‘普瑞头’百合低温解除休眠过程中鳞片部分酚类物质组分鉴定及含

‘普瑞头’百合低温解除休眠过程中鳞片部分酚类物质组分鉴定及含量变化
摘要：以亚洲百合品种‘普瑞头’为试材，研究了在5℃和0℃贮藏 1周后转入5℃的处理这两种条件下，逐渐解除休眠的‘普瑞头’中层鳞片中酚类物质及其相关酶（ PAL、PPO、POD）等生理生化指标变化。

另外，利用液相色谱鉴定了低温解除百合鳞茎休眠过程中鳞茎内的酚类物质及其含量的变化。

结果表明随着休眠的解除， POD活性、PAL活性和总酚含量下降，PPO活性升高。

百合鳞茎中主要有 6种酚类物质，通过进一步鉴定，鉴定出其中的 3种：对苯二酚、间苯二酚和邻苯二酚。

其中，对苯二酚和间苯二酚在低温处理过程中含量逐渐上升，而邻苯二酚的含量逐渐下降。

关键词：园林植物与观赏园艺；百合；鳞茎；休眠；低温；酚类物质
酚类化合物广泛分布于植物体，其含量的变化与植物组织的生长发育及代谢活动密切相关，有关酚类物质及其相关酶在植物成熟与衰老等领域的研究已十分深入[1~2]，但是在植物休眠领域的研究却很少[3~4]，对酚类物质与鳞茎休眠的关系的研究更少，并且也只涉及酚类物质含量对鳞茎休眠的影响[5,6]，尚未有对百合鳞茎内与休眠有关的酚类物质进行鉴定的研究报道。

而从20世纪50年代开始，随着国内外学者对鳞茎休眠方面的研究不断深入，普遍认为酚类化合物是影响鳞茎休眠的重要因素之一，对植物的萌发有重要的意义。

因此，系统基金项目：资助：黑龙江省教育厅科学技术研究项目：百合试管鳞茎休眠生理机制研究（11523004）和黑园林植物栽培生理及园林植物应用
1材料与方法
1.1材料以2006年十月份从辽宁凌源购买的亚洲百合杂种系‘普瑞头’中层鳞片为试验材料。

选取鳞片抱合紧密、无病虫害的独头鳞茎，冲洗干净，用50％多菌灵可湿性粉剂500倍液浸泡30 min后放入聚乙烯袋中，储藏介质为事先消毒含水量为70％的锯木屑，以保持一定湿度。

将上述经木屑保湿的鳞茎进行两种低温处理：
①放入HSX-250B型智能恒温恒湿气候箱(5±0.5)℃温度下进行贮藏。

②放在250-B型生化培养箱中0 ℃温度下冷藏1周，然后放入HSX-250B 型智能恒温恒湿气候箱(5±0.5)℃温度下进行贮藏。

处理过程中于每周取样，各处理每次取鳞茎3个，将中层鳞片充分混合，立刻进行液氮处理，放入-80℃冰箱中保存备用。

1.2方法
1.2.1总酚含量的测定采用Folin-Ciocalteau法[7]测定。

标准曲线的绘制：精确称取没食子酸标准品25 mg，用水溶解并定容到250 mL，得0.1
mg/mL的对照品标准溶液。

精密吸取对照样品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0
mL于10mL容量瓶中，再加入1 mL稀释10倍的Folin-Ciocalteau显色剂，摇
匀后再加入2 mL15％Na2CO3溶液，加水定容至10 mL，室温下反应2 h后测定
A730，绘制标准曲线。

得没食子酸含量（Y）与吸光值（X）之间的回归线性方
程Y =0.00158X +0.00084，该方程的相关系数R2=0.99886，具有良好的线性关系。

样品中总酚的提取[8]：精密称取0.5 g经过处理的百合样品，加入2 mL1％(w/v) 焦亚硫酸钠和8 mL80％乙醇进行研磨（30 s），转入10 mL离心管，4℃下静置15 min后，4000 rpm离心15 min（4℃），滤出液用于总酚含量的测定。

提取液中总酚含量的测定：精确吸取待测提取液0.05 mL于10 mL容量瓶，依次加入1mL稀释10倍的Folin-Ciocalteau显色剂及2 mL15％Na2CO3溶液并定容，反应2 h后测定吸光值，根据标准曲线计算总酚的没食子酸当量，并计
算提取得率。

1.2.2酶活性的测定（1）过氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）活性的
测定。

准确称取0.5 g经过处理的百合样品，加入5 mL预冷的0.05 mol/L
pH5.9的磷酸缓冲液，研磨成匀浆。

将匀浆全部转入10 mL离心管中，4000
rpm离心15 min（4℃）。

用于POD和PPO活性的测定。

POD活性的测定：采用愈创木酚法[9]测定。

测定的反应体系包括：
2.0 mL 0.05 mol/L的pH5.9的磷酸缓冲液；1.0 mL 2％H2O2；1.0 mL
0.05 mol/L愈创木酚和1.0 mL酶液。

反应体系加入酶液后，立即在470 nm波
长下比色，每隔12 s记录1次吸光度，共记录5次，然后以每分钟内A470变
化0.01为一个酶活性单位（U）。

PPO活性的测定：采用儿茶酚法测定[10]。

当天配制儿茶酚。

测定的反应
体系包括：
3.5 mL0.05 mol/L的pH5.9的磷酸缓冲液；1.0 mL 0.1 mol/L儿茶酚和
0.5 mL酶液。

反应体系加入酶液后，立即在410 nm波长下比色，每隔36 s记
录1次吸光度，共记录5次，然后以每分钟内A410变化0.01为一个酶活性单
位（U）。

（PAL）活性的测定。

采用巯基乙醇法[9]测定。

准确称取0.5 g经过处理
的百合样品，加入10 mL含5 mmol/L的巯基乙醇硼酸缓冲液、0.1 mL聚乙稀
吡咯烷酮（PVP）和少量石英砂在研钵中研磨。

将匀浆转入10 mL离心管中，10 000 rpm离心15 min（4℃）,上清液为酶粗提液。

上述操作均在0～4℃下进行。

测定的反应体系包括：
1.0mL 0.02 mol/L的苯丙氨酸；
2.0 mL蒸馏水和1.0 mL酶液。

对照不加
底物，多加1.0 mL蒸馏水。

反应液置恒温水浴30℃中保温0.5 h后用紫外分
光光度计在290 nm处测定吸光度。

以每小时在290 nm处吸光度变化0.01所需酶量为一单位。

1.2.3酚类物质的鉴定样品中总酚的提取：精密称取0.5 g经过处理的百
合样品，加入2 mL1％(w/v) 焦亚硫酸钠和8 mL80％乙醇进行研磨（30 s），
转入10 mL离心管，4℃下静置15 min后，4000 rpm离心15 min（4℃），上
清液经过0.45μm滤孔过滤注入HPLC系统进行分析。

鉴定仪器与条件：
HP-1100液相色谱，美国安捷伦科技公司；B-321超声波清洗机，INTRADE
公司（美国）；纯水仪，MILLIPORE公司（美国）。

HP-1100液相色谱系统用ZORBAX Eclipse XBD-C8分析柱（D 4.6×150 mm，6μm），单元泵，可见紫外检测器，手动进样器，流动相：
40%（v/v）乙醇水溶液（超声脱气）；体积流量：
0.4 mL/min；样品加入量：20 μL；检测波长：
275 nm；采样时间：
20 min。

标准品：邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚、肉桂酸、对羟基苯甲酸、苯甲酸、焦性没食子酸、香豆素、苯酚和水杨酸，分析纯或化学纯。

2 结果与分析
2.1低温处理过程中总酚含量的变化在百合鳞茎低温处理过程中总酚含量
下降，变化规律因处理温度不同而略有不同（图1）。

对于0℃贮藏1周后转入5℃的处理，总酚含量在处理的最初3周迅速下降，第4周（休眠解除时刻）略有增加，之后其含量继续下降。

对于5℃的处理，总酚含量在处理的7周内一
直呈逐渐下降的趋势。

该结果与Benkeblia结论基本一致[5]。

他在研究低温解除洋葱休眠过程中总酚含量的变化时发现总酚含量下降有利于洋葱鳞茎休眠的
解除，说明酚类物质抑制洋葱芽的萌发，是抑制鳞茎休眠解除的物质，他认为
是低温可能触发了某种能使总酚含量降低的信号，进而促进鳞茎芽萌发，而至
于这个信号的确切本质是什么还有待进一步研究。

但是孙红梅以兰州百合鳞茎
为试材所作的研究获得了不同的结果，认为酚类物质促进休眠的解除[6]。

2.2低温处理过程中过氧化物酶（POD）活性的变化两种低温处理后，鳞茎
内POD活性的变化规律基本一致（图2）。

随着休眠的解除，POD活性均降低，且均于处理的前3周内降低迅速，第4周又明显增强。

POD对解除百合鳞茎休眠的作用也是至今没有明确的说法。

但是在一些蔬
菜中却已进行了广泛的研究，普遍认为POD促进IAA氧化分解，有抑制生长的
作用。

Benkeblia也发现POD活性的降低与洋葱的萌发相一致，认为POD活性的
降低有利于鳞茎的萌发[38]。

这与本试验的结论是相同的。

2.3低温处理过程中多酚氧化酶（ PPO）活性的变化从图 3中我们可以发现，采用两种低温对‘普瑞头’处理的 7周内，随着休眠的解除， PPO活性逐渐增强。

表明， PPO活性出现逐渐升高与百合鳞茎在处理后期解除休眠开始
进入生长期可能有一定的关系。

但两种处理条件下， PPO活性增强的程度有差异。

相对于5℃的处理，0℃贮藏 1周后转入5℃的处理 PPO活性较低，活性
的变化也不明显，直到第 7周才有了较大的增强。

而5℃的处理， PPO活性在前 1周就迅速上升，并保持在较高水平，虽然在第 5周有所下降，但第 6周
至第 7周 PPO活性又快速增强到第 4周时的最大值附近。

2.4低温处理过程中苯丙氨酸解氨酶（ PAL）活性的变化由图 4可见，随
着百合鳞茎休眠的解除，鳞茎内 PAL活性的变化规律大体上是先减弱再增强（0℃贮藏 1周后转入 5℃的处理 PAL活性在第 3周降到最低值，第 4周解
除休眠时增强；5℃的处理 PAL活性在第 6周降到最低值，第 7周解除休眠时
增强）。

另外， PAL活性降低的程度比增强的程度大，这都与酚类物质的变化
规律较为相似。

这是因为高等植物酚类物质的合成是从 PAL催化的苯丙氨酸脱
氨反应开始的， PAL是形成酚类物质的关键酶和限速酶[6]。

所以当 PAL活性
下降时，就会在一定程度上限制酚类物质的合成；而 PAL活性上升时酚类物质
的合成速度就会增大，从而表现出 PAL活性与酚类物质含量变化的一致性。

因此，PAL活性下降是总酚含量下降的主要原因这一，因而是调控鳞茎休
眠的关键酶之一。

2.5酚类物质的鉴定
2.5.1低温处理过程中鳞茎内酚类物质的变化从总酚的测定结果可知，
‘普瑞头’百合中层鳞片中含有酚类物质。

根据目前的研究报道可知，植物中
酚类物质的种类有上千种，但是本文主要研究与休眠有关的酚类物质。

关于酚
类物质对植物休眠解除的生理作用至今未明确。

有报道认为酚类物质是某种植
物休眠的促进物，但是也有认为是某种植物休眠的抑制物。

这说明酚类物质是
一个很复杂的化合物，可能既存在促进休眠的种类，又包含促进萌发的种类。

为了能够清晰地认识酚类物质中那些控制休眠的具体成分，本文利用液相色谱
法对低温处理解除休眠过程中分别于 0周、4周和 7周.
2.5.2百合鳞茎内酚类物质的鉴定根据相关文献资料选用了 10种酚类物质作为对照品，用于百合鳞茎中层鳞片中的控制鳞茎休眠的酚类物质的定性分析。

结果表明，低温解除百合鳞茎休眠过程中，百合鳞茎中主要有 6种酚类物质，
保留时间分别为 3.1、3.5、4.3、4.8、6.1和 7.8 min（分别编峰号为 1～6号，表 1）。

本试验中选用的 10种酚类物质对照样品中，只有对苯二酚、间
苯二酚和邻苯二酚的峰值分别与百合鳞茎样品中的 3号峰、 4号峰和 5号峰
的保留时间相同（表 1和图 8至图 10），所以 3号峰为对苯二酚， 4号峰为间苯二酚， 5号峰为邻苯二酚。

1号峰、 2号峰和 6号峰暂时无法鉴定，有
待进一步的研究.
2.5.3低温处理过程中鳞茎内酚类物质含量的变化（1）相对含量的变化根
据 2.5.2样品分析，得出百合鳞茎样品中存在的主要的 6种酚类物质的相对含量（表2）。

从表中我们可以看出这 6种酚类物质在低温处理不同时间里，峰
面积值及峰面积百分在不断地发生着变化。

其中，只有 5号峰面积值是随处理
时间的延长而减小的，在 0周、4周和 7周时分别为 90.9、48.4和 43.8，峰面积百分比分别为 39.6％、21.1％和 19.1％。

说明，该酚的减少有助于百合
鳞茎休眠解除，是萌发抑制物。

3、4号峰与 5号峰的变化正好相反，他们均
随时间的延长而增加，因此是促进萌发的物质。

另外值得一提的是 6号峰，虽
然该酚的峰面积值很小，即该酚的含量很小，甚至在休眠期未检测到该物质，
但是在百合鳞茎休眠解除过程中其含量的增加是很明显的，第 4周的峰面积达
到 209.4，峰面积百分比由处理前的 0％急剧上升到 42.2％。

该酚的增加可能对百合鳞茎休眠的解除有一定的作用。

因此本试验表明，百合鳞茎的酚类物质中既有促进萌发的酚类，又有抑制
萌发的酚类，休眠的解除可能与两类酚类物质的协作调控有关，这需要进一步
深入地研究。

（2）绝对含量变化将对苯二酚、间苯二酚和邻苯二酚配制成 100μg/mL
的标准样品，稀释适当倍数，绘制标准曲线。

分别得对苯二酚峰面积（ Y）与
其含量值（ X）之间的回归线性方程 Y =50.214X+18.497，R2=0.9986；间苯二酚峰面积值（ Y）与其含量（ X）之间的回归线性方程 Y =33.405X+3.7143，
R2=0.9993；邻苯二酚峰面积值（Y）与其含量（X）之间的回归线性方程 Y
=18.463X+1.1526， R2=0.9987；表明均具有良好的线性关系。

将样品中对苯二酚、间苯二酚和邻苯二酚的峰面积值代入相应的方程，计算定量结果。

结果见
表 3。

由表 3可以看出，在已鉴定出的 3种酚类物质中，对苯二酚在百合鳞茎中前 4周的含量在 276.1到 279.1 μg/mL之间，到百合鳞茎休眠完全解除的第
7周时含量高达 500.8 μg/mL，呈现出一个逐渐上升的变化规律；而邻苯二酚
0周时的含量仅为 97.2 μg/mL，之后含量急剧下降，4周时其在鳞茎中的含量降为 51.2 μg/mL，第 7周更降至 46.2 μg/mL，呈现出一个逐渐下降的变化
规律。

3讨论
3.1百合鳞茎酚类物质含量与鳞茎休眠解除的关系酚类物质是植物界种类
最多，分布最广泛的次生代谢物质之一，是苯酚的衍生物。

它在植物中有着多
方面的生理功能。

国内外有关研究表明它常与某些植物激素相互作用，也能单
独发生作用，并且影响某些酶的活性 [11]。

本试验分析了‘普瑞头’百合鳞茎休眠解除过程中酚类物质含量及相关酶活性的变化动态，结果表明，总酚含
量的下降，诱导鳞茎休眠的结束，因此认为酚类物质是休眠的抑制物质。

相关
结果表明，5℃低温处理时，酚类物质含量与 PAL活性极显著正相关
（ r=0.874**），0℃贮藏 1 周后转入5℃低温处理时，酚类物质含量与 POD
活性显著正相关（ r=0.960**），因而 PAL及 POD可能是调控鳞茎休眠的关键酶之一（未发表）。

酚类物质的合成都是在水溶性酚类物质的基础上进行的。

苯丙氨酸的脱氨基是水溶性酚类物质合成的第一步， PAL是催化这一过程的关
键酶 [11]。

酚类物质容易氧化， PPO是酚类物质氧化的关键酶， POD对其氧
化也有促进作用 [12]。

因此，酚类物质的抑制途径可能是通过耗氧使百合鳞茎的顶芽萌发缺乏足够氧气，进而影响正常呼吸代谢过程 [12]。

低温可能是改变与酚类物质合成和氧化相关的酶的活性，进而影响酚类物质的合成和氧化，使
总酚含量下降，消除酚类物质对百合鳞茎休眠解除的抑制作用，使顶芽恢复正
常的呼吸代谢，最终休眠解除。

3.2百合鳞茎内与鳞茎休眠相关的主要酚类物质成分目前有关酚类物质中
对植物休眠解除起促进作用的具体成份的研究尚少，有研究表明，酚类物质对
小麦种子的休眠有显著的抑制作用，特别是其中的咖啡酸、P-香豆酸、阿魏酸、芥子酸[13]，而与百合鳞茎休眠相关的酚类物质成份至今未见报道。

本试验利
用液相色谱鉴定了低温解除百合鳞茎休眠过程中鳞茎内与休眠相关的酚类物质
的具体成份及其含量，发现百合鳞茎中主要有6种酚类物质，鉴定出其中的3种：对苯二酚、间苯二酚和邻苯二酚。

其中，对苯二酚和间苯二酚在低温处理
过程中含量逐渐上升，而邻苯二酚的含量逐渐下降，推测：对苯二酚和间苯二
酚可能是促进休眠解除的主要酚类物质，邻苯二酚可能是百合鳞茎的总酚中对
休眠解除起主要抑制作用的酚。

休眠的解除可能与两类酚类物质的协作调控有关，这需要进一步深入地研究。

酚类物质是植物体内次生代谢形成的一系列成分复杂的物质，目前已经发
现了上万种含有一个或多个酚残基的化合物。

与休眠有关的酚类物质成份可能
有更多更复杂的结构，本文只进行了初步的探索，影响休眠的酚类物质可能不
仅仅只有已经发现的这几种，有待进一步研究。

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