DNA修复基因ERCC1多态性与肺癌易感性的关系

DNA修复基因ERCC1多态性与肺癌易感性的关系
张增利;周彩存;张颉;唐亮;粟波
【摘要】背景与目的最近研究发现DNA修复基因多态性可以影响到肿瘤的易感性,因此通过不同的DNA修复基因可筛选出肿瘤的易感人群,从而有望达到肿瘤的早期预防、诊断和治疗.本研究旨在分析DNA修复基因ERCCl多态性及其与肺癌易感性的关系.方法采用病例-对照研究,收集上海肺科医院原发性肺癌患者291例为病例组,同期住院的非肿瘤患者273例作为对照组,并进行流行病学调查.应用Taqman探针结合实时荧光PCR方法分析病例组和对照组的ERCCl基因T118C 的多态性分布,比较不同基因型与肺癌易感性的关系,以及基因多态性与吸烟对肺癌的交互作用.结果在不吸烟人群中,ERCCl基因118位点3种基因型在病例组和对照组人群中分布差异有统计学意义(X2=11.19,P＜0.01).在不吸烟人群中,与携带野生纯合基因型(C/C)相比,携带突变纯合基因型(T,T)者患肺癌的风险会增加,其校正OR值为3.16(95%CI:1.29-7.73,P＜0.01).以携带野生纯合基因型(C/C)且不吸烟者作为参照,吸烟＞25包一年且携带野生纯合基因型(C/C)或杂合基因型(C/T)者患肺癌的风险均会提高,其校正OR值分别为2.62(95%CI:1.54-4.44)、2.41(95%CI: 1.36-4.26,P＜0.01).以携带野生基因型者作为参照,携带突变纯合基因型者患腺癌的风险度会增加,其OR值为2.29(95%CI: 1.05-4.78,P=0.03).结论 DNA修复基因ERCCl 118C/T多态性可能对肺癌易感性产生影响,并可能与吸烟有一定的协同作用.
【期刊名称】《中国肺癌杂志》
【年(卷),期】2008(011)002
【总页数】6页(P183-188)
【关键词】肺肿瘤;基因多态性;疾病遗传易感性
【作者】张增利;周彩存;张颉;唐亮;粟波
【作者单位】200433,上海,同济大学附属上海市肺科医院肿瘤科;200433,上海,同济大学附属上海市肺科医院肿瘤科;同济大学医学院肿瘤研究所;同济大学医学院肿瘤研究所;同济大学医学院肿瘤研究所
【正文语种】中文
【中图分类】R734.2;Q786
吸烟可能是肺癌的主要致病因素，在吸烟人群中患肺癌的风险是不吸烟者的20倍[1]。

但是只有少数的香烟暴露者发生肺癌的事实提示：即使同为吸烟者，其患肺癌的风险仍存在个体差异，有人指出这主要归于个体间DNA损伤修复能力的差异[2]。

有研究表明无论是内源性还是外源性致癌物带来的DNA损伤，DNA修复基因在修复损伤并维持基因组的稳定性过程中均发挥着重要作用[3]。

并且有关DNA 修复能力对肿瘤形成的影响的研究指出：DNA损伤能力下降将会增加机体患肺癌的危险度[2,4,5]。

目前超过130多个DNA修复基因被发现[6]，它们在不同DNA损伤修复方式中相互协作[7,8]。

主要的修复途径有核苷酸切除修复途径(nucleotide excision repair,NER)、碱基切除修复途径(base excision repair, BER)、DNA双链断裂修复途径(double-strand break repair,DSB)[9]。

其中NER是最重要也是最主要的DNA损伤修复途径，ERCC1(excision repair cross-complementing 1,ERCC1)就属于该修复途径。

有关ERCC1单核苷酸多态性与肺癌、胶质瘤、膀胱癌的关系已有报道[10-12]，但是与肺癌有关的研究不多，且多集中在欧美人群，研究结果
也不一致，因此选取了ERCC1 118多态性位点与肺癌危险性的关系进行研究。

1 材料和方法
1．1 研究对象病例组为2006年9月-2007年1月由上海市肺科医院诊断并经病理确诊的原发性肺癌患者291例，其中腺癌133例，鳞癌78例，小细胞肺癌18例，混合癌62例（腺鳞混合、大细胞癌腺癌混合、小细胞癌鳞癌混合）。

所有原发性肺癌患者在接受抽血之前均没有接受过放疗或化疗。

对照组为上海肺科医院同期住院的非肿瘤患者273例。

1．2 DNA提取和资料收集采集研究对象外周静脉血2 mL，5000 r/min离心3 min，移去上层血清。

取下层血移入离心管，加入 PBS缓冲液溶解，12000
r/min离心15 min，倒去上层，加入SDS，蛋白酶K，37 ℃摇床过夜，再用酚-氯仿抽提DNA、无水乙醇沉淀、75%乙醇洗涤，自然干燥，最后融入200 μL TE 液中。

-20 ℃冰箱保存。

在收集血样的同时询问病例组和对照组人口学资料以及吸烟史等资料。

主要变量定义：“吸烟”是指从开始吸第一支烟到收集资料时止，每天至少吸烟一次、连续一年以上[13]。

抽烟剂量：包年=每日吸烟支数÷20支×吸烟年数[14]。

1．3 ERCC1 C118T基因多态性分析
1．3．1 引物序列上游引物：5′-AAGCTGGAAAAGAC CCTGCC-3′,下游引物：5′-CTCACCTGAGGAACAGG GCA-3′。

野生型探针和突变型探针由上海生工生物工程有限公司合成。

1．3．2 实时PCR反映体系及反应条件反应体系（25 μL）含0.25 μmol/L各引物、0.02 mmol/L dNTP、1 mmol/L MgCL2、1.25 UTaq聚合酶及5×buffer,每个样品分两个管内进行,管内分别含有0.5 μmol/L野生型探针和突变型探针。

实时PCR反应条件如下：95 ℃预变性1 min、95 ℃ 5 s、60 ℃ 40 s, 50个循环后40 ℃延伸40 s。

实时荧光PCR仪Lightcycler 2.0购自德国罗氏公司。

1．3．3 结果判断实时PCR产物为289 bp。

在每条探针的两端，一端标有荧光集团FAM，另一端标有淬灭集团TAMRA。

探针是利用与靶序列特异杂交来指示扩增产物的增加，当探针与靶序列配对时，5′端荧光集团发射的荧光因与3′端淬灭剂接近而被淬灭。

在进行延伸时，DNA聚合酶的5′外切酶活性将探针切断使得荧光集团与淬灭集团分离，荧光信号被检测到。

每个样本反应分在两个管内进行，管内分别含有两种不同类型的探针，当只含有野生型探针的管内反应，荧光信号呈S 型曲线，则样本为纯合野生基因型(C/C)；反之，则为纯合突变基因型(T/T)；若两管均反应，均产生S型曲线，则为杂合基因型(T/C)。

1.3.4 ERCC1基因测序根据荧光实时PCR反应曲线所分出的三种基因型，在三种基因型中各随机选出3个样本，进行普通PCR，然后将PCR产物进行测序，测序工作由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

1．4 统计处理所有资料应用SPSS13.0进行分析。

以χ2检验比较病例组与对照组中年龄、性别、吸烟和ERCC1基因型的分布状况。

建立Logistic回归模型评价基因型与肺癌发生的关系。

以调整的比值比(odds ratios, OR)及其95%可信区间(confidence intervals, CI) 表示相对危险度。

所有统计检验均为双侧概率检验。

2 结果
2．1 病例组和对照组之间一般状况比较病例组和对照组的性别构成和年龄差异无统计学意义。

肺癌患者吸烟人数频率显著高于对照组 (62.2% vs 48.0%)（见表1）。

2．2 测序结果与实时PCR结果的比较测序结果与实时荧光PCR试验结果一致。

ERCC1密码子118三种基因型及测序图谱见图1-6（在测序图谱内小方框位置为多态性位点）。

图1、2实时荧光PCR反应曲线显示只有含野生型探针的管内产生S型反应曲线，另一管则没有，测序图谱显示在ERCC1密码子118多态性位点碱基C没有突变，只有C一个波峰，为纯合野生基因型(C/C)。

图3、4实时荧光
PCR反应曲线显示含有野生型探针和突变型探针的两管均有S型反应曲线产生(两曲线几乎重合)，测序图谱显示在ERCC1密码子118多态性位点有碱基C和T两个波峰出现，为杂合基因型(C/T)。

图5、6实时荧光PCR反应曲线显示只有含突变型探针的管内产生S型曲线，另一管则没有，测序图谱显示该多态性位点已突变为碱基T，只有T一个波峰，为纯合突变基因型(T/T)。

2．3 ERCC1各基因型与肺癌的关系根据吸烟史将研究人群分为不吸烟和吸烟两组人群，在不吸烟人群中病例组和对照组各基因型分布有差异（P＜0.01），在吸烟人群中两组中各基因型分布无统计学差异 (见表2)。

2．4 ERCC1密码子118 基因型与肺癌的关系 ERCC1密码子118基因型分为野生纯合基因型 (C/C)、杂合基因型 (C/T)、突变纯合基因型 (T/T)。

在病例组中的分布频率分别为59.45%、30.58%和9.97%；在对照组中的分布频率分别为
57.51%、36.63%和5.86%。

3种基因型在两组间的分布无统计学差异。

以野生基因型C/C作为参照，携带C/T、T/T基因型发生肺癌的调整危险度分别为1.57 (95%CI： 0.82-3.02) 和0.77 (95%CI： 0.53-1.11)(见表3)。

2．5 ERCC1密码子118与吸烟的联合作用对肺癌的影响在不吸烟人群中，与携带野生纯合基因型相比，携带突变纯合基因型者会增加患肺癌的风险，其OR值为3.16（95%CI： 1.29-7.73, P＜0.01）。

与携带野生纯合基因型且不吸烟者相比，吸烟≥25包-年人群中携带C/C、C/T 两种基因型的个体患肺癌的风险均会增加，其校正OR值分别为2.62（95%CI： 1.54-4.44）、2.41（95%CI： 1.36-4.26，P＜0.01）。

而在吸烟＜30包-年人群中基因型分布没有统计学差异 (表4)。

在分析ERCC1密码子118位点各基因型与腺癌和鳞癌的关系时发现,与携带野生纯合基因型 (C/C) 相比，携带突变纯合基因型(T/T) 者患腺癌的危险度会增加，其校正OR值为2.29(95%CI： 1.09-4.78, P=0.028) (表5)。

3 讨论
NER是人类最主要且最重要的DNA损伤修复途径，主要修复累积损伤，如嘧啶二聚体，光化合物，大的化合物急交联等。

NER包括四步：含有XPC (xeroderma pigmentosum complementation group C) 联合蛋白复合物识别DNA损伤；含有XPD(xeroderma pigmentosum complementation group D)的TFIIH (transcription factor IIH)复合物解开损伤处DNA双链；含有ERCC1和XPF(xeroderma pigmentosum complementation group F)复合物分子将损伤的DNA片断移去；然后DNA聚合酶合成新的NDA片断弥补填充空隙[15]。

NER包括很多修复基因，其中就有ERCC1。

ERCC1定位于人类染色体19q13.2-19q13.3，大小为33kb，包含有17个外显纯化的ERCC1蛋白，由633个氨基酸残基组成，是NER活性的标志性基因，也是细胞存活必须的DNA修复基因，其编码产物是297个氨基酸。

ERCC1在NER修复过程中发挥重要作用，它与
XPF/ERCC4形成异源二聚体，具有5′核酸内切酶活性，可以在损伤位点15-24个核苷酸处切开DNA单链，进而参与DNA链的切割和损伤识别。

目前有关ERCC1多态性位点与肺癌易感性关系的研究并不是太多，该修复基因主要涉及的两个多态位点是C118T，C8092A。

表 1 肺癌患者和对照组一般情况Tab 1 Characteristics of lung cancer cases and controls?
图 1 ERCC1密码子118纯合野生基因型(C/C)实时荧光PCR反应曲线Fig 1 The real time fluorescence PCR curve for homozygous genetype(C/C) of ERCC1 codon 118
图 2 ERCC1密码子118纯合野生基因型(C/C)测序图Fig 2 The sequence graph of ERCC1 codon 118 homozygous genetype(C/C)
图 3 ERCC1密码子118杂合基因型(C/T)实时荧光PCR反应曲线Fig 3 The real time fluorescence PCR curve for heterozygous genetype (C/T) of ERCC1
codon 118
图 4 ERCC1密码子118杂合基因型(C/T)测序图Fig 4 The sequence graph of ERCC1 codon 118 heterozygous genetype (C/T)
图 5 ERCC1密码子118纯合突变基因型(T/T)实时荧光PCR反应曲线Fig 5 The real time fluorescence PCR curve for homozygous genetype(T/T) of ERCC1 codon 118
图 6 ERCC1密码子118纯合突变基因型(T/T)测序图Fig 6 The sequence graph of ERCC1 codon 118 homozygous genetype(T/T)
本研究在对ERCC1 118多态性位点研究时发现，在病例组和对照组中两者的基因型分布同肺癌的风险没有显著差别。

这一点与YIN和WEI等人的研究结果相似[16,17]。

Wei等[17]在对ERCC1的两个多态性位点T118C，
C8092A研究时发现，两者和肺癌的风险之间总体上没有联系。

然而分层分析显示，对于ERCC1 C8092A多态性位点来说，和野生基因型相比，具有A等位基因人群随着吸烟程度的加大，其风险会下降。

同样的趋势也存在与ERCC1 T118C多态位点，尽管作用没有ERCC1 C8092A那么明显。

这和本研究中的结果并不相似，本研究中发现：在不吸烟人群中，与携带ERCC1 118密码子野生纯合基因型（C/C）相比，携带突变纯合基因型（T/T）者患肺癌的风险会增加；与携带野生纯合基因型（C/C）且不吸烟者相比，吸烟＞25包-年人群中携带野生纯合基因型（C/C）
或杂合基因型者患肺癌的风险均会增加，但在吸烟≤25包-年人群中没有发现类似结果。

在按病理类型分析时显示，携带ERCC1 118密码子突变纯合基因型（T/T）者与携带野生纯合基因型（C/C）相比，患腺癌的风险会大大增加。

在有关ERCC1 118位点多态性和肺癌易感性关系的报道并不很多，笔者也无法进行更多
的比较，但就是在有限的研究结果中也可以发现研究的结果也不一致。

原因可能与种族、地区差异等因素有关，也可能与样本量的多少、研究对象的选择有关。

比如，
在本研究中选取的对照组人群并不是健康人群，而是非肿瘤患者人群，这可能对研究结果造成偏倚。

表 2 ERCC1 C118T各基因型在病例组和对照组中的分布Tab 2 Distributions of the ERCC1 C118T genetypes among cases and controlsSmoking status Genetype Cases Controls χ2 value P value n n No smoking C/C 62 82 11.19 ＜0.01 C/T 29 52 T/T 19 7 Smoking C/C 111 75 0.65 0.72 C/T 60 49 T/T 10 8 表 3 ERCC1密码子118基因型在病例组和对照组中的分布Tab 3 Distributions of the ERCC1 C118T genetypes among cases and controls?
Tab 4 Stratification analysis of the ERCC1 C118T genetype frenqences in cases and controls* Adjusted for age and sex?
表 5 ERCC1密码子118各基因型与不同病理类型肺癌的关系Tab 5 Lung cancer risk related to the ERCC1 C118T polymorphism according to histological typesa： Adenocarcinoma b： squamous cell carcinomac： Control d：ORAd-Co(95%CI) and PAd-Co value for analysis between adenocarcinoma and controle： ORSCC-Co(95%CI) and PSCC-Co value for analysis between squamous cell carcinoma and controlGenetype Ad a SCC b Co c ORAd-
Co(95%CI) d PAd-Co value ORSCC-Co(95%CI) e PSCC-Co value n n n C/C 73 50 157 1.00 1.00 1.00 1.00 C/T 43 21 100 0.93(0.59-1.45) 0.74 0.66(0.37-1.64) 0.15 T/T 17 7 16 2.29(1.09-4.76) 0.03 1.37(0.54-3.53) 0.51
综上所述，在肺癌的发生过程中DNA修复基因ERCC1 T118C多态性位点可能对肺癌的易感性产生一定的影响。

同时应关注吸烟等主要环境暴露因素与相关基因可能存在的交互作用，充分考虑肿瘤多影响因素的复杂过程，为全面了解肺癌病因提供科学依据。

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