黄原胶生产工艺1

黄原胶生产工艺1
黄原胶生产工艺
黄原胶是由D 一葡萄糖、D 一甘露糖、D 一葡萄糖醛酸、乙酸和丙酮酸组成“五糖重复单元”, 结构聚合体, 分子摩尔比为28 : 3 : 2 : 17: 0 .5 1 一0. 63 。

黄原胶分子一级结构由p 一1, 4 键连接的D 一葡萄糖基主链与三糖单位侧链组成, 其侧链由D 一甘露糖和D 一葡萄糖醛酸交替连接而成。

黄原胶分子侧末端含有丙酮酸, 其含量对黄原胶性能有很大影响, 在不同溶氧条件下发酵所得黄原胶, 其丙酮酸含量有明显差异。

一般,溶氧速率小, 其丙酮酸含量低
生产工艺
工艺流程为: 菌种摇瓶扩大培养发酵罐发酵提取干燥粉碎成品包装
1. 1 生产菌株
黄原胶生产菌株为黄单抱菌属几个种, 目前工业化生产用菌株主要是甘蓝黑腐病黄单孢杆菌(亦名野油菜黄单胞菌) , 直杆状,宽0. 4 林n l ~ 0. 7 林m ,有单个鞭毛, 可移动,革兰氏阴性, 好氧。

19 61 年Je an e S 等首先从甘蓝黑腐病斑中分离出甘蓝黑腐病黄单抱杆菌, 赵大建等在19 8 6 年也得到编号为N . K 一01 甘蓝黑腐病黄单抱杆菌。

此外, 菜豆黄单胞菌、锦葵黄单胞菌和胡萝卜黄单胞菌亦可作为发酵菌种。

1. 2 培养基组成及优化
1.2.1 培养基
固体培养基：蔗糖2g，蛋白胨0.5g，酵母粉0.2g，琼脂2g，水100mL。

种子培养基：蔗糖2g，蛋白胨0.5g，酵母粉0.2g，水100mL。

发酵培养液：蔗糖5g，蛋白胨0.5g，0.3g，碳酸钙0.3g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.25g，硫酸亚铁0.025g，柠檬酸0.025g，水100mL。

1.3 试验方法
1.3.1 平皿培养
取Φ9cm的培养皿，倒入25mL固体培养基，30℃培养4d~8d。

1.3.2 啤酒糟处理
啤酒糟（取自江苏食品职业技术学院啤酒实训中心）用自来水洗涤2次，烘干
后备用。

1.3.3 发酵条件研究
培养基组成的研究：分别以葡萄糖、麦芽糖、乳糖和淀粉代替发酵培养基中的碳源，进行发酵培养，并做空白对照，确定最佳的碳源。

在发酵培养基中加入0.5%氮源，即蛋白胨、酵母粉、硝酸铵、硫酸铵，乙酸铵和黄豆饼粉进行发酵培养，确定最佳的氮源。

基质含水率的研究：称取10g啤酒糟，加入10mL、15mL、20mL、30mL、40mL的液体培养基搅拌均匀，搅匀后的固态培养基转入250mL三角瓶中，121℃灭菌15min，接种后进行培养。

1.4 菌体和多糖的检测
1.4.1 平皿培养液菌体和黄原胶含量的检测在平皿培养的粘液用铲子铲起，不要刮破琼脂表面。

用蒸馏水稀释后，在25000g×条件下超速离心20min。

细胞沉淀用蒸馏水冲洗2次，70℃干燥至恒定重量。

上清液加入2倍体积的酒精，室温条件下搅拌30min，然后过滤掉酒精，再加入1倍体积的酒精搅拌过滤，得到黄原胶置于烘箱中，60℃烘干至恒重。

1.4.2 固态发酵中黄原胶含量的检测
向固态发酵物中加5倍体积的蒸馏水，250r/min振荡2h后，在4000g×条件下离心10min，然后在25000×g条件下超速离心20min。

黄原胶的沉淀干燥同1.4.1所述。

2 结果与分析
2.1 琼脂表面培养结果
在实验中，琼脂表面培养野油菜黄单胞菌被用于评估固态发酵在胞外多糖的生产上的潜力。

琼脂表面形成的粘液用于检测黄原胶和细胞的产量。

琼脂平皿上黄原胶产量随蔗糖浓度和培养时间变化见表1。

4d后细胞生长几乎完全停止，而黄原胶的产量持续增长。

高糖浓度对细胞生长和聚合物合成有明显抑制作用。

黄原胶占粘液的比例几乎是
常数，培养时间和培养基中糖浓度对其影响不大，为3%~3.5%。

这种情况表明，在饱和条件下，黄原胶分子粘液中的浓度不超过35g/L。

这可能也表明固态发酵生产黄原胶的产量。

琼脂平皿培养的pH值变化不大。

这可能就是固态发酵生产有利地方，毕竟pH值控制是不容易实现的。

2.2 碳源和氮源对黄原胶产量的影响
碳源和氮源对细菌产黄原胶影响显著，不同的碳源（包括葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖和淀粉）对黄原胶产量的影响见图1。

由图1可见，蔗糖和葡萄糖被证明是最适合生产黄原胶的碳源，考虑蔗糖为碳源时产量优于葡萄糖，选择蔗糖为碳源进行碳源浓度实验，结果见图2。

随着蔗糖浓度的增加，黄原胶产量也随之提高，蔗糖浓度为80g/L时，黄原胶的产量达43.5g/L，转化率为54.4%；但当蔗糖浓度为50g/L 时，黄原胶的产量达36.5g/L，转化率为73%。

即高浓度的蔗糖时转化率下降，选择蔗糖的浓度为50g/L。

不同氮源对黄原胶产量的影响见图3。

由图3可见，酵母粉和黄豆饼粉是最适合生产黄原胶的氮源，从工业生产角度看，黄豆饼粉比酵母粉便宜，选择黄豆饼粉为生产氮源。

此外，使用氮源进行固态发酵实验未发现酸化现象，即浸出液的pH 值为6.8~7.2，而液体深层培养过程中，pH值变化大，产量随pH值变化影响较大。

2.3 基质含水率对黄原胶产量的影响
水是发酵的主要媒质，基质含水量是决定固态发酵成功与否的关键因素之一。

由图4可见，随着基质含水率的增加，黄原胶产量也随着增加，这可能是由于随着基质含水量的增加，提高了反应体系的水活度，从而有利于营养物质的输送和菌
体的生长，提高黄原胶的产量。

但当含水量过大时，由于基质空
隙率以及颗粒表
面水膜的增厚，严重降低了菌体对氧的吸收以及二氧化碳的排出。

此外也不利于发酵热散发，进而影响菌体的生长，最终导致黄原胶产量下降。

基质含水量为75%时，黄原胶的产量最高，为35.3g/kg。

2.4 培养基厚度对黄原胶产量的影响
培养基厚度是固态发酵的重要参数之一，在圆柱形容器中加入固态发酵基质，考察培养基厚度对黄原胶产量的影响，结果见图5。

随着培养基厚度增加，黄原胶产量下降，当培养基厚度超过6cm时，黄原胶的产量急剧下降，可能由于黄单胞菌是好氧性的微生物，随着培养基厚度增加，物料间存在氧气梯度问题，微生物的生长和代谢受到阻碍，使黄原胶产量下降。

2.5 发酵时间对黄原胶产量的影响
发酵终点对提高产物的生物量有非常重要的意义在发酵过程中，产物的浓度是变
化的，一般产物高峰生产阶段时间越长，生产率也越高，但到一定时间时，产率提高减缓，甚至下降。

因此无论是获得菌体还是代谢产物，微生物发酵都有一个最佳时间阶段。

由图6可见，初期可能是黄单胞菌生长期，2d后，黄原胶的产量开始变快，到第5d时达到最大，为35.3g/kg，此后黄原胶的产量没有明显变化，因此最佳培养时间为5d。

3 结论
（1）琼脂表面培养证实固态发酵法生产黄原胶的潜力，黄原胶的产率为3%~3.5%。

（2）利用啤酒糟为基质，补充发酵培养液，可用于黄原胶的发酵生产。

以蔗糖、黄豆饼粉为原料，啤酒糟与培养液比例为1∶3时，培养厚度不超过6cm的条件下发酵5d，黄原胶的产量达到最大，为35.3 g/kg。

3.1 发酵环境控制
由于分泌出黄原胶包裹在细胞周围,妨碍营养物质运输, 影响菌种生长, 因此, 接种阶段时除应增加细胞浓度外, 还应尽量降低黄原胶产量, 这样就需多步接种( 每步接种时间必须控制在7 h 以下, 以免黄原胶生成) ,接种体积一般为反应器中料液体积5 % 一10 % , 接种次数应随发酵液体积增大而增多。

发酵温度不仅影响黄原胶产率, 还能改变产品结构组成。

研究指出, 较高温度可提高黄原胶产量,但降低产品中丙酮酸含量, 因此, 如需提高黄原胶产量, 应选择温度在31 ℃一33℃ , 而要增加丙酮酸含量就应选择温度范围在27 ℃一3 1℃。

PH 范围在中性时最适于黄原胶生产,随着产品产出,酸性基团增多, PH 降至5 左右。

研究表明, 控制反应中叫对菌体生长有利, 但对黄原胶生产没有显著影响。

4.1 黄原胶的提取
1.发酵液处理
经离心法、过滤法、酶处理法、次氯酸盐氧化法、过滤及超滤浓缩法预处理除去菌体细胞和各种不溶性杂质。

2.沉淀反应
用钙盐、铝盐、季铵盐或酸沉淀法制取工业级精制品；用有机溶剂沉淀法制取食品级精制品。

（1）钙盐法
（2）有机溶剂沉淀法
发酵液＋乙醇→黄原胶沉淀（工业级黄原胶）
酸化↓
（酒精+KOH）洗涤→干燥→粉碎→成品
离心除菌体，多次用酒精沉淀、洗涤，得食品级黄原胶。

（3）钙盐－工业酒精沉淀法
酸性乙醇
黄原胶＋CaCl2 黄原胶钙沉淀黄原胶＋Ca2+
酸化↓
成品←粉碎←干燥←洗涤（酒精+KOH）
特点：有机溶剂用量减少一半，但在成品中带入了钙离子
5.1、黄原胶的干燥
主要干燥方法
真空干燥
滚筒干燥：设备复杂，工业应用少
喷雾干燥：黄原胶溶解性差
流化床干燥：传热传质快，常用该法。

6.黄原胶发酵工艺的改进
6.1提取方法
黄原胶的提取方法,一般用醇作为沉淀剂,常用的有甲醇、异丙醇、乙醇等低级醇。

由于后提取选用乙醇,成本高,生产和应用受到限制。

非醇法生产黄原胶有效地解决了这一问题。

其工艺流程为:菌种在种子罐内经分级培养后,接种到发酵罐中,在30e条件下,通气、搅拌,发酵时为
48~60h,放罐后用稀盐酸调pH值为2,黄原胶即沉淀下来,经脱水干燥后得淡黄色成品。

但此方法对提取设备及管道提出了苛刻的要求,同时需对含盐酸废水进行处理。

6.2 发酵环境控制
研究指出,较高温度可提高黄原胶产量,但降低产品中丙酮酸含量, 因此, 如需提高黄原胶产量, 应选择温度在31 ℃一3 ℃ , 而要增加丙酮酸含量就应选择温度范围在27 ℃一3 1℃。

PH 范围在中性时最适于黄原胶生产,随着产品产出,酸性基团增多, PH 降至5 左右。

6. 3 生物反应器
配备有流化床塔式反应器, 由于其气泡转移系数较高, 在分批发酵中也有应用。

用泵式静态混合循环反应器能增加氧气在高粘度发酵液中传递速率, 从而可提高黄原胶产量〕合适搅拌浆。

通过实验证实, 圆盘涡轮式搅拌浆由于能快速破碎气泡, 而其本身不会被气泡淹没, 所以在发酵工业上使用较为合适。