使用3次。

10х Running Buffer和dH
2
10ХTransfer Buffer
4L 2L 1L
Glycine (sigmaG 7526) 580g 290g 145g Tris base(GIBCOBRL 15504-038) 116g 58g 29g O至相应的容量。

加dH
2
1ХTransfer Buffer,2000ml
O 1400ml;
dH
2
20% methanol(甲醇) 400ml
1Х Transfer Buffer 200ml
混匀。

溶解后室温保存；溶液可置于4℃重复使用3次。

10ХTBS(PH 7.6)
4L 2L 1L
Tris 96.8g 48.4g 24.2g Nacl 320g 160g 80g
36%HCL 50～58ml
1ХTBS-T，2000ml
O 1800ml
dH
2
1ХTBS 200ml
吐温-20 2ml（或20%吐温10ml）（临时加入），混匀。

［1ХTBS缓冲液（可参考）
1mol/LTris·HCL(PH 7.5) 10ml
NaCl 8g
蒸馏水至 1000ml］
10ХPBS
4L 2L 1L Nacl 320g 160g 80g KCL 8g 4g 2g Na2HPO4 57.6g 28.8g 14.4g
KH2PO4 9.6g 4.8g 2.4g
加dH
2
O至相应的容量
［0.01mol/L PBS缓冲液(ph 7.2-7.4)（可参考）
0.2mol/L NaH
2PO
4
19ml
0.2mol/L Na
2HPO
4
81ml
蒸馏水至 2000ml］
Stripping Buffer
*加dH
2
O至相应的容量。

β-巯基乙醇在Strip前临时加入。

配置时，在通风厨内进行。

4℃保存，可重复使用1次。

（Stripping步骤：用Stripping Buffer在50℃洗膜10min,之后于室温下在TBST中洗膜3次，每次10min.封闭后开始加相应抗体）
附：其他部分试剂配制：
[母液]
1mol/LTris·HCL
Tris(MW121.14) 30.29g
蒸馏水 200ml
溶解后，用浓盐酸调PH至所需点（如下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。

PH HCL
7.4约17ml
7.5约16ml
7.6约15ml
8.0约10ml
1.74mg/ml(10mmol/l)PMSF
PMSF 0.174g;
异丙醇100ml
溶解后，分装于1.5ml离心管中，—20℃保存。

0.2mol/l NaH2PO4
NaH
2PO
4
(MW119.98) 12g
蒸馏水至 500ml 溶解后，高压灭菌，室温保存。

0.2mol/l Na2HPO4
Na
2HPO
4
·12H
2
O(MW358.14) 71.6g
蒸馏水至 1000ml 溶解后，高压灭菌，室温保存。

10%SDS
SDS 10g
蒸馏水至 100ml
50℃水浴下溶解，室温保存。

如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。

10%过硫酸胺（AP）
过硫酸胺0.1g
超纯水 1.0ml
溶解后，4℃保存，保存时间为一周。

Tris·HCL（PH8.8）
Tris（MW121.14） 15.13g
超纯水200ml
溶解后，用浓盐酸调PH至8.8，最后用超纯水定容至250ml,高温灭菌后室温下保存。

0.5mol/l Tris·HCL（PH 6.8）
Tris(MW121.14) 15.14g
超纯水 200ml
溶解后，用浓盐酸调PH至6.8，最后用超纯水定容至250ml,高温灭菌后室温下保存。

20%Tween20
Tween20 20ml
蒸馏水至 100ml
混匀后，4℃保存。

[使用液]
单去污剂裂解液（50mol/l Tris·HCL（PH 8.0），150mmol/l NaCL, 1%TritonX-100, 100ug/l PMSF）: 1mol/l Tris·HCL（PH 8.0） 2.5ml
NaCL 0.438g
TritonX-100 0.5ml
蒸馏水至 50ml
混匀后，4℃保存。

使用时，加入PMSF至终浓度为100ug/ml(0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50ul)。

G250考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用）
考马斯亮蓝G250： 100mg
95%乙醇 50ml
磷酸： 100ml
蒸馏水至 1000ml
配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存
0.15mol/l NaCl
NaCL(MW58.44) 0.877g
蒸馏水至 100ml
高温灭菌后，室温保存。

100mg/ml牛血清白蛋白（BSA）
BSA 0.1g
0.15mol/l NaCl 1ml
溶解后，-20℃保存。

制作蛋白标准曲线时，用0.15mol/l NaCL进行100倍稀释1mg/ml,，-20℃保存
还原型5XSDS 上样缓冲液
（0.25mol/l Tris•HCL（PH 6.8），0.5mmol/l 二硫叔糖醇, 10%SDS,0.5%溴酚蓝，50%甘油）
0.5mol/l Tris•HCL（PH 6.8） 2.5ml
0.5mmol/l 二硫叔糖醇 0.39g
SDS 0.5g
溴酚蓝 0.025
甘油 2.5ml
混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存
10X丽春红染液
丽春红S 2g
三氯乙酸 30g
磺基水杨酸 30g
蒸馏水至 100ml
使用时将其稀释10倍。

封闭液（含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液）
脱脂奶粉 2.5g
TBST 50ml
溶解后4℃保存。

使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。

显影液（5X）
自来水（50℃～60℃） 700ml（以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者）硫代硫酸钠 240g
亚硫酸钠（无水） 15g
冰乙酸 12.6ml
硼酸 7.5g
钾明矾 15g(水温冷至30℃以下再加入)
加水定容至1000ml，室温保存。

Western Blotting 配胶
6%Ssperation Gel 7.5% speration Gel
9%Ssperation Gel 10.5% speration Gel
12%Ssperation Gel 13.5% speration Gel
15%Ssperation Gel Stacking Gel
Stacking Gel
2ml 4ml 15ml 8ml 30ml Acry1(ml) 0.22 0.44 0.66 0.88 3.3 L.T. (ml) 0.5 1 1.5 2 7.5 H2O(ml) 1.28 2.56 3.84 5.12 19.2 APS(ul) 20 40 60 80 300 Temed(ul) 5 10 15 20 75。